Abstract
De store utfordringene vi står overfor i kreftbehandling med paclitaxel (PTX) er stoffet motstand og alvorlige bivirkninger. Massive innsats har blitt gjort for å overvinne disse kliniske utfordringene ved å kombinere PTX med andre legemidler. I denne studien, rapporterte vi de første prekliniske data som praziquantel (PZQ), en anti-parasitt middel, kan i stor grad forbedre anticancer effekt av PTX i ulike kreftcellelinjer, inkludert PTX-resistente cellelinjer. Basert på kombinasjonen indeksverdien, demonstrerte vi at PZQ synergistisk øket PTX-indusert hemming av cellevekst. Samtidig behandling av PZQ og PTX også indusert betydelig mitotisk arrest og aktivert apoptotiske kaskade. Dessuten, PZQ kombinert med PTX resulterte i en mer utpreget hemning av tumorveksten sammenlignet med hvert legemiddel alene i en mus xenograft modell. Vi prøvde å undersøke mulige mekanismer av denne synergistisk effekt indusert av PZQ og PTX, og vi fant at co-behandling av de to legemidlene kan betydelig redusere uttrykket av X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP), en anti-apoptotiske proteiner . Våre data videre demonstrert at nedregulering av XIAP var nødvendig for den synergistiske interaksjon mellom PZQ og PTX. Sammen denne studien antydet at kombinasjonen av PZQ og PTX kan representere en ny og effektiv anticancer strategi for å optimalisere PTX terapi
Citation. Wu ZH, Lu Mk, Hu LY, Li X (2012) Praziquantel synergi Forbedrer paclitaxel Effekt å hemme veksten av kreft celler. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10,1371 /journal.pone.0051721
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 19 juli 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Utsmykkingsfondet for Fremme talenter Basic Science, Kina (J1030626) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm); Nøkkelen prosjekt Fujian Provincial Programmer for Science and Technology (2011Y0050); og The Technology Innovation Foundation of Science and Technology Bureau of Xiamen, Kina (2011S0567). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det ble en ny trend at å snu en gammel stoffet for nye bruksområder spesielt for kreftbehandling, fordi de rutinemessig brukt gamle medisiner kan ha en skjult talent eller godt potensial i håndteringen av kreft. Faktum er at alle opparbeiding har blitt gjort allerede, noe som gjør det mulig å bevege medikamentet inn i den kliniske raskere og for å redusere kostnadene for utvikling av legemidler, [1], [2]. Begrepet «nye bruksområder for gamle stoffet» gir en effektiv måte å gjenoppdage nye bruksområder for eksisterende legemidler med kjente farmakokinetikk og sikkerhetsprofil. Noen vellykkede eksempler på denne typen kreft narkotika utvikling ble tidligere rapportert som Thalidomide [3], Vitamin C [4] – [6], NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatorisk narkotika) [7] – [11]. Nylig er det blitt rapportert at artemisinin, en anti-parasitt middel, og dets derivater, hadde dyp cytotoksisitet mot kreftceller fra forskjellige tumorer [12] – [16], og gir drivkraft til å utvikle anti-parasitt midler inn i anticancer legemidler. Praziquantel (PZQ), en annen anti-parasitt middel, har vært mye brukt for å behandle forskjellige schistosomiasis med god effekt [17], [18]. Interessant nok ble det rapportert at PZQ kan forsterke den humorale og cellulære immunresponser i verten mot sykdom [19], [20]. Det ville være interessant å undersøke om PZQ har anticancer aktivitet som fortsatt er uklart så langt.
I denne studien dreper aktiviteten PZQ på kreftceller ble vurdert med ulike analyser. Vi undersøkte også effekten av kombinert behandling med PZQ og den brukte kjemoterapeutisk middel paclitaxel (PTX). PTX er et mikrotubulus-stabiliserende middel som kan fremme mikrotubuli-stabilisering, som resulterer i arrest av celler i G2 /M-fasen av cellesyklus og fører til apoptose [21], [22]. Som en av de mest brukte legemidler mot kreft, har PTX demonstrert sterk effekt mot et bredt spekter av kreftformer, inkludert bryst, hode og nakke, eggstokkreft og ikke-småcellet lungekreft, samt Kaposis sarkom [23]. Imidlertid fremveksten av klinisk resistens og bredt spekter av alvorlige bivirkninger forbli vesentlige problemer med PTX terapi [24] – [26]. Følgelig, mange nyere studier fokusert på PTX synergistisk terapi tar sikte på å finne en effektiv løsning for å overvinne PTX-resistente problem og redusere toksisitet indusert av PTX uten at legemidlets effekt [27], [28].
Her vi rapporterte at PZQ kunne synergistisk øke den veksthemmende virkning av PTX i en rekke kreftcellelinjer, inkludert PTX-resistente cellelinjer som DLD1 og H1299, selv om PZQ behandling alene ikke utøve cytotoksisitet mot disse kreftceller. PZQ kan også i stor grad forbedre PTX-indusert mitotisk arrest og apoptose. I videre studier, viste vi at dette cytotoksiske synergi mellom PZQ og PTX involvert nedregulering av XIAP. Evnen til PZQ å forsterke kreft effekter av PTX ble senere bekreftet i en mus xenograft modell. Disse resultatene gitt viktige implikasjoner for å optimalisere PTX terapi. Kombinere PZQ med PTX kan representere en ny og effektiv kreft strategi.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig tykktarmskreft cellelinje DLD-en, brystkreft cellelinje ZR-7530, lungecancer cellelinjer SPC-A-1 og Ltep-en-2 ble dyrket i RPMI 1640. human ikke-småcellet lungecancer cellelinje H1299, livmorhalskreft cellelinje HeLa og human brystcancer cellelinje Bcap37 ble opprettholdt i DMEM. Alle media ble supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (GIBCO, Carlsbad, CA), 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Alle cellelinjer ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinjer var fri for mycoplasma under testing av en PCR-basert mycoplasma test [29], [30].
Reagenser og antistoffer
Paclitaxel (PTX), roscovitine, kanin polyklonale antistoff mot Bim, Puma, og de muse-monoklonalt antistoff (mAb) mot β-actin ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Praziquantel (PZQ) ble vennlig levert av Dr. juni Lu (Nanjing Pharmaceutical fabrikken co., LTD, Nanjing, Kina). MG132 var fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). Den kaninpolyklonalt antistoff mot spaltet for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP, p89) og fosfo-histon H3 (Ser-10) (P-H3) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Kaninen polyklonale antistoff mot Noxa, Bax, bak, caspase-3, Survivin, Bcl-2 og Bcl-X
L var fra Santa Cruz (Santa Cruz, California). Musen mAb mot XIAP var fra BD Transduksjon Laboratories (San Diego, California). Geit-anti-kanin og geit anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Pierce Bioteknologi (Rockford, IL).
celleviabilitet Assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4- , 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. -Celler sådd ut i 96-brønners plater ble inkubert med angitte stoffer ved 37 ° C i forskjellige tidsperioder. Deretter ble kulturmediet fjernet, og medium inneholdende MTT (0,5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i ytterligere 2-4 timer i en CO
2 inkubator ved 37 ° C. De formazankrystaller ble oppløst i 100% DMSO og absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Hver prøve ble målt i triplikat og gjentatt tre ganger. Den relative prosentandelen overlevelse ble beregnet ved å dividere absorbansen av behandlede celler med den for kontroll i hvert forsøk. PTX og PZQ som enkle midler og i kombinasjon med de høyeste konsentrasjonene som brukes i de rapporterte eksperimenter ikke forstyrrer MTT assayreagenser i våre kontrollforsøk (data ikke vist).
Cell CycleAnalysis
for analyse av DNA-innhold og cellesyklus ved flow-cytometri ble cellene høstet, vasket en gang med PBS og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C over natten. På tidspunktet for strømningscytometri-analyse, ble cellene vasket med PBS og resuspendert i fargeløsning (100 ug /ml RNase og 100 ug /mL propidium jodid i PBS). Etter at cellene ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C i mørke, ble cellesyklusfordelingen analysert ved hjelp av en Coulter EPICS XL strømningscytometer (Beckman Coulter, Miami, FL).
Western Blot analyse
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [31]. I korthet ble cellene høstet og lysert i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid, 10 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 10 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) assay. Cellulære proteiner ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membran (Millipore, Bedford, MA). Membranene ble blokkert med TBS-Tween 20 (0,5%) som inneholdt 5% fettfri melk i 2 timer ved romtemperatur og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Etter tre vaskinger med TBS-Tween 20, ble membranene inkubert med geite-anti-kanin eller geit anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble vasket med TBS Tween-20 igjen og utviklet av forsterket kjemiluminescens (Pierce, Rockford, IL). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. De primære antistoffer ble brukt ved en fortynning 1:1000, med unntak av anti-β-aktin, som ble brukt ved en fortynning 1:5000. Den anti-kanin eller anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer ble anvendt ved en fortynning på 1:5000.
DAPI Farging
Etter behandling ble cellene dyrket i 6-brønns plater ble vasket med PBS og fiksert med 3,7% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, deretter inkubert med det fargeløsning (0,3% Triton-X-100 og 1 mg /ml DAPI i PBS) i 5 minutter unngå lys ved romtemperatur. Celler ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi (Nikon). Celler som har fragmenterte og jevnt kondenserte kjerner ble betraktet som apoptotiske celler, og apoptose ble uttrykt som en prosent beregnet fra antall celler med apoptotisk kjernemorfologi dividert med det totale antall celler ble undersøkt.
Colony Forming Assay
celler ble sådd i 6-brønners plater på 1,5 × 10
3 celler per brønn og utsatt for medikamentell behandling. Etter 10 dager ble cellene fiksert og farget med krystallfiolett (0,5% krystallfiolett og 20% metanol) i 30 minutter. Deretter ble platene vasket med destillert vann og fotografert. Kolonier som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet. Verdier for hver betingelse ble uttrykt som en prosentandel i forhold til bærer-behandlede kontroller. Hver analyse tilstand ble utført i minst tre uavhengige eksperimenter.
Immunofluorescence Farging
Cellene på objektglassene ble fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur i 10 minutter, vasket med PBS, permeabilisert med 0,2% Triton-X100 i PBS i 10 min, og deretter blokkert med 3% bovint serumalbumin i PBS ved romtemperatur i 30 min. Anti-fosfo-Histone H3 (Ser-10) (P-H3) antistoff (fortynning 1:100) ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS inneholdende 0,02% Triton X-100 og 1,5% BSA, ble objektglassene inkubert med Alexa Fluor 647-konjugert geit-anti-kanin-IgG (fortynning 1:200) i 30 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble cellene inkubert med 1 pg /ml DAPI i PBS i 5 minutter før montert i 90% glycerol og forseglet med neglelakk. Mitotisk indeks ble uttrykt som en prosentandel av P-H3-positive celler i forhold til det totale antall celler undersøkt.
Plasmider, Cell Transfeksjon og RNA interferens
XIAP-uttrykkende plasmid pcDNA3- myc-XIAP var en gave fra Dr. John C. Reed (The Burnham Institute, La Jolla, USA) og den tomme pcDNA3 ble brukt som en negativ kontroll. Cell transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
For å knockdown XIAP ble shRNA targeting XIAP sekvens (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) klonet inn i en lentiviral vektor Lenti-Lox3.7 (pLL3 0,7). En sekvens med noen tilsvarende del i det humane genom (GATCATGTAGATACGCTCA) ble anvendt som en kontroll. For produksjon av smittsomme shRNA-uttrykker lentiviruses, ble 293 T-celler transfektert med pLL3.7 lentiviral vektor sammen med emballasje vektorer pVSV-G, pRSV-Rev og pMDL gag /pol RRE. 48 timer post-transfeksjon, virusholdige supernatant media ble høstet, ført gjennom en 0,45-mikrometer filter og anvendes for å infiserte celler etter tilsetning av 10 ug /ml polybrene.
Sanntids revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Første-tråd cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av en oligo-dT primer og Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (Takara, Shiga, Japan). Sanntids-PCR ble utført på Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) og SYBR grønn (BIO-V, Xiamen, Kina) ble anvendt som en deteksjonsreagens. Primersekvensene for XIAP og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) var: XIAP (forover: 5′-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 «; omvendt: 5′-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3′), GAPDH (forover: 5»-CCACCCATGGCAAATTCC-3 «; omvendt: 5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3»). Hver prøve ble kjørt i triplikat. Dataanalyse ble utført med Rotor-Gene 6000-serien programvare 1.7 (Corbett Research, Mortlake, Australia). De relative RNA mengder ble normalisert til GAPDH mRNA.
xenograft og behandling prosedyrer
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Animal Care og bruk komité Xiamen University. Tumorceller (DLD-1, 2 x 10
6) ble injisert subkutant i atymiske nakne mus (BALB /c, 4-5 uker gammel). Når tumorvolumet nådde 25-35 mm
3, ble dyrene randomisert og overdratt til forskjellige behandlingsgrupper (n = 6 i hver gruppe). Dyrene ble injisert intraperitonealt med PZQ alene (100 mg /kg), PTX alene (30 mg /kg), eller en kombinasjon av PZQ (100 mg /kg) og PTX (30 mg /kg). PTX ble oppløst i like volumer av Cremophor EL og etanol og ytterligere fortynnet med PBS før injeksjon. PTX ble gitt på dagene 5, 9 og 13 etter tumorcelle-injeksjon. PZQ oppløst i maisolje ble gitt på dagene 5, 7, 9, 11, og 13 etter tumorcelle-injeksjon. For mono behandling, ble bilen gitt i stedet for PZQ eller PTX med samme timeplan. Tumorstørrelse ble bestemt ved hjelp av målepunktene. Tumor volum (mm
3) ble beregnet ved formelen: (a) x (b
2) × 0,5, hvor en er tumorlengde og b er tumor bredde i millimeter
Statistisk analyse.
Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. For å bestemme signifikante forskjeller i dataene, den tosidige uparede Student
t
test ble brukt. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant på P 0,05. Legemiddelinteraksjoner ble undersøkt for synergi eller antagonisme ved hjelp av median dose Effect analyse. (Calcusyn, Biosoft, Ferguson, MO)
Resultater
PZQ ikke utøve noen Cytotoksisitet på kreftcellene
cytotoksisiteten av PZQ på forskjellige tumorceller ble først undersøkt med tumorcellelinjer inkludert lungekreftceller (SPC-A-1, Ltep-a-2 og H1299), brystcancerceller (Bcap37 og ZR7530), cervical carcinom-celler (HeLa ) og tykktarmskreftceller (DLD-1). Men PZQ indusert verken veksthemming eller apoptose selv ved konsentrasjoner så høye som 100 mikrometer (Fig. S1), noe som indikerer at PZQ ikke utøve noen cytotoksisitet på kreftcellene.
The Co-behandling av PZQ og PTX synergi hemmer tumorcellevekst
neste vurdert om PZQ kunne påvirke følsomheten av tumorceller overfor kjemoterapeutiske midler, slik som paklitaxel (PTX) ved MTT-assay. Vi fant at PZQ i stor grad forbedret veksthemming ved PTX i forskjellige tumorcellelinjer inkludert to PTX-resistente cellelinjer, DLD-1 og H1299 (Fig. 1A, fig. S2). Vi gjorde det meste av våre følgende eksperimenter med disse to PTX-resistente cellelinjer. For å få ytterligere innsikt i denne kombinasjonen effekt, ble dose-responsstudier utført som viste i fig. 1B. PZQ kunne øke følsomheten av DLD-1 celler til PTX ved forskjellige konsentrasjoner av PTX og PZQ. Kolonidannelse analyse viste også at kombinasjonen av PZQ og PTX bemerkelsesverdig undertrykket kolonidannelse, sammenlignet med enten middel behandling alene (figur 1C.). Median Dose effekt analyse ble brukt for å karakterisere interaksjoner mellom PZQ og PTX i forhold til nedgang i celle levedyktighet. Kombinasjonen indeksverdier 1,0, avledet fra effekten av en rekke PZQ og PTX-konsentrasjoner i DLD-1 og H1299 cellelinjer indikerte en synergistisk effekt mellom PZQ og PTX
(A (figur 1D.). ) celle~~POS=TRUNC ble bestemt ved MTT-assay etter forskjellige kreftcellelinjer ble behandlet med PZQ alene, PTX alene eller kombinert begge medikamenter ved konsentrasjoner og tidspunkter som er angitt nedenfor: HeLa, ZR7530, DLD-1 og H1299-celler ble behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller i kombinasjon både i 48 timer; Bcap37 og SPC-A-1-cellene ble behandlet med 30 uM PZQ, 5 nM PTX alene, eller begge deler i 48 timer; Ltep-en-2-celler ble behandlet med 30 uM PZQ alene, 5 nM PTX alene, eller begge deler i 60 timer. (B) DLD-1, ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av PTX i fravær eller nærvær av 20 eller 40 uM PZQ i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved MTT-analyse. (C) DLD-1 og H1299-celler ble behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller en kombinasjon i 10 dager. Kolonier ble deretter farget med krystallfiolett og tellet. (D) DLD-1 og H1299-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PZQ og PTX på et fast forhold (2000:1) i 48 timer. Etter at cellelevedyktigheten ble bestemt i hver tilstand, ble kombinasjonen indeks (CI) beregnet som beskrevet i «Materialer og metoder». CI-verdier lt; 1,0 tyder på en synergistisk interaksjon mellom de to medikamenter. Alle verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk.
effekten av kombinasjonen av PZQ og PTX på apoptoseinduksjon
For ytterligere å bekrefte potensering av PTX-indusert celledød ved PZQ, vi analyserte celleekstrakter for ekspresjon av apoptotiske markører så som poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltningspunkter. Kombinasjonen resulterte i markert spalting av PARP i en rekke forskjellige cellelinjer, mens administrasjon av PZQ eller PTX alene ikke gjorde det (Fig. 2A), noe som indikerer betydelig aktivering av den apoptotiske kaskade av denne kombinasjonen. Dessuten ble den prosentandel av sub-populasjonen G1 bestemt ved strømningscytometri. Som vist på fig. 2B, sammenlignet med behandling med enten middel alene, ko-behandling av PZQ med PTX betydelig økt akkumulering av celler i sub-G1 fase. Vi har også bekreftet disse resultater ved nukleær farging med DAPI, en alternativ celle apoptose assay. Prosentandelen av celler med apoptotiske kjerner var signifikant høyere i kombinasjonsgruppen enn i den enkelt-behandlingsgruppen (data ikke vist). Vi undersøkte neste bidraget av caspaser til apoptose indusert ved samtidig behandling av PZQ og PTX. Som vist på fig. 2C, caspase 3 aktivering og PARP cleavage ble blokkert av bredspektret kaspaseinhibitor zVAD-FMK. Behandling med zVAD-FMK også sterkt blokkert apoptose indusert ved samtidig behandling av PZQ og PTX (fig. 2D). Disse resultatene antydet at celle apoptose indusert ved samtidig behandling av PTX og PZQ avhengig av kaspase-aktivitet.
(A) De angitte cellelinjer ble behandlet som i fig. 1A, og apoptose ble undersøkt ved Western-analyse av det spaltede PARP (cle-PARP) nivå. (B) DLD-1 og H1299-celler ble behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller en kombinasjon i 48 timer. Deretter under G1 fraksjon ble bestemt ved flow-cytometri. (C) DLD-1-cellene ble behandlet med 20 uM PZQ og 10 nM PTX i fravær eller nærvær av 20 pM kaspaseinhibitor zVAD-FMK i 48 timer, og ekspresjonen av caspase 3 og cle-PARP ble undersøkt ved Western blot. (D) Når DLD-1-cellene ble behandlet som i C, ble andelen av apoptotiske celler bestemt ved DAPI farging. Alle verdier representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk.
The Co-behandling av PZQ og PTX kan indusere mitotisk stopp i tumorceller
Flowcytometri ble brukt for å undersøke effekten av PZQ og PTX på cellesyklusfordelingen av tumorceller. Den ko-behandling av PZQ og PTX doseavhengig økning i G2 /M populasjon sammenlignet med PTX behandling alene DLD-1-celler (fig. 3A). For å klargjøre profilen til G2 /M-akkumulert celler indusert ved kombinasjonen, undersøkte vi mitotisk indeks i DLD-1-celler behandlet med PTX i fravær eller nærvær av PZQ. Som forventet, PTX behandling alene doseavhengig øket mitotisk indeks (Fig. 3B). PTX i kombinasjon med PZQ videre ført til en økning i mitotisk indeks (Fig. 3B). Vi fant også at PZQ kan dramatisk fremme PTX-mediert økning i ekspresjonen nivået av fosforylert histon H3 (Ser-10) (P-H3), en mitotisk markør (Fig. 3C). Disse resultatene antydet at PZQ forbedret PTX-indusert mitotisk stopp i tumorceller.
(A) DLD-1-celler ble behandlet med 10 nM eller 20 nM PTX i fravær eller nærvær av 20 pM PZQ i 12 timer, og cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Etter DLD-1-cellene ble behandlet som ovenfor, ble mitotisk indeks bestemt som beskrevet i «Materialer og metoder» (B), og ekspresjonsnivå av fosfo-histon H3 (Ser-10) (P-H3) ble overvåket ved hjelp av Western blot ( C). Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter.
A tidsforløpet forsøk basert på strømningscytometri viste at økningen i G2 /M populasjon foran den av sub-populasjonen G1 i DLD-1 celler behandlet med kombinasjonen av PZQ og PTX (fig. 4A), noe som indikerer vedvarende G2 /M arrest trolig ført til apoptose. Vi undersøkte om det var en sammenheng mellom mitotisk arrest og apoptose indusert av co-behandling av PZQ og PTX. En inhibitor av CDK, roscovitine, ble anvendt. Roscovitine kan selektivt inhibere CDK1, CDK2 og cdk5 og blokk cellesyklusprogresjon ved å forhindre celler fra å komme inn S- og M fasene [32]. Som vist på fig. 4B, hemmet roscovitine nesten fullstendig G2 /M arrest indusert ved samtidig behandling av PZQ og PTX i DLD-1-celler. Økningen i den mitotiske indeksen resulterte fra den ko-behandling av PZQ og PTX også tilbake til kontrollnivået etter tilsetning av roscovitine (fig. 4C), som indikerer at roscovitine inhiberte mitotisk stopp indusert av denne kombinasjonen. Påfallende, roscovitine også hemmet PZQ forbedret PTX-mediert apoptose nesten helt, som bestemmes av apoptotisk sub-G1 befolkningen og Vest analyse av spaltet PARP (fig. 4D og E). Lignende resultater ble oppnådd med H1299-celler (data ikke vist). Disse data antydet at økt apoptose indusert ved samtidig behandling av PZQ og PTX sannsynlig et resultat av økt mitotisk stopp indusert av denne co-behandling.
(A) Etter DLD-1-celler ble ko-behandlet med 20 pM PZQ og 10 nM PTX for angitte tidspunkter, G2 /M og under G1 fraksjoner ble bestemt ved flow-cytometri. (B) DLD-1-cellene ble behandlet med en kombinasjon av PZQ (20 uM) og PTX (10 nM) med eller uten 12.5 uM roscovitine i 12 timer, og deretter cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri. (C) DLD-1-cellene ble behandlet som i (B), og mitotisk indeks ble bestemt. Etter DLD-1 ble behandlet med en kombinasjon av PZQ (20 uM) og PTX (10 nM) i nærvær eller fravær av 12,5 pM roscovitine i 48 timer, ble Apoptose bestemt ved strømningscytometri-analyse av under G1 populasjon (D) og Western analyse av cle-PARP nivå (E). Alle verdier er vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk.
The Co-behandling av PZQ og PTX kunne Down-regulere XIAP Protein
For å vurdere den underliggende mekanismen for synergistisk cytotoksisitet mellom PZQ og PTX, vurderte vi effektene av de to midlene, enten alene eller i kombinasjon, på forskjellige apoptose regulatoriske proteiner i DLD-1-celler. Som vist på fig. 5A, behandling med PZQ eller PTX alene forandret ikke uttrykk for XIAP. Imidlertid eksponering av celler til kombinasjonen av PZQ og PTX resulterte i en bemerkelsesverdig reduksjon i nivået av XIAP. Ingen vesentlige endringer i uttrykket av andre proteiner, slik som Bcl-X
L, overlevende, Puma, Bim, Noxa, Bax og Bak, ble observert i celler eksponert for PTX alene, PZQ alene, eller en kombinasjon.
(A) DLD-1-cellene ble behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller en kombinasjon i 24 timer. Deretter uttrykk for BCL-XL, Bcl-2, Survivin, XIAP, Bim, Puma, Noxa, Bax og Bak ble overvåket av Western blot. (B) Etter eksponering av DLD-1 celler til en blanding av 20 uM PZQ og 10 nM PTX i nærvær eller fravær av 20 pM zVAD-FMK i 24 timer, ble ekspresjon av XIAP bestemt ved Western blot. (C) H1299-celler ble behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller en kombinasjon i 24 timer, hvoretter ekspresjon av XIAP ble undersøkt. (D) Når DLD-1-cellene ble behandlet som i (A), total-RNA ble isolert og XIAP mRNA ble kvantifisert ved sanntids RT-PCR. Etter normalisering til GAPDH mRNA, de XIAP mRNA-ekspresjon verdier for hver betingelse var i forhold til bærer-behandlede kontrollceller. (E) DLD-1-cellene ble behandlet med en kombinasjon av 20 uM PZQ og 10 nM PTX i fravær eller nærvær av 10 pM MG132 i 24 timer, og deretter ekspresjon av XIAP ble målt ved Western blot. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter.
For å bestemme om forandringer i ekspresjon av XIAP var avhengig av kaspase-aktivering, vi behandlet DLD-1 celler med medikamentkombinasjonen i nærvær eller fravær av caspase inhibitor zVAD-FMK. Som vist på fig. 5B, zVAD-FMK hadde liten effekt på nedregulering av XIAP indusert ved en kombinasjon av PZQ og PTX, noe som indikerer at endringer i ekspresjon av XIAP var kaspase-uavhengig. Nedregulering av XIAP ble også observert i H1299-celler ko-behandlet med PZQ og PTX (fig. 5C), hvilket antyder at modulering av dette protein er ikke-cellelinje bestemt.
vi forsøkt å identifisere om mekanismen som XIAP ble nedregulert i respons til co-behandling av PZQ og PTX. For å undersøke om co-behandling av PZQ og PTX kunne regulere XIAP uttrykk på transkripsjonsnivået, brukte vi revers transkripsjon-PCR. Sammenlignet med kontrollgruppen, ble kombinert behandling med PZQ og PTX ikke føre til betydelige endringer i mRNA nivåene av XIAP (fig. 5D).
En annen mulig forklaring for XIAP nedregulering kan være nedbrytning av XIAP etter proteasome. For å teste denne hypotese, behandlet vi DLD-1-celler med medikamentkombinasjonen i nærvær av en proteasominhibitor, MG132. Undertrykkelse av XIAP i DLD-1-celler behandlet med kombinasjonen av PZQ og PTX ble nesten fullstendig fjernet ved MG132 (fig. 5E). Resultatene indikerte at PZQ og PTX kan indusere XIAP degradering via proteasome-mediert veien.
XIAP spiller en viktig rolle i Synergistic Cytotoksisitet av PZQ og PTX
Basert på ovennevnte resultater, vi undersøkt hvorvidt nedregulering av XIAP faktisk mediert celledød indusert ved en kombinasjon av PZQ og PTX. Vi transient transfektert DLD-1-celler med et plasmid inneholdende epitop-tagget XIAP (myc-XIAP) og et tomt plasmid som tjente som en kontroll. Transfeksjon ble bekreftet ved Western blot (Fig. 6A). Overekspresjon av XIAP i DLD-1-celler i betydelig grad dempede PZQ-forbedret PTX-indusert cytotoksisitet, som bestemt ved analyse av cellenes levedyktighet og sub-populasjon G1 (fig. 6B og C).
(A) Western blot viste XIAP ekspresjon i DLD-1-celler ved 24 timer etter transfeksjon med pcDNA3-myc-XIAP eller kontrollvektor. (B) 24 timer etter transfeksjon med pcDNA3-myc-XIAP og kontroll vektor, ble DLD-1-celler behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene eller en kombinasjon i 48 timer, og deretter cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay. (C) 24 timer etter transfeksjon med pcDNA3-myc-XIAP og kontroll vektor, ble DLD-1-celler behandlet med en kombinasjon av 20 uM PZQ og 10 nM PTX. Deretter under G1 fraksjon ble bestemt ved flow-cytometri. (D) DLD-1-cellene ble infisert med en lentivirus som koder for kontroll shRNA eller XIAP shRNA i 48 timer, og ekspresjon av XIAP ble analysert ved hjelp av Western blot. (E) DLD-1-cellene ble infisert med en lentivirus som koder for kontroll shRNA eller XIAP shRNA i 48 timer, og deretter behandlet med 20 uM PZQ alene, 10 nM PTX alene eller en kombinasjon i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Alle verdier er vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk.
For å studere rollen XIAP i synergien mellom PZQ og PTX videre, vi brukte lentivirus-mediert kort hårnål RNA (shRNA) til knockdown XIAP i DLD-1 celler. Cellene ble høstet etter 48 timer etter infeksjon, og XIAP ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot. Sammenlignet med DLD-1-celler infisert med kontroll shRNA, vises celler infisert med XIAP shRNA drastisk undertrykket XIAP uttrykket (fig. 6D). Vi vurderte neste effekten av XIAP knockdown på celle levedyktighet. Som vist på fig. 6E, blokkerer ekspresjon av XIAP hadde ingen effekt på følsomheten av DLD-1 celler til PZQ behandling. Men XIAP knockdown betydelig sensibilisert DLD-1 celler til PTX-indusert cytotoksisitet (Fig. 6E). Videre cytotoksisitet indusert ved samtidig behandling av PZQ og PTX ble også forbedret i XIAP-knockdown DLD-1-celler (fig. 6E). Disse dataene antyder at XIAP spiller en viktig rolle som formidler den synergis cytotoksisitet forårsaket av co-behandling av PZQ og PTX.
Kombinasjonen av PZQ og PTX Undertrykker tumorvekst
in vivo
for å teste om co-behandling av PZQ og PTX har noen effekt på tumorvekst
in vivo
, vi etablert en xenograft modell i naken mus med PTX-resistente DLD-1 celler. Injisert subkutant DLD-1 celler ga opphav til eksponentielt voksende tumorer i atymiske nakne mus (Fig. 7A). Kombinert behandling med PZQ og PTX sterkt undertrykket tumorvekst i forhold til PTX behandling alene, mens PZQ administreres alene var ikke i stand til å hemme tumorvekst i DLD-1 xenograft-bærende mus (Fig. 7A og B). Sammenlignet med kontrollgruppen, ved behandling med PZQ og PTX kombinasjon resulterte i en 50% reduksjon i tumorvekt (figur 7C.).
