Abstract
G503 er en anthraquinone sammensatte isolert fra de sekundære metabolitter av en mangrove endophytic sopp fra Sør-Kinahavet. Den foreliggende studien belyser den anti-tumor-aktivitet og den underliggende mekanisme av G503. Celleviabilitet analysen ble utført i ni cancercellelinjer og to normale cellelinjer viste at magekreft cellelinje SGC7901 er de G503-sensitive kreftceller. G503 indusert SGC7901 celledød via apoptose. G503 eksponerings aktivert caspases-3, -8 og -9. Forbehandling med pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK og caspase-9-hemmer Z-LEHD-FMK, men ikke caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, svekket effekten av G503. Disse resultatene antydet at den indre mitokondrie apoptose vei, snarere enn den ytre vei, var involvert i G503-indusert apoptose. Videre økte G503 forholdet mellom Bax til Bcl-2 i mitokondriene og minsket forholdet i cytosol. G503 behandling resulterte i mitokondrie depolarisering, cytokrom c frigivelse og den etterfølgende spaltning av caspase -9 og -3. Videre er det rapportert at det endoplasmatiske retikulum apoptose sti kan også aktiveres ved G503 ved å fremkalle Capase-4 cleavage. I betraktning av den nedre 50% hemmende konsentrasjon for mage kreftceller, kan G503 tjene som en lovende kandidat for magekreft kjemoterapi
Citation. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Antrakinon G503 induserer apoptose i Gastric kreftceller gjennom mitokondrie Pathway. PLoS ONE ni (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 19 april 2014; Godkjent: 19 august 2014; Publisert: 30.09.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne studien ble støttet av National Nature Science Foundation of China, Grant Nummer:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706, National Key Sci-Tech spesielt prosjekt i Kina, Grant Nummer: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Program for doktorgrads Station i University, Grant Nummer: 20120171110053, 20130171110053; Key Prosjekt of Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina, Grant Antall Nature: 10251008901000009; Key Sci-Tech Research Project i Guangdong-provinsen, Kina, Grant Nummer: 2011B031200006; Guandong Natural Science Fund, Grant Nummer: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-Tech Research Project of Guangzhou kommune, Kina, Grant Nummer: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Program for Young Lærer i University, Grant Nummer: 10YKPY28; Changjiang Forskere og Innovativ Research Team i Universitets, antall:. 985 prosjekt PCSIRT 0947. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: The forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi er de primære kliniske kreftbehandlinger. Men, kirurgi og strålebehandling er ineffektive i metastatisk kreft; Hvis kjemoterapi brukes riktig, kan metastase hemmes [1]. Med hensyn til anti-kreft legemiddel utvikling, antracykliner har de mest effektive anti-cancer medikamenter [2]. Naturlige produkter fra havet er viktige kilder til nye kreftmedisiner [3]. Marine mikroorganismer metabolitter med unike strukturer og farmakologiske aktiviteter er vanligvis brukt som fører antitumorforbindelsene [4]. Antrakinon-forbindelser, så som daunorubicin, doksorubicin, epirubicin og mitoksantron, er de mest effektive klinisk anti-kreft legemidler [2]. Den marine antrakinon SZ-685C undertrykker proliferasjon av human brystcancer [5] – [6] og human nasofaryngeal carcinom (NPC) celler [7]. Huang et al. vist at antrakinoner fra rabarbra, slik som emodin, aloe-emodin og rhein, hemmer veksten og proliferasjonen av forskjellige kreftceller, for eksempel lunge adenokarsinom, myelogen leukemi, neuroblastom, leverkreft, blærekreft og andre [8].
mekanismen for antitumoraktivitet av antrakinoner er først og fremst involvert i følgende aspekter [9] – [10]: DNA-interaksjoner gjennom binding, interkalerende og forstyrrer separering av DNA-dobbeltkjede; direkte membran effekter; DNA-skade som følge av topoisomerase II-inhibering eller generering av frie radikaler, slik som reaktive oksygenarter (ROS) og induksjon av apoptose via topoisomerase II-hemning, funksjonell p53 eller ROS generasjon. I tillegg antrakinoner også utløse apoptose gjennom JNK (c-Jun N-terminal kinase) [11], Akt /PKB (proteinkinase B) [5], [12] og mitokondrielle trasé [13] -. [14]
G503 er en anthraquinone sammensatte isolert fra de sekundære metabolitter av mangrove endophytic sopp nr 1403 fra Sør-Kinahavet [15] .Men om G503 besitter kreft potensial som anthraquinone forbindelsen har ikke blitt undersøkt. Derfor denne studien var designet for å belyse den anti-tumor aktivitet av G503 og den underliggende mekanismen involvert.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
3- (4 , 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium-bromid (MTT) og ROS scavenger N-acetyl-cystein (NAC) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, karboksy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit og MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) ble oppnådd fra Invitrogen (USA). Annexin V-FITC (fluoresceinisotiocyanat) /PI (propidiumjodid-) Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kina). RPMI1640 medium og fosterets bovint serum (FBS) var fra Hyclon (Logan, UT, USA
).
Caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK, caspase-9-hemmer Z-LEHD-FMK og caspase-familien inhibitor Z-VAD-FMK var fra Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) og Beyotime (CHINA). Antistoffer mot caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 og COXIV antistoff var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antistoffer mot cytokrom
c
, Bax, BCL-2, p38, p-p38 og anti-geit LGG-HRP var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Mouse anti-β-aktin og anti-GAPDH primære antibodywere fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Anti-kanin IgG-peroksidase og anti-mus IgG-peroksydase var fra Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria isolasjonssett ble kjøpt fra Pierce (Pierce, IL, USA), proteinanalysesett ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules , CA, USA), og ECL deteksjon kit var fra Applygen Technologies Inc (Beijing, Kina).
gjæring, utvinning og isolering av G503 fra
Nigrospora
sp. No. 1403
NO.1403 ble isolert fra råtten tre av
Kandeliacandel product: (L.) Druce og reidentified som
Nigrospora
sp. (Genebank sjonsnummer: HQ891110), samlet inn fra Mai Po, Hong Kong, og en saltsjø i Bahamas. G503 ble isolert og renset fra de sekundære metabolitter av NO. 1403 [15]. Startkulturer ble opprettholdt på cornmeal sjøvann agar. Plugger av agar som støtter mycelvekst ble kuttet og overført aseptisk til en 250 mL Erlenmeyerkolbe inneholdende 100 ml flytende medium (glukose 10 g /l pepton 2 g /l, gjærekstrakt 1 g /l, NaCI
2 g /L, pH 7,0 d). Kolben ble inkubert ved 28 ° C. Etter rysting på en rotasjonsrister i 3-5 dager, ble mycel aseptisk overført til en 500 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende kulturmedium (200 ml). Kolben ble deretter inkubert ved 28 ° C i 25 dager.
kulturer (150 L) ble filtrert gjennom osteklede. Filtratet ble konsentrert til 5 l under 50 ° C og ekstrahert tre ganger ved risting med et likt volum av etylacetat. De samlede organiske ekstrakter ble underkastet en silikagel-kolonne og eluert med en gradient av petroleter til etylacetat for å gi forbindelsen.
Forbindelsen ble løst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en konsentrasjon på lager 50 mmol /l og fortynnet til bestemte konsentrasjoner før bruk
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
HUVECs ble isolert fra de humane umbilikalvene snorer av normale parturitions og dyrket følge en protokoll som er beskrevet tidligere [16] -. [ ,,,0],17]. Chang leverceller og tumorcellelinjer Hone-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901, AGS ble opprettholdt ved vårt laboratorium og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (Gibco) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Denne studien er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen, godkjent av Medical Ethics Committee of Sun Yat-Sen universitetet og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra donor.
Celleviabilitet analysen
celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /ml i 24-brønners plater (HUVECs ble sådd i gelatin-belagte 24-brønners plater). Når cellene oppnådde en tetthet på 60% -70%, ble de behandlet med forskjellige konsentrasjoner av G503 i 48 timer i RPMI 1640 medium (1 ml /brønn) uten FBS; de negative kontrollgruppene ble behandlet med PBS. Deretter ble 100 ul MTT (5 mg /ml) oppløst i PBS tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 4 timer for å tillate dannelse av formazancrystals. Krystallene ble oppløst i 1 ml DMSO i hver brønn. Den optiske tetthet (OD) verdier av den lilla løsning som representerte cellelevedyktighet ble målt ved 570 nm [18] – [19]. Etter tre uavhengige eksperimenter, ble celleoverlevelse beregnet ved hjelp av følgende formel: overlevelse (%) = (midlere OD eksperimentell verdi /bety kontroll OD verdien) x 100%. Verdiene ble uttrykt som den 50% hemmende konsentrasjon (IC
50), som ble beregnet ved regresjon fremgangsmåten i det lineære området.
Hoechst 33342 fargingsanalyse
SGC7901 celler ble platet i 6-brønns plater ved en tetthet på 10
5 celler per brønn og behandlet med G503 konsentrasjoner i området fra 0 ^ mol /L til 40 pmol /l i 24 timer. Cellene ble merket med 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] i 10 minutter ved 37 ° C og observert ved hjelp av fluorescensmikroskopi (Olympus X71-A12FL /PH).
Annexin V-FITC /PI farging assay
SGC7901 celler ble samlet opp ved en tetthet på 5 x 10
5 til 5 x 10
6 /ml etter G503 behandling ved konsentrasjoner i området fra 0 ^ mol /L til 40 pmol /l i 24 timer i 6-brønners plater; celler behandlet med 25 umol /L kolkisin ble anvendt som positiv kontroll. Cellene ble deretter vasket og farget i henhold til produsentens instruksjoner (Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit). I korthet ble cellene resuspendert i 500 pl 1 x bindingsbuffer. Deretter ble 5 ul AnnexinV-FITC og 5 ul 20 ug /ml PI tilsatt til prøve og inkubert ved værelsestemperatur i 15 min i mørket. De fargede Prøvene ble deretter vurdert av flowcytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) for å identifisere apoptotiske celler.
Fastsettelse av mitokondriell membranpotensiale
SGC7901 celler ble sådd ut i 6-brønners plater. Ved å oppnå en tetthet på 60%, ble cellene behandlet med 20 umol /L G503 i 18 timer og deretter oppsamlet for å vurdere mitokondriemembranpotensialet i henhold til produsentens anbefalinger (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). I korthet, ble 1 x 10
6 /ml celler ble resuspendert i 37 ° C PBS. De positive kontrollgrupper ble forbehandlet med 1 pl 50 mmol /L CCCP ved 37 ° C i 5 minutter. Alle gruppene ble deretter behandlet med 5 ul av 10 umol /l DiOC
2 (3) i 30 minutter ved 37 ° C og evaluert ved flow cytometri. Den mitokondriemembranen potensialet ble beregnet på grunnlag av følgende ligning:. Mitokondriemembranpotensiale = (rød fluorescens intensitet) /(grønn fluorescens intensitet)
Deteksjon åpningen av mitokondrier Permeabilitet Transition Pore (MPTP)
SGC7901 celler ble sådd ut i 6-brønns plater. Ved å oppnå en tetthet på 60%, ble cellene behandlet med 20μmol /l G503 i 18 timer og oppsamlet for å vurdere MPTP åpning ved strømningscytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). Kort beskrevet, ble hver prøve delt i 3 porsjoner og behandlet som følger: aliquot 1 ble behandlet med 5 pl 2 umol /L Calcein AM i mørket; delmengde to ble behandlet med 5 mL Calcein AM og 5 pl 80 mmol /L CoCl
2 i mørket; og aliquot 3 ble behandlet med 5 ul Calcein AM, 5 ul CoCl
2 og 5 pl 100 umol /L ionomycin. Alikvotene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 15 minutter i mørket. Etter å ha blitt vasket med HBSS /Ca
2+ og re-suspendert i 400 mL HBSS /Ca
2+, cellene ble bestemt ved flowcytometri innen 1 time. MPTP åpning tilstand er beregnet som følger: (fluorescens av aliquot 2- fluorescensen av alikvoten 3) /(fluorescensen av alikvoten 1- fluorescensen av alikvot 3). Calcein AM penetrerer cytoplasma og organeller inkludert mitokondriene. CoCl
2 slukker Calcein AM fluorescens i cytoplasma, men ikke i mitokondriene. Calcein AM translocates til cytoplasma fra mitokondrier når MPTP er åpnet, og den fluorescens blir dempet av CoCl
2.
Isolering av celle mitokondrier og cytoplasma
SGC7901 celler ble sådd ut i 100 mm-plater; hver gruppe ble belagt i to plater. Etter å ha oppnådd 60% -70% konfluens, ble cellene behandlet med eller uten 20 umol /L G503 i 18 timer. Etter behandling ble mitokondrie og cytoplasmatiske fraksjoner oppnådd i henhold til produsentens instruksjoner (Mitokondrier isolasjon kit).
Western blotting-analyse
Som beskrevet tidligere, ble cellene lysert i RIPA buffer [21] . Proteinkonsentrasjonene i mitokondriene, cytoplasma og hel-celle ble detektert ved BCA-metoden ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse kit. I alt ble 60 ug proteiner fra hver gruppe adskilt med 12% eller 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). De proteiner fra SDS-PAGE ble overført til en PVDF-membran. Etter at de ikke-spesifikke bindingsseter på membranene ble blokkert i 1-2 timer ved romtemperatur med TBST-buffer inneholdende 10% ikke-fettholdig melk, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff i henhold til produsentens instruksjoner. De sekundære antistoffer med eller uten fluorescens konjugert til de aktuelle primære antistoffer ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Membranene med fluorescerende sekundære antistoffer ble vurdert ved hjelp av Odyssey system (Li-COR, Nebraska, USA) for å skanne fluorescerende band [22], og membranene med normale sekundære antistoffer ble visualisert ved hjelp av ECL deteksjon kit for immunoblotter. Membranene ble strippet og re-probet med β-aktin eller COXIV antistoffer. β-aktin ble benyttet som intern standard for den totale cellelysat og cytoplasmiske ekstraksjoner, mens COXIV ble brukt som kontroll for mitokondrie ekstraksjoner. Densitometrisk analyse av båndene ble utført ved hjelp Antall One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].
Statistisk analyse
Alle data ble presentert som betyr ± SD minst tre eksemplarer bestemmelser . SPSS 13,0 programvare ble benyttet for t-test og enveis variansanalyse (ANOVA) i alle statistiske analyser. En
P
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i alle tilfeller.
Resultater
G503-mediert hemming på spredning er den mest potente i SGC7901 celler blant de 11 cellelinjer undersøkt
Vi brukte MTT analyse for å bestemme hvorvidt den antrakinon-forbindelsen G503 er cytotoksisk i de følgende cellelinjer: to normale cellelinjer (human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) og Chang leverceller og ni tumorcellelinjer (HONE -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901). Alle celler ble inkubert med 0, 2,5, 5, 10, 20 eller 40 umol /L G503 i 48 timer. Celle viabilities ble målt ved anvendelse av MTT-analysen som nevnt, og IC
50 verdi for SGC7901 celler var den laveste, mens IC
50 verdiene for de normale cellelinjer, HUVEC og Chang leverceller, var signifikant høyere enn SGC7901 ( Tabell 1).
G503 induserer apoptose i SGC7901 og AGS mage kreftceller
Gitt at SGC7901 cellelinjen var den mest følsomme for G503 av de elleve cellelinjer
undersøkt (tabell 1 ), vi videre undersøkt denne cellelinjen separat. SGC7901-celler ble farget med Hoechst 33342 for å bestemme hvorvidt den hemmende effekten var knyttet til apoptose. Resultatene viser en økning i antall celler som viser atom krymping og kromatin kondensasjon med økende G503 konsentrasjoner (Figur 1a). I tillegg, for å undersøke hvorvidt G503 induserer apoptose i andre gastrisk cancer cellelinjer, ble AGS magekreftceller også undersøkt. Annexin V /PI farging ble anvendt for å analysere virkningene av G503 i SGC7901 og AGS magecancerceller ved strømningscytometri. For disse forsøk ble 25 umol /L kolkisin anvendt som positiv kontroll. Etter behandling med 0 umol /L, 2,5 umol /l, 5 umol /L, 10 pmol /L, 20 pmol /l og 40 pmol /L G503 og 25 umol /L colchicines i 24 timer, andelen av apoptotiske SGC7901 cellene 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55% 31,03 ± 1,03% og 20,69% ± 1,91%, henholdsvis (figur 1B); prosenten av apoptotiske AGS celler var henholdsvis 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% og 31,49% ± 2,45%, (figur 1C). Påvisningen av apoptose i AGS-celler og de ovenfor angitte resultater indikerer at G503 induserer magekreft celle apoptose i en doseavhengig måte.
(A) SGC7901 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner G503 (0-40 umol /L ) i 24 timer og farget med Hoechst 33342. Røde piler indikerer de apoptotiske celler. (B), (C) SGC7901-celler (B) og AGS-celler (C) ble analysert ved flow-cytometri etter behandling med forskjellige G503 concentrations- i 24 timer. For kvantitativ analyse av G503-indusert SGC7901 og AGS celle apoptose, blir alle data presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * Og ** representere
P
0,05 og
P
. 0,01, henholdsvis
G503 induserer apoptose i en caspase-avhengig måte
For ytterligere å undersøke mekanismen involvert i G503-indusert apoptose i magekreftceller, studerte vi SGC7901 celler. Caspase-3 er en effektor caspase som kan gå inn kjernen og direkte kontakt med underlaget, og dermed fremme celle apoptose [24]. Caspse-9 er initiativtaker caspase som aktiverer caspse-3 [25]. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner G503 for angitte tidspunkter og oppsamlet for å vurdere caspase-3 og -9 ved Western blotting. Ekspresjon av caspase-3-forløper ble redusert i en dose- og tidsavhengig måte, mens caspase-3 spaltningssetene fragmenter øket i en dose- og tidsavhengig måte (figur 2A, B). Ekspresjon av caspase-9 forløper også redusert, og spaltningssetene fragmentene økt etter at cellene ble behandlet med 20 umol /L G503 i 24 timer (Figur 2C). Disse effektene blir opphevet ved den pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (figur 2C, D). I samsvar med aktivering av caspase-9 og -3, de apoptotiske celler priser indusert indusert av 20 mikromol /L G503 i SGC7901 celler ble betydelig redusert etter forbehandling med Z-VAD-FMK (figur 2E). Disse data antydet at G503 induserer apoptose i SGC7901 celler i et caspase-avhengig måte.
(A), (B) Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner G503 i 24 timer (A) og behandlet med 20 umol /L G503 for ulike tidspunkt (B). Alle Celluar proteiner ble ekstrahert og caspase-3-proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. (C) – (E) Celler ble pre-inkubert med Z-VAD-FMK i 30 minutter før behandling med 20μmol /l G503 i 24 timer. Alle Celluar proteiner ble ekstrahert og caspase-9 (C), -3 (D) proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. De cellulære apoptotiske Hastighetene ble bestemt ved strømningscytometri (E). Alle verdier vises som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige forsøk (*
P
0,05, **
P
0,01 vs. kontroll).
G503-indusert apoptose er ikke avhengig av caspase-8
for å undersøke om dødsfallet reseptor-mediert apoptotiske sti er indusert av G503, vi studerte caspase-8, initiativtaker caspase død reseptor mediert apoptotisk vei [26]. SGC7901 celler ble behandlet med forskjellige doser av G503 for angitte tidspunkter. Cellene ble samlet opp for å måle caspase-8 ved Western blotting. Resultatene indikerte at caspase-8-forløper ble redusert og spaltet caspase-8 økte på en tids- og doseavhengig måte (figur 3A, B). Cellene ble forbehandlet med 20 umol /L caspase-8-inhibitor Z-IETD-FMK i 30 min og deretter behandlet med 20μmol /l G503 i 24 timer. Caspase-8 proform øket i celler co-behandlet med caspase-8-inhibitor og G503, sammenlignet med celler behandlet med G503 bare. Imidlertid caspase-9 proform, spaltet caspase-9 og caspase-3, ble opprettholdt på samme nivå i celler behandlet med caspase-8-inhibitor og G503 G503 eller alene (figur 3C). I samsvar med figur 3C, G503-indusert apoptotiske celler priser i SGC7901 celler ble ikke redusert med forbehandling med Z-IETD-FMK (figur 3D). Disse data antydet at på tross av aktivering av G503, er caspase-8 ikke er involvert i pro-apoptotiske aktivitet av G503.
(A), (B) Celler ble behandlet med 20μmol /l G503 i forskjellige tidsrom (A ) og behandlet med forskjellige konsentrasjoner G503 (0-40 umol /L) i 24 timer (B). Mobiltelefon totale proteiner ble hentet for å påvise nivåer av caspase-8 ved Western blotting. (C), (D) Celler ble pre-inkubert med 20 pmol /L Z-IETD-FMK i 30 min og deretter behandlet med 20 umol /L G503 i 24 timer. De cellulære proteiner ble ekstrahert for å påvise nivåene av kaspase -8, -9 og -3 ved Western-blotting (C). De cellulære apoptotiske Hastighetene ble bestemt ved strømningscytometri (D). Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter (*
P
0,05, **
P
0,01 vs kontroll).
G503-indusert apoptose er avhengig av caspase-9
caspase-9, initiator caspase av mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei kan bli aktivert ved å kombinere med cytokrom
c plakater (Cyto
c
) og apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1) [25] – [26]. For ytterligere å undersøke hvorvidt den mitokondrielle reaksjonsveien er involvert i G503-indusert apoptose, ble aktiveringen av caspase-9 undersøkt etter G503 behandling ved forskjellige konsentrasjoner og tider. I tillegg ble den apoptotiske cellen frekvensen også måles ved samtidig behandling med G503 og caspase-9-inhibitor Z-LEHD-FMK. Resultatene indikerte at caspase-9 proform redusert og spaltningssetene fragmentene økte på en tids- og doseavhengig måte (figur 4A, B). Deretter ble cellene forbehandlet med 20 umol /L Z-LEHD-FMK i 30 min og ko-inkubert med 20 pmol /L G503 i 24 timer. For å kvantifisere de apoptotiske celler, ble cellene farget med AnnexinV /PI og analysert ved strømningscytometri. Resultatene indikerte at den apoptotiske cellen sank når cellene ble samtidig behandlet med Z-LEHD-FMK og G503 (figur 4C). Samlet utgjør disse data antyder at det G503-indusert SGC7901 celle apoptose er avhengig av caspase-9-aktivering.
(A), (B) Celler ble behandlet med 20μmol /l G503 for forskjellige tider (A) og behandles med forskjellige konsentrasjoner av G503 i 24 timer (B). Cellulære proteiner ble ectracted og caspase-9 proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. (C) Cellene ble pre-inkubert med Z-LEHD-FMK i 30 minutter etterfulgt av 20 umol /L G503 i 24 timer. Den cellulære apoptotiske Hastigheten ble detektert ved strømningscytometri. Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * Og ** betegne
P
0,05 og
P
. 0,01, henholdsvis
G503 induserer apoptose via mitokondrie apoptotiske sti
det er velkjent at den mitokondrielle reaksjonsveien er en viktig apoptotisk reaksjonsvei. For å undersøke hvorvidt G503 induserer apoptose via mitokondrie vei, undersøkte vi apoptose-relaterte proteiner, den mitokondriemembranen potensial (MMP), og åpningen av MPTP for å bekrefte induksjon av mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei. Følge av G503 behandling, mitokondriell fluorescens ble redusert sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5A), og derved antyder at MPTP ble åpnet av G503. Dessuten, som vist i figur 5B, ble betydelig rød /grønn fluorescens intensitet ble observert i kontrollgruppen. Imidlertid, etter behandling med 20 umol /L G503, ble det rød /grønn fluorescens intensitet reduseres. Dette resultatet antydet at G503 reduserer mitokondriemembranen potensialet i SGC7901 celler. I tillegg, total Cyto
c
protein nivåer ikke særlig bytte mellom kontroll og narkotika gruppe; Men Cyto
c
ble relocalized til cytoplasma fra mitokondriene (figur 5C). Bax og BCL-2 er avgjørende faktorer i reguleringen av mitokondrie-kanaler og utgivelsen av ulike apoptose relaterte proteiner [27]. Derfor Vi studerte fordelingen av Bax og Bcl-2 i forskjellige cellulære avdelinger og har ikke observere en fremtredende forandring i den totale proteinnivåer Bax og Bcl-2 mellom kontroll- og medikamentgruppe; imidlertid, G503 fremmet translokasjon av Bax fra cytoplasma til mitokondriene, så vel som den translokasjon av Bcl-2 fra mitochondria til cytoplasma (figur 5D). Tatt sammen, induserer apoptose i G503 SGC7901 celler via mitokondrie bane.
(A) Celler ble behandlet med 20 umol /L G503 i 18 timer, og MPTP åpning ble detektert ved hjelp av mitokondriemembranen permeabilitet fluorescens fargestoff Calcein AM og flowcytometri. (B) Celler ble behandlet med 20 umol /L G503 i 18 timer, og membranpotensialet ble påvist ved hjelp av flow cytometri. «CCCP» er den positive kontroll reagensen i testsettet. (C), (D) Celler ble behandlet med G503 i 18 timer. Total proteinekstrakter ble oppsamlet for Western blotting for å vurdere nivået av Cyto
c product: (C) og Bax /Bcl-2 (D) i den totale protein, mitokondriell og cytoplasmatiske fraksjoner. Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter (*
P
0,05, **
P
0,01 vs kontroll).
G503 induserer apoptose i SGC7901 celler blant annet gjennom caspase-4 aktivering
caspase-4 kan direkte aktivere caspase-9, men ikke gjennom mitokondrie vei [28] – [29]. For å undersøke hvorvidt kaspase-4 aktiveres av G503 og hvorvidt aktiverte caspase-4 aktiverer caspase-9, undersøkte vi spaltningssetene fragmenter av caspase-4 og -9. Resultatene indikerte at caspase-4 spalting fragment økt betydelig i celler behandlet med G503, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6A). Behandling med caspase-4-hemmer Z-LEVD-FMK økte caspase-9 proform, som ikke ble oppdaget i G503 behandlingsgruppen (figur 6B). Resultatene indikerte at G503 induserer SGC7901 magekreft celle apoptose blant annet gjennom aktivering av caspase-4.
(A) Cellene ble behandlet med 20 mikromol /L G503 i 24 timer, og totale proteinekstrakter ble samlet inn for Western blotting. (B) SGC7901 cellene ble pre-inkubert med 20 pmol /L Z-LEVD-FMK i 30 minutter etterfulgt av 20 umol /L G503 i 24 timer. Den cellulære proteinekstrakter ble brukt til å påvise kaspase-9 nivåer ved Western blotting.
diskusjon
Det er rapportert at
p
kinon-delen av kinon-holdige molekyl~~POS=TRUNC spiller en meget viktig rolle i anti-kreft potensial [30]. Perchellet et al. også funnet at p-kinon J4, o-kinon J1 og usubstituert modell p-kinon J7 redusert mest L1210 tumorcellelevedyktighet på åtte forbindelser syntetisert og vist i sin innledende studie [31]. For å forstå forholdet mellom anti-kreft potensialet av altersolanol A og struktur-aktivitets, Teiten et al. evaluert effekten av altersolanol A og relaterte Anthracene derivater: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B og ampelanol. De fant at bare altersolanol A og dens acetylert derivat tetraacetylaltersolanol En fore en cytotoksisk effekt på K562-celler, mens derivater med reduksjon av én av karbonylgruppene, slik som tetrahydroaltersolanol B og ampelanol, har ingen effekt [32].
p
kinon strukturen G503 (figur S1) kan også bidratt til kreftcelle apoptose, og i neste forskning vil vi analysere G503 og dets derivater for å identifisere den foreløpige struktur-aktivitetsforhold. I denne studien, finner vi at den magekreft cellelinjen SGC7901 er den mest G503-sensitive kreftcellelinje undersøkt ved anvendelse av en cellelevedyktighet analyse i ni cancercellelinjer og to normale cellelinjer. G503 induserer SGC7901 magekreft celledød via apoptose i en doseavhengig måte. En annen magekreftceller AGS er også undersøkt, og er følsom for G503-indusert apoptose i tillegg. Som et resultat av dette er 20 umol /L G503 den optimale konsentrasjon som induserer alvorlig apoptose.
humane genom koder for minst 10 typer av kaspase-homologer. De følgende kaspase homologer delta i apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 og -10 [33]. Selv caspases spille en rolle i apoptose, er det ulike caspase uavhengige veier eksisterer. For eksempel, i nærvær av kaspaseinhibitorer, tumornekrosefaktor (TNF) induserer celle-nekrose, som besitter egenskapene til apoptose og nekrose [34] – [36]. I tillegg, apoptose-induserende faktor (AIF) er et DNA-enzym som nedbryter DNA direkte. Når mitokondriemembranen potensialet endres, blir AIF frigjøres til cytoplasma fra mitochondria og blir aktivert av sin vekselvirkning med cyclophilinA [37] – [38]. Endo G kan også svekke DNA direkte i et caspase-uavhengig måte [39].
I vår studie, aktiverer caspase-3, -8 og -9 i en dose- og tidsavhengig måte (figur G503 eksponering 2A, B; 3A, B; 4A, B). Er G503-indusert apoptose avhengig av kaspasene? Når celler ble ko-behandlet med Z-VAD-FMK og G503, hemmer Z-VAD-FMK caspase-9 og -3 aktivering (figur 2C, D), og antallet av apoptotiske celler indusert av G503 ble redusert (figur 2E), derved indikerer at G503-indusert SGC7901 celle apoptose er caspase-avhengig. For å skille om G503-indusert apoptose er avhengig av caspase-8, -9 eller begge deler, ble SGC7901 celler forbehandlet med Z-IETD-FMK og Z-LEHD-FMK og deretter samtidig behandling med G503. Resultatene indikerer at Z-IETD-FMK ikke inhiberer caspase-9 og -3 aktivering (figur 3C) og heller ikke redusere antallet av apoptotiske celler indusert av G503 (figur 3D); imidlertid redusert Z-LEHD-FMK antallet apoptotiske celler (Figur 4C). Således G503-indusert SGC7901 celle apoptose er ikke avhengig av caspase-8, men er på caspase-9.
Mitokondriene består av en ytre membran, membranen plass og matrise. Apoptose-relaterte proteiner, slik som kaspase proenzymer, Cyto
c
og AIF eksistere i membranen plass.
