Abstract
Thyroid hormon reseptor (TR) medierer de avgjørende effektene av skjoldbruskkjertel hormon (T3) på cellevekst, utvikling og differensiering. Redusert uttrykk eller inaktivere somatiske mutasjoner i TR har blitt funnet i menneskelige kreft i lever, bryst, lunge, og skjoldbruskkjertelen. Mekanismene for TR-forbundet kreftutvikling er fortsatt ikke klart. Å etablere funksjonen av TRβ i skjoldbruskkjertelen celleproliferasjon, bygget vi et rekombinant adenovirus vektor, AdTRβ, som uttrykker menneskelig TRβ1 cDNA. Tyroid cancer cellelinjer som TRβ proteinnivåer ble signifikant redusert sammenlignet med intakte skjoldbrusk vev ble infisert med AdTRβ og funksjonen av TRβ på celleproliferasjon og migrering ble analysert. Ligand-bundet TRβ indusert HDAC1 og HDAC3 dissosiasjon fra, og histon acetylering forbundet med RHOB-promoteren og forbedret ekspresjon av RHOB mRNA og protein. I AdTRβ-infiserte celler, T3 og farnesyltransferaseinhibitor (FTI) -rensing indusert fordelingen av RHOB på cellemembranen og forbedret overflod av aktiv GTP-bundet RHOB. Dette RHOB-protein førte til p21-assosierte cellesyklus-stans i G0 /G1 fase, etter hemming av celleproliferasjon og invasjon. Omvendt, senke mobil RHOB av små interfererende RNA knockdown i AdTRβ-infiserte celler førte til nedregulering av p21 og hemmet cellesyklus arrest. Veksten av BHP18-21v tumorxenotransplantater
i
vivo
ble betydelig hemmet av AdTRβ injeksjon med FTIs-behandling, sammenlignet med kontroll virus-injisert svulster. Denne romanen signalveien utløst av ligand-bundet TRβ gir innsikt i mulige mekanismer for spredning og invasjon av skjoldbrusk kreft og kan gi nye terapeutiske mål for skjoldbrusk kreft
Citation. Ichijo S, Furuya F, Shimura H, Hayashi Y, Takahashi K, Ohta K, et al. (2014) Aktivering av RHOB signalveien ved Thyroid hormonreseptor β i Thyroid kreftceller. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10,1371 /journal.pone.0116252
Redaktør: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japan
mottatt: 12 august 2014; Godkjent: 05.12.2014; Publisert: 30.12.2014
Copyright: © 2014 Ichijo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI (Grant Number 24591359). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
thyroid hormonreseptorer (TRS) er ligand-avhengig transkripsjonsfaktorer som formidler handlinger av skjoldbruskkjertel hormon (T3) i cellulær utvikling, vekst og differensiering. To menneske TR gener, Thra og THRB som er plassert på forskjellige kromosomer, koder T3-bindende isoformer (TRα1, β1, β2, og P3) som kommer til uttrykk i en vevs- og utvikling avhengig måte [1]. I løpet av de siste tiårene, har betydelige fremskritt er gjort i forståelse av TR handlinger i å opprettholde normal cellefunksjon. Imidlertid er rollene til TR i human kreft ikke godt forstått. Den reduserte uttrykk for TR grunn av hypermethylation eller sletting av TR gener i kreft hos mennesker tyder på at TR kan fungere som tumor suppressors [2]. Et nært samarbeid med somatiske mutasjoner av TR med skjoldbrusk kreft støtter tanken om at tap av normale funksjoner TR kan føre til ukontrollert vekst og tap av celledifferensiering [3].
For å forstå de funksjonelle konsekvensene av ligand videre -bundet TRβ effekter på nedstrøms signalveier i skjoldbruskkjertelen kreftceller, fokuserte vi på RHOB som er medlem av Ras super av isoprenylated små GTPases som regulerer aktin stresset fiber og transport vesikkel [4]. Andre RhoGTPases, som inkluderer RhoA og RhoC, fremme onkogenese, invasjon og metastasering [5]. I motsetning til dette, har RHOB antiproliferative og proapoptotiske effekter på kreftceller, og overekspresjon av RHOB kan hemme cellemigrering, invasjon og metastase [6]. Membran sammenslutning av RHOB protein skjer gjennom enten geranylgeranylated (RHOB-GG) eller farnesylated modifikasjoner. RHOB reagerer på farnesyltransferaseinhibitor (FTI) -rensing av en gevinst-av-funksjon mekanisme som er karakterisert ved heving av RHOB-GG form som hemmer proliferasjon og apoptose av kreftceller [7]. Dermed kan endres uttrykk og aktivitet av RHOB være avgjørende for kreft progresjon og behandlingstiltak.
I denne studien, utforsket vi funksjonen av ligand-bundet TRβ i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Ligand-bundet TRβ indusert RHOB proteinekspresjon, som fører til økt ekspresjon av p21, fulgt av redusert celleproliferasjon og motilitet. FTI-behandling forbedret disse antiproliferative funksjoner av ligand-bundet TRβ. Våre resultater identifisere RHOB oppregulering som et viktig skritt for målretting skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon og tumorprogresjon. Denne romanen signalveien utløst av ligand-bundet TRβ gir innsikt i mulige sprednings og invasjon mekanismer for skjoldbruskkjertelkreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
BHP18-21 celler, som ble rapportert av Ohta
et al. product: [8], ble gitt som en gave av Dr. Jerome Hershman, UCLA. BHP18-21v celler, som uttrykker Pax-8, men ikke uttrykker enten den tyroglobulin eller skjoldbrusktranskripsjonsfaktor-1-genet, ble isolert fra BHP18-21v celler [9]. FRO og WRO celler, som ble rapportert i referanse [10], [11] ble vennlig levert av Dr. Shunichi Yamashita, Universitetet i Nagasaki. Disse cellelinjene ikke er
de
novo
cellelinjer, men har allerede blitt rapportert [8], [10], [11] og ble vennlig gitt som gaver fra våre samarbeidspartnere. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet inkubator under en 5% CO
2 atmosfære. DNA profilering av cancercellelinjer ble analysert ved hjelp av Promega Japan (Tokyo, Japan) og er vist i tabell 1. Thyroid Hormone, trijodtyronin (T3) og farnesyltransferase inhibitor (FTI), FTI-277, ble innkjøpt fra Sigma Aldrich (St. . Louis, MO). Cellene ble inkubert med harpiks-strippet (T
3-fratatte) FBS [12] og ble deretter infisert med 30 MOI på AdTRβ eller kontroll AdLacZ. Cellene ble inkubert i medium, med eller uten 30 nM av T3 eller fem mikrometer fra FTI.
Bygging av rekombinante adenovirus vektorer
AdTRβ er en ΔE1-ΔE3 rekombinant adenovirus som uttrykker det humane TRβ-genet [13] under kontroll av den umiddelbare tidlige promoter fra cytomegalovirus (CMV). Byggingen av AdTRβ viruset har tidligere blitt beskrevet [13]. AdLacZ, som inneholder CMV-promotor-styrte
lacZ
-genet, ble kjøpt fra Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada) og ble anvendt som en kontroll. AdTRβPV er en rekombinant adenoviral vektor som uttrykker humant TRβPV, som er en dominant negativ mutant av TRβ [14], under kontroll av cytomegalovirus immediate early promoter. Den FLAG-TRβPV plasmid [15] ble brukt som mal for kloning
TRβPV
inn pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) ved hjelp av polymerase kjedereaksjon. PCR-primere var: FLAG-Apal-5 «(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), og TRβPV-3» Kpnl (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC) hvori understreking angir restriksjonsseter. Et adenovirus vektor ble deretter konstruert ved å bruke Adeno X uttrykke System (Clontech) i henhold til produsentens protokoll. Rekombinante adenovirus ble plaque-renset, høstet 48 timer etter infeksjon av 293-celler og renset ved dobbelt cesiumklorid-gradient-ultrasentrifugering [16]. Viral titere ble bestemt av plakk analyser med dyrkede 293 celler [16] og en adenovirus titrering kit (Clontech).
Plasmid konstruksjon og luciferase analysene
RHOB reporter plasmid -726 /+ 86 RHOB -Luc plasmid ble vennlig levert av Dr. Dimitris Kardassis (University of Crete Medical School) [17]. Transiente ko-transfeksjoner ble utført i tre eksemplarer. Den Renilla luciferase plasmid ble co-transfektert for normalisering. Plasmid-transfeksjoner ble utført i AdTRβ eller kontrollere virusinfiserte thyroid kreft celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med eller uten T3 i ytterligere 24 timer. Dual luciferase analysene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI).
ChIP analysen
chip analysene ble utført ved hjelp av en enkel ChIP enzymatisk kromatin immunoprecipitation kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). AdTRβ-infiserte celler (5 x 10
7) som ble behandlet med eller uten T3 ble fiksert med 1% formaldehyd og fordøyd kromatin ble immunopresipitert med anti-histon 3 (positiv kontroll), normal kanin IgG (negativ kontroll), anti acetyl histon 3 (Lys 9), anti-histon-deacetylase (HDAC) en eller anti-HDAC3 antistoffer. Fem hundre ul fortynnet kromatin ble immunoutfelt med 5 mikrogram av hvert antistoff og protein G magnetiske kuler i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time (RT) -PCR ble utført ved hjelp av en SYBR grønn real-time PCR kit (Life Technologies). Primersekvensene brukes for RT-PCR var: frem 5′-GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 «og omvendt 5′-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3»
Kvantitativ sanntid revers transkriptase PCR
Total RNA ble. ekstraheres fra cellene ved hjelp av en RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Etter kvantifisering av spektrofotometri, ble 5 mikrogram total RNA revers transkribert for å få cDNA ved hjelp av 160 mikrometer deoksynukleotidtrifosfat, 50 ng av tilfeldige heksamerprimere og 200 enheter av Super II i henhold til produsentens anbefalinger (Life Technologies). TaqMan prober for human RHOB, TRβ, og 18S rRNA ble kjøpt fra Life Technologies. mRNA nivåer ble bestemt ved real-time RT-PCR som tidligere beskrevet av Furuya
et al.
[18].
Western blot analyse
Denne studien ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Yamanashi. Normale skjoldbruskkjertelen vev fra motsatt flik av karsinom ble oppnådd ved kirurgi etter at pasientene ga skriftlig informert samtykke. Dokumentene om informert samtykke, som ble godkjent av etisk komité, ble holdt i universitets sykehus oppbevaringsskap. Normal vev fra fire av pasientene ble samlet for Western blotting eksperimentet. Vevene ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter reseksjon. Protein lysater av normale tyroideavev og kreftcellelinjer ble fremstilt ved anvendelse av cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) i henhold til produsentens instruksjoner. Membran protein ble renset fra AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler ved hjelp av en membran protein rensing kit (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA) i henhold til produsentens instruksjoner. Bestemmelse av protein overflod ved Western blot-analyse ble utført som beskrevet [19] med de følgende primære antistoffer (1:500 fortynning): anti-RHOB og anti-fosforylert Rb (Cell Signaling Technology); anti- PPARy, anti-p21, anti-tubulin, og anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Negativ kontroll siRNA og siRNA mot RHOB ble kjøpt fra Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, UK). Western blot-analyse av siRNA-transfekterte celler ble utført som følger: cancercellelinjer (1,0-1,3 x 10
5) infisert med adenovirus (MOI 30) ble inkubert med T3 i 12 timer og deretter 50 nm av siRNA ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer ble cellene vasket med fosfatbufret saltoppløsning (Ca
2 + /Mg
2 + -fri) og analysert som beskrevet ovenfor.
Immunoutfellingsanalyse
å analysere protein uttrykk for TRβ i cellene, 500 mikrogram av protein lysat fra skjoldbruskkjertelen vev, HepG2 eller virus-transfektert skjoldbrusk kreft cellelinjer ble immunoutfelt med 5 mikrogram av C3 monoklonalt antistoff mot C endestasjonen TRβ (Santa Cruz Biotechnology) eller med 5 mikrogram av mus IgG som angitt i teksten ved hjelp av Dynabeads protein G immunoprecipitation kit (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av et anti-TRβ-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) mot et N-terminalt TRβ peptid eller et anti-TRα-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) mot et N-terminalt peptid TRα. Cellelysatene av AdTRβ-infiserte celler ble immunopresipitert med Rhotekin RBD merket agarosekuler og overflod av GTP-bundet RHOB ble analysert ved pull-down-analyse, ved hjelp av RHOB aktivering analysesett (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA).
Cell-syklus analyse
cellene ble farget med 20 mikrogram /ml propidiumjodid (Life Technologies) og ble analysert ved hjelp av en BD Biosciences FACS Calibur flowcytometer (Franklin Lakes, NJ) og Cell quest programvareversjon 3.0. Prosentandelen av celler i G
1, S eller G
2 /M fase ble beregnet ved hjelp ModFitLT versjon 3.1.
celleproliferasjon og invasjon analyser
Antall av celler ble målt ved hjelp av en ikke-radioaktiv analyse celleproliferasjon (celle~~POS=TRUNC leder-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) som tidligere beskrevet av Furuya
et al product: [19]. Cellular invasjonen ble målt ved hjelp av Cytoselect Cell Invasion analysesett (Cell Biolabs, Inc.), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellekulturmedium med 10% FBS ble anvendt som en kjemoattraktant i den nedre vel av kammeret. Etter rehydratisering av basalmembran, ble thyroid kreft-cellelinjer sådd i det øvre rom av kammeret i serumfritt medium (1 x 10
4 celler per brønn) med T3 eller FTI-behandling. Etter inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24 timer, ble de ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten, og cellene som hadde invadert membranen (8 um porestørrelse) for å nå den nedre overflate var farget med CyQuant GR Fluorescent Dye. Deres fluorescens ble analysert ved 480 nm ved hjelp av en fluorescens plateleser.
xenografter av BHP18-21v celler og vektor injeksjon
BHP18-21v celler (1 x 10
7) ble transplantert inn abdominal subcutaneous vev av 8 uker gammel mann naken mus (BALB /C
nu /nu
). Tre uker senere, når tumorene hadde nådd omtrent 1 cm i diameter, ble musene tilfeldig plassert i den eksperimentelle eller kontrollgruppen (6 mus pr gruppe). Fem x 10
8 plaque-dannende enheter av AdTRβ eller AdLacZ i 100 ul PBS ble injisert inn i tumorene. Adenovirus administrasjon ble gjentatt hver 7. dag. På hvert tidspunkt ble alle musene også injisert intraperitonealt med 100 mg /kg /kroppsvekt av FTI-277. På dag 30 ble musene avlivet av CO
2 innånding. Tumorer som ble fjernet fra musene ble fiksert i 10% bufret formalin og innstøpt i parafin. Snittene ble permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Serum gratis T3 og TSH nivåer ble bestemt ved hjelp av gratis T3 ELISA kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, CA) og en TSH analysen kit (Uscn Life Science Inc, Wuhan, Kina), henholdsvis i henhold til produsentens instruksjoner. Den institusjonelle biosikkerhet komité ved University of Yamanashi godkjent dyre prosedyrer og bruk av rekombinant DNA.
statistikker
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis variansanalyse eller uparet 2-tailed Student
t
-test, og sannsynlighets verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
for å utforske TRβ funksjon i skjoldbruskkjertelen celleproliferasjon, vi fokusert på analyse av RHOB, som er et mål på TRβ og uttrykkes på svært lave nivåer i 130 humane kreftcellelinjer [20]. For denne studien, brukte vi tre skjoldbrusk kreft cellelinjer, BHP18-21v, FRO og WRO, som ble infisert med 30 MOI av AdTRβ eller AdLacZ. Vi først analysert TRβ protein ekspresjon i disse cellene. Fem hundre mikrogram av hel-celle-lysat-protein ble immunopresipitert med et monoklonalt antistoff som gjenkjenner TR C-terminale region, etterfulgt av Western blot-analyse med et antistoff mot et N-terminalt peptid TRβ. Som vist på fig. 1A, TRβ ekspresjon ble klart observert i de positive kontroller; intakt tyroideavev (kolonne 1) og HepG2-celler som uttrykker funksjonelt TR [21] (spor 2), og også i AdTRβ-infisert BHP18-21v, FRO og WRO celler (søyle 6-8). Ingen TRβ protein-ekspresjon ble observert i AdLacz-infisert BHP18-21v, FRO eller WRO-celler (kolonnene 3-5) eller i HepG2-celler som ble immunoutfelt med et muse-monoklonalt IgG-antistoff som en negativ kontroll (kolonne 9). Tubulin ekspresjon i protein lysat (10 ug) ble også analysert som en laste kontroll (Fig. 1B). Vi har også analysert TRα ekspresjon i disse cellelysatene ved hjelp av Western blot-analyse av proteiner immunoutfelt med et antistoff mot et N-terminalt peptid TRα. TRα ekspresjon ble observert i de positive kontroller; tyroideavev og HepG2 (spor 1 og 2, henholdsvis). Ingen TRα protein uttrykk ble observert i BHP18-21v, FRO eller WRO celler som ble infisert med AdLacZ (baner 3-5) eller AdTRβ (baner 6-8). Nedregulering av ekspresjon PPARy og dens aktivitet er ansett for å være en mekanisme av skjoldbruskkjertelen karsinogenese [22]. Vi har derfor også analysert protein uttrykk for PPARy i BHP18-21v, FRO eller WRO celler (Fig. 1C). PPARy-ekspresjon ble redusert i disse kreftceller sammenlignet med den for intakt tyroideavev men infeksjon med AdTRβ hadde ingen effekt på ekspresjon av PPARy i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Disse data indikerer at de tre AdTRβ eller AdLacZ infisert cellelinjene som ble testet er en god modell for analyse av TRβ funksjon.
A. Western blot av cellelysatene (500 ug) fremstilt fra normalt vev skjoldbruskkjertelen, fra positive kontroll HepG2 celler, eller fra skjoldbruskcancercellelinjene BHP18-21v, FRO og WRO som ble infisert med AdTRβ eller kontrollere AdLacZ virus. Lysater ble immunoutfelt (IP) med 5 ug av muse-monoklonalt anti-TRβ antistoff (C3) som gjenkjenner TRβ C-terminus, eller med 5 ug av normal mus IgG (IgG) som angitt. Blottene ble probet med et antistoff mot et N-terminalt peptid TRβ (TRβ) eller med et antistoff mot et N-terminalt peptid TRα (TRα). B. Tubulin ekspresjon i totale cellelysater ble anvendt som en kontroll lasting. C. Western blotting-analyse av ekspresjonsnivået av PPARy protein (øvre panel) i celleekstrakter (20 ug protein lysat). Tubulin ble også utslettet som en lasting kontroll (nederst panel).
Vi analyserte neste effekten av T3 behandling av AdTRβ- eller AdLacZ-infiserte skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer på RHOB uttrykk (Fig. 2A-C ). T3-behandling (30 nM) av AdTRβ-smittet (baner 1-4), men ikke fra AdLacZ-infiserte (baner 5-7) BHP18-21v, FRO og WRO celler for 6, 12 eller 24 timer forbedret uttrykk for RHOB betydelig mRNA i en tidsavhengig måte sammenlignet med ikke-behandlede ikke-virusinfiserte celler. Videre, Western blotting-analyse indikerte at T3-behandling i 12 eller 24 timer indusert RHOB protein ekspresjon i AdTRβ-infisert BHP18-21v, FRO og WRO celler, men ikke i AdLacZ-infiserte celler (fig. 2D-F, kolonnene 2-4 og baner 5-7 henholdsvis). Således induksjon av RHOB mRNA og protein ekspresjon er T3 /AdTRβ-avhengige i skjoldbruskcancercellelinjer.
Expression nivåer av mRNA RHOB (A-C) eller protein (D-F) i AdTRβ-infiserte, kontroll AdLacZ-smittet eller ikke-infisert skjoldbrusk kreft cellelinjer utsatt til 30 nM av T3 for 0, 6, 12 eller 24 timer som angitt. (A-C) Ekspresjon av RHOB og 18S mRNA ble bestemt ved anvendelse av sanntids RT-PCR med 100 ng av cDNA. Relative mRNA-ekspresjonsnivåer ble bestemt ved vilkårlig å sette verdien for kontrollvirusinfiserte celler inkubert i T3-fritt medium til 1. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 6). *,
p
0,05. (D-F) Western blot-analyse av 20 ug protein lysater av cellene ble utført ved anvendelse av antistoffer mot RHOB (øvre panel) eller tubulin (nedre panel), som ble anvendt som en kontroll lasting.
for å klargjøre hvilke mekanismer gjennom hvilke ligand-bundet TRβ forbedret uttrykk for RHOB i AdTRβ-infiserte BHP18-21v, FRO og WRO celler, analyserte vi effekten av T3 behandling av disse cellelinjene på transkripsjonen aktivitet av RHOB promoter. AdTRβ- eller kontroll AdLacZ-infiserte celler ble derfor transient transfektert med RHOB promoter-luciferase reporter konstruere, -726 /+ 86 RHOB-Luc. Luciferaseaktivitet drevet av RHOB-promoteren ble betydelig forbedret i AdTRβ-infiserte celler, men ikke i AdLacZ-infiserte celler etter T3-behandling (fig. 3A-C).
(A-C) RHOB promoter-luciferase reporter analyser. Adenovirus-infiserte BHP18-211v (A), FRO (B), eller Wroclaw (C) celler ble transfektert med 1 ug av et RHOB promoter-luciferase reporter plasmid og ble inkubert i ytterligere 24 timer i fravær eller nærvær av 30 nM T3. Relativ promotor aktiviteter (luciferaseaktivitet) ble bestemt ved vilkårlig å sette verdien for kontrollvirusinfiserte celler inkubert i T3-fritt medium til 1. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 6). *,
p
0,05. (D-F) -brikke analyse ved bruk av AdTRβ-infisert BHP18-211v (D), FRO (E), eller Wroclaw (F) celler behandlet med eller uten 30 nM T3. Antistoffer som gjenkjenner histone3 (H3), acetylerte H3, HDAC1, HDAC3 eller normal kanin IgG ble brukt for immunoprecipitation av kromatin. Skriving angir 10% av kromatin. PCR-produktene ble separert på en 2% agarose-gel.
Transkripsjon av RHOB-promoteren blir inhibert av transkripsjonelle repressorer som rekrutterer histon deacetylases (HDACs) for å fjerne acetylering av lysinrester på histones3 (H3) haler [23]. Det er vel etablert at acetylering status av hale domener av histones3 (H3) endres under transkripsjonen aktivering av RHOB-promotoren [24]. For å bestemme om induksjon av RHOB genekspresjon ved ligand-bundne TRβ korrelerer med endring i status acetylering av H3 i promoterregionen av RHOB-genet, ble kromatin immunoutfellingsstudier (chip) analyser utført. AdTRβ-infisert BHP18-21v, FRO eller WRO celler ble inkubert med eller uten T3 til 24 timer og chip-analyser ble utført ved anvendelse av antistoffer for å H3, acetylert H3, HDAC1 og HDAC3. Som vist på fig. 3D-F, H3 ble funnet i fragmenter av RHOB-promotoren (kolonne 3) i AdTRβ-infiserte celler med eller uten T3-behandling. Imidlertid ble HDAC1 og HDAC3 forbundet med fragmenter av RHOB-promoteren bare når cellene ble inkubert uten T3, og ikke når cellene ble inkubert med T3 (HDAC1 /3; henholdsvis kolonnene 5 og 6). I samsvar med disse resultatene ble det ikke acetylert H3 forbundet med promoteren i fravær av T3 behandling, mens i nærvær av T3, ble H3 som var forbundet med promotoren sterkt acetylert (felt 4). Disse resultatene indikerer at ligand-bundet TRβ indusert RHOB transkripsjon gjennom endring av histon-acetylering status av thyroid kreft celler.
Vi analyserte ved virkningen av ligand-bundet TRβ på den cellulære lokalisering og funksjon av RHOB. For dette formålet vi ansatt agenten FTI. FTI behandling av celler induserer membranen foreningen av RHOB ved modifikasjon av RHOB ved tilsetning av lipid-grupper [4]. Membran sammenslutning av RHOB er viktig for sin aktivitet. Vi bestemmes først virkningen av 5 uM av FTI behandling på RHOB protein ekspresjon i AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler som ble behandlet med eller uten T3 (30 nM). Western blotting av helcellelysater av behandlede /ubehandlede AdTRβ-infiserte celler med BHP18-21v RHOB-antistoff (Fig. 4A) indikerte at FTI-behandling ikke forandre T3 induksjon av ekspresjon RHOB (sporene 2 og 4) og ikke forbedre RHOB protein ekspresjon i AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler i fravær av T3-behandling (felt 3).
AdTRβ-infiserte celler ble eksponert BHP18-211v to30 nM T3 og /eller 5 uM av farnesyltransferaseinhibitor ( FTI) i 24 timer og ble deretter analysert som følger. A. Western blotting-analyse av ekspresjonsnivået av RHOB protein (øvre panel) i celleekstrakter (20 ug protein lysat). Tubulin ble også utslettet som en lasting kontroll (nedre panel). B. Cellelysater ble immunopresipitert med Rhotekin RBD-merket agarose perler. GTP-bundet RHOB i utfellingene ble analysert ved Western blotting ved anvendelse av et antistoff mot RHOB. C. Western blotting-analyse av RHOB protein i membranproteinfraksjon. GAPDH ble utslettet som membran protein markør lasting kontroll (nederst panel).
Vi analyserte deretter effekten av T3 behandling med /uten FTI co-behandling på RHOB aktivitet. Som andre små GTPases, regulerer RHOB molekylære hendelser ved å sykle mellom en inaktiv BNP-bundet form og en aktiv GTP-bundet form. I den aktive GTP-bundet form, RHOB binder spesifikt til Rho-bindende domene (RBD) av Rhotekin å regulere nedstrøms signalkaskader. Vi analyserte derfor overflod av GTP-bundet RHOB i cellelysater av AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler som ble behandlet med eller uten T3 og /eller FTI ved immunoutfelling av cellelysater med Rhotekin RBD-merkede agarosekuler, etterfulgt av immunblotting for RHOB ( fig. 4B). Disse pull-down-analyser indikerte at ikke bare den overflod av RHOB, men også den mengde av den aktive GTP-bundet form av RHOB i AdTRβ-infiserte celler BHP18-21v ble forsterket av T3-behandling (kolonne 2) og sterkt forsterket av FTI og T3 co-behandling (felt 4). Ingen GTP-bundet RHOB ble påvist i FTI-behandlede celler uten T3-behandling (felt 3). Resultatene indikerte at ligand-bundet AdTRβ-indusert RHOB protein i BHP18-21v celler var en aktiv kinase hvis virksomhet ble forsterket ved samtidig behandling med FTI.
For å finne ut om T3 og FTI kan indusere membran sammenslutning av RHOB i AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler, celleoverflateproteiner ble biotinylert. Biotinylerte proteiner i cellelysatene ble deretter trukket ned med streptavidin perler og analysert ved immunblotting med et anti-RHOB-antistoff (Fig. 4C). T3-behandling indusert ekspresjon av RHOB ved cellemembranen (spor 2), som ble betydelig forbedret ved samtidig behandling med FTI (felt 4). FTI-behandling ikke forbedre RHOB protein ekspresjon i cellemembranen av AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler i fravær av T3-behandling (felt 3). Resultatene indikerte at T3-indusert membran sammenslutning av RHOB som ble forsterket av FTI co-behandling og var i samsvar med T3 induksjon av RHOB aktivitet i AdTRβ-infiserte BHP18-21v celler.
cyclin-avhengig kinase (CDK ) inhibitor, p21, er en negativ regulator av cellesyklusprogresjon og er en av de nedstrøms mål for RHOB. For å bekrefte aktiviteten av RHOB i AdTRβ-infiserte celler behandlet med BHP18-21v T3 og /eller FTI, analyserte vi protein ekspresjon av p21 ved Western blot-analyse (Fig. 5A-C). p21 uttrykk ble analysert i celler transfektert med RHOB målrettede eller kontroll siRNA å bekrefte RHOB avhengighet av p21changes. Tre thyroid kreft celler ble for-dyrket i T3-fritt medium med strippet serum, som beskrevet i «Materialer og metoder». FTI-behandling ikke forbedre p21 protein ekspresjon i siRNA-kontroll AdTRβ-infiserte celler uten T3-behandling (kolonne 2). I AdTRβ-infiserte celler, ble ekspresjonen nivået av p21 øket i celler behandlet med T3 (felt 3) og er betydelig forbedret ved samtidig behandling med FTI (felt 4) sammenlignet med ikke-behandlede celler (kolonne 1). Men p21 ble ikke utløst av T3 pluss FTI behandling av AdTRβ-infiserte celler 24 timer etter transfeksjon med RHOB målrettet siRNA (kolonne 5). p21 inhiberer aktivitetene til CDK, som fører til hypo-fosforylering av retinoblastom protein (Rb), som igjen fører til cellesyklus-stans i G0 /G1 fase [25]. Vi analyserte fosforyleringen av Rb (p-Rb) på AdTRβ-infiserte thyroid kreft celler behandlet med T3 og /eller FTI [(Fig. 5 (A-C)). Rb ble fosforylert i AdTRβ-infisert BHP18-21v, FRO eller WRO celler med eller uten T3-behandling (kolonnene 1 og 3). FTI-behandling alene ikke hemme fosforyleringen av Rb i AdTRβ-infiserte celler (kolonne 2). Rb fosforylering ble betydelig redusert i AdTRβ-infiserte celler ved samtidig behandling med T3 og FTI (kolonne 4). På den annen side ble hemming av Rb-fosforylering ikke observert av T3 pluss FTI behandling av AdTRβ-infiserte celler etter transfeksjon med RHOB-målrettede siRNA (felt 5).
(A-C) Western blot analyse av ekspresjonsnivået av p21 eller av fosforylert Rb proteinet i AdTRβ-infiserte BHP18-21v (A), FRO (B), eller WRO (C) celler som ble utsatt for 30 nM T3 alene i 12 timer eller til 30 nM T3 pluss 5 uM av FTI i 12 timer, med eller uten siRNA knockdown av RHOB som angitt. Tubulin ble utslettet som en lasting kontroll (bunnpaneler). (D-F) Prosentandelen av celler i G
0 /G
1, S eller G
2 /M fasen ble beregnet ved hjelp av ModFitLT versjon 3.1. Data er uttrykt som middel ± S.D. (
n
= 6). *,
p
. 0,05
Vi videre studert cellesyklus stadier av disse cellene ved hjelp av flowcytometri (figur 5D-F.). I si-styre AdTRβ-infiserte celler, behandling med T3 pluss FTI induserte en signifikant økning i G0 /G1 fase populasjon sammenlignet med ikke-behandlede eller T3-behandlede celler, mens i RHOB-målrettede siRNA-transfekterte celler, T3 + FTI behandling hadde ingen virkning på cellepopulasjonen i G0 /G1 fase. Videre behandling med T3 pluss FTI redusert antall celler i G2 /M fase i si-bestemmende, men ikke i RHOB-målrettede siRNA-AdTRβ-infiserte celler. Disse resultatene indikerer at den forbedrede RHOB uttrykk i AdTRβ-infiserte kreftceller som ble behandlet med T3 og FTI, ble ledsaget av økt uttrykk av p21 og hemming av cellesyklusprogresjon.
For å bekrefte at de observerte endringene i p21 ekspresjon reflekterte endringer i celle-proliferasjon, vi neste analysert virkningene av TRβ for kreft celleproliferasjon ved anvendelse av MTT-analysen. For denne analysen ble BHP18-21v, FRO eller WRO-celler infisert med 30 MOI på AdTRβ og, etter 12 timers inkubering i adenovirus-inneholdende medium, ble cellene dyrket med eller uten T3 (30 nM) og 5 uM av FTI for 24 eller 72 timer. Etter 24 og 72 timers inkubering celletallet hadde øket i fravær av T3-behandling, men var redusert i nærvær av T3 og var betydelig redusert i nærvær av T3 pluss FTI (Fig. 6A-C).
(A-C) celleproliferasjonsanalyse. BHP18-21v (A), FRO (B) eller Wroclaw (C) celler ble inkubert i T3-utarmet medium i 24 timer og ble deretter infisert med 30 MOI på AdTRβ. Cellene ble deretter inkubert i medium med T3 og /eller FTI for en ekstra 24 eller 72 timer. Relative celleantall ble bestemt ved vilkårlig å sette verdien for kontrollkulturene inkubert i T3-fritt medium til 1. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 6). *,
p
0,05. Som vist på fig. *,
p
0,05. *,
p
0,05.
