Abstract
Telmisartan, en angiotensin II-reseptor type 1-blokkering, blir ofte brukt som en antihypertension narkotika, og det er også blitt karakterisert som en peroksisom proliferator-aktivert reseptor-gamma (PPARy) ligand. Hensikten med denne studien var å belyse de antitumoreffekter av telmisartan for endometrial kreft celler. Vi behandlet tre endometrial cancer cellelinjer med forskjellige konsentrasjoner av telmisartan, og vi undersøkt effekten av telmisartan på celleproliferasjon, apoptose, og deres relaterte målinger in vitro. Vi har også administrert telmisartan til hårløse mus med eksperimentelle tumorer å fastslå dens in vivo effekter og toksisitet. Alle tre endometrial cancer cellelinjer var følsomme for den veksthemmende virkning av telmisartan. Induksjonen av apoptose ble bekreftet i samspill med den endrede ekspresjon av gener og proteiner relatert til apoptose. Vi observerte også at DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) ble indusert i HHUA (human livmorkreft) celler ved telmisartan behandling. I tillegg har eksperimenter i nakne mus, viste at telmisartan signifikant inhiberte human endometrial tumor vekst, uten toksiske bivirkninger. Våre resultater tyder på at telmisartan kan bli en ny terapeutisk alternativ for behandling av livmorkreft
Citation. Koyama N, Nishida Y, Ishii T, Yoshida T, Furukawa Y, Narahara H (2014) Telmisartan induserer vekst Hemming DNA Dobbelt Strand Breaks og apoptose i human livmorkreft celler. PLoS ONE 9 (3): e93050. doi: 10,1371 /journal.pone.0093050
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, Canada
mottatt: 30 juni 2013; Godkjent: 28 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Koyama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en forskningsfond ved skjønn av presidenten, Oita University (HN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorkreft er de vanligste ondartede svulster i kvinnelige kjønnsorgan, og insidensen har økt de siste årene [1], [2]. Imidlertid har jakten på midler som er effektive i behandling av avansert og tilbakevendende livmorkreft vært skuffende [2], [3]. Innovative tilnærminger er således nødvendig for behandlingen av endometrial cancer
nukleær hormonreseptor peroksisom proliferator-aktiverte reseptor-gamma (PPARy), og dets ligander indusere apoptose i flere typer kreft, inkludert endometrial cancer [4]. – [6]. Telmisartan er en angiotensin II-reseptor type 1 (AT1R) blocker (ARB) som er mye brukt som en antihypertensive narkotika. Benson et al. rapporterte en strukturell likhet mellom telmisartan og pioglitazon, en PPARy ligand [7]. Telmisartan fungerer som en partiell agonist av PPARy ligand, aktivere reseptoren til 25% -30% av det maksimale nivå oppnådd ved den fullstendige agonister pioglitazon og resiglitazone, hvori telmisartan virker uavhengig via AT1R interaksjon [7]. Telmisartan er blitt rapportert å ha antiproliferative aktivitet i prostatacancer og nyrecellekreft [8] – [10]. Effekten av telmisartan på gynekologiske kreftceller har ennå ikke undersøkt.
Denne studien er designet for å avsløre, for første gang, den biologiske og terapeutiske effekter av telmisartan på livmorkreft. Vi undersøkte hvorvidt denne forbindelsen kan mediere inhibering av celleproliferasjon og induksjon av apoptose i endometrial cancer-cellelinjer. Vi undersøkte om DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) blir indusert i HHUA (human livmorkreft) celler ved telmisartan behandling. Vi har også testet evnen til telmisartan å hemme spredning av HHUA celler in vivo, ved hjelp av en naken mus modell.
Materialer og metoder
Cellelinjer
HHUA menneskelige livmor cancercellelinjen ble oppnådd fra Riken (Ibaraki, Japan). Den Ishikawa human livmorkreft cellelinje ble vennlig levert av Dr. Masato Nishida (Tsukuba University, Ibaraki, Japan) [11] – [13]. HEC-59 human endometrial cancer cellelinje og normalt voksent menneske på hud-fibroblast-cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HHUA, Ishikawa, HEC-59-celler ble opprettholdt som monolag ved 37 ° C i 5% CO
2 /luft i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Gibco, Rockville, MD). Normale humane dermale voksen fibroblast-celler ble opprettholdt som monolag i minimum essensielt medium (MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) på samme betingelser som er beskrevet ovenfor. Alle celler ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. (FBS, Omega, Tarzana, CA)
Chemicals
Telmisartan, kandesartan, losartan, valsartan ble oppnådd fra LKT Laboratories (St . Paul, MN, USA), og tilberedt som 10 mg /ml lagerløsninger i dimetylsulfoksid (DMSO). GW9662 og troglitazon ble innhentet fra Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA). GW9662 ble fremstilt som en 5 mg /ml stamløsning i dimetyl-formamid. Troglitazon ble fremstilt som en 10 mg /ml stamløsning i DMSO. Aksje løsninger ble lagret som delmengder ved -20 ° C.
Vurdering av celleproliferasjon og celleviabilitet
Cell spredning og levedyktighet ble bestemt i 96-brønners plater med en modifisert metyltiazol tetrazolium (MTT ) analyse ved hjelp av WST-1 (Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland) etter produsentens protokoll. Vi utsådd 5 x 10
3-celler i DMEM supplert med 10% FBS i hver brønn av en 96-brønns flatbunnet mikroplate (Corning, New York, New York) og inkubert natten over dem. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble inkubert i 48 timer med 100 ul av forsøksmedium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av telmisartan, kandesartan, losartan, valsartan. Deretter ble 10 ul WST-1 fargestoff tilsatt til hver brønn, og cellene ble videre inkubert i to timer. Alle forsøkene ble utført i nærvær av 10% FBS. Celleproliferasjon ble evaluert ved å måle absorbansen ved 450 nm. Referanse bølgelengde var 620 nm. Data ble beregnet som forholdet mellom verdiene oppnådd for de telmisartan-behandlede celler til de for de ubehandlede kontrollene.
Anticancer Effekter av Telmisartan via PPARy-avhengige hovedbane
Deretter undersøkte vi funksjon av antitumor effekter av telmisartan gjennom PPARy i HHUA livmorkreftceller in vitro, ved hjelp av en WST-1 analysen med to-dagers eksponering for både telmisartan 10 eller 50 mikrometer og en PPARy antagonist, GW9662, på 10 mikrometer. GW9662 ble anvendt som tidligere beskrevet [14], [15]. Før stimuleringen, podet vi 5 x 10
3 HHUA celler i DMEM supplert med 10% FBS i hver brønn av en 96-brønns flatbunnet mikroplate (Corning, New York, New York) og inkubert natten over dem. HHUA celler ble forbehandlet med GW9662 i 30 min før stimulering av telmisartan.
Måling av apoptose (Flow-cytometri analyse med Annexin V /Propidium jodid-analyse)
Celler ble belagt og dyrket over natten før de nådde 80% samløpet og deretter behandlet med telmisartan. Etter 48 timer ble frigjorte celler i mediet oppsamlet, og de gjenværende adherente celler ble høstet ved trypsinering. Cellene (1 x 10
5) ble vasket med PBS og resuspendert i 500 ul bindingsbuffer (annexin V-fluorescein isotiocyanat [FITC] apoptose deteksjon kit fra BioVision, Palo Alto, CA) inneholdende 5 ul av 50 ug /ml propidiumjodid (PI) og 5 ul av annexin V-FITC, som binder seg til fosfatidylserin translokert til utsiden av cellemembranen tidlig i apoptose så vel som under sent i apoptose. Etter inkubering i 10 minutter ved romtemperatur i en lys-beskyttet område, ble prøvene analysert på et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). FITC og PI-utslippene ble oppdaget i FL-1 og FL-2 kanaler, henholdsvis. For hver prøve, ble data fra 10.000 celler registrert i listemodus på logaritmisk skala. Påfølgende analyse ble utført med Cellquest-programvare (Becton Dickinson).
Mitokondrietransmembranpotensiale
Celler ble utarbeidet for FACS som beskrevet ovenfor, og farges ved hjelp av en Mitocapture apoptose Detection kit fra BioVision med et fluorescerende lipofile kationiske reagens som vurderer mitokondriemembranen permeabilitet, i henhold til produsentens anbefalinger.
caspase-3 og -7 aktiviteter
caspase-3 og -7 er store medlemmer av cystein asparaginsyre-spesifikk protease ( caspase) familie som spiller viktige effektor roller i apoptose i pattedyrceller. Virksomheten til disse caspases ble målt ved hjelp av en caspase-Glo 3/7 analysen kjøpt fra Promega (Madison, WI), i henhold til produsentens anbefalinger.
Enzyme-linked immunosorbent assay
Aktivert kløyvde poly-ADP ribose polymerase (PARP) uttrykk ble beregnet ved hjelp av en Pierce Colorimetric i-Cell ELISA kit (Thermoscientific, Rockford, IL), i henhold til produsentens anbefalinger.
Western blot analyse
Celler ble vasket to ganger i PBS og lysert ved hjelp av M-PER pattedyr protein Ekstraksjonsreagens (Thermoscientific) i henhold til produsentens anbefalinger. Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved hjelp av Pierce 660 nm-proteinanalyse-reagens (Thermoscientific) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Hel-cellelysater (20 ug) ble oppløst ved SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese på 10% -15% geler og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Immobilon, Amersham, Arlington Heights, IL). Membraner ble deretter undersøkt sekvensielt med antistoffer mot BCL-2 (1:1,000; Epitomics, Burlingame, CA), BCL-XL (1:1,000, Cell Signaling Technology), Bax (1:1,000, Cell Signaling Technology), kløyvde caspase- 3 (1:1000, Cell Signaling Technology), og GAPDH (1:10,000; Abcam, Cambridge, UK). Blottene ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence substrat (Western Lightning ECL Pro) kit (PerkinElmer, San Jose, California).
Påvisning av DSB sin etter Puls-feltet Gel elektroforese (PFGE)
Subkonfluente kulturer av HHUA-celler ble behandlet med 10 eller 100 uM telmisartan i 24 timer eller 48 timer. Cellene ble høstet etter trypsinering, og agaroseplugger inneholdende 10
6-celler ble preparert med en kokk engangsplugg form (Bio-Rad, Hercules, CA). Vi inkuberte plugger i lyseringsbuffer (100 mM EDTA, 1% (vekt /volum) natriumlaurylsulfat sarcosyne, 0,2% (vekt /volum) natriumdeoksycholat, 1 mg ml
-1 proteinase K) ved 37 ° C i 24 h og deretter vasket dem med 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM ETDA. Elektroforese ble utført i 23 timer ved 13 ° C gjennom 0,9% agarose i Tris-borat-EDTA-buffer ved anvendelse av en Biometra Rotaphor apparat (Biometra, Goettingen, Tyskland) med følgende parametre: intervall, 30-5 logg; vinkel, 120 ° -110 ° lineær; 180-120 V log). DNA ble farget med etidiumbromid og visualisert ved hjelp av en Typhoon FLA 7000 scanner (GE Healthcare og biovitenskap, Tokyo, Japan). Elektroforese betingelser ble spesielt utviklet for å komprimere lavere molekylvekt DNA-fragmenter (flere MBP til 500 kbp) inn i et enkelt bånd, samtidig som høy molekylvekt genomisk DNA i brønnen. De lavere molekylvekt DNA-fragmenter som er resultatet av DSB sin i det kromosomale DNA. Dermed kan analyse brutt DNA som lett kan påvises. Imidlertid, i sammenheng med DSB som oppstår under DNA-replikasjonen steiling, har analysen begrenset sensitivitet og er ikke kvantitativ. Når et DSB finner sted ved en DNA-replikasjon gaffel, blir den brutte DNA fremdeles er festet til malen kromosom. For å detektere DSB i analysen, to relativt tett (flere MBP) adskilte uavhengige DSB sin måtte forekomme [16], [17].
Immunofluorescent Farging av γ-H2AX
HHUA celler ble behandlet med eller uten telmisartan fiksert i 3,7% paraformaldehyd i 15 minutter, og deretter blokkert med 0,5% BSA i PBS. Cellene ble inkubert med kanin-monoklonalt anti- γ-H2AX antistoff (1:500; Millipore, Billerica, Massachusetts) i 90 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av Alexa488-konjugert anti-kanin-IgG (1:300; Molecular Probes, Carlsbad, CA) i 60 min ved romtemperatur. DAPI ble brukt for kjernen farging. Cellene ble observert ved hjelp av en BZ-9000 (Keyence, Osaka, Japan).
In vivo
DYR Protocol
Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Oita (Permit Number: L029001). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer.
Sixteen seks uker gamle immunodeficient BALB /c-nu /nu hunnmus ble kjøpt fra Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) og vedlikeholdes henhold patogenfrie forhold med bestrålt chow. I ett eksperiment, 5 x 10
6 HHUA celler i 0,1 ml Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) ble bilateralt og injisert subkutant inn i stammene av 16 mus, som fører til dannelse av to tumorer pr dyr. Behandlingen startet på dagen etter injeksjonen av disse humane endometrial carcinoma celler og ble avsluttet etter 7 uker [18]. Gruppene (åtte mus per gruppe) fikk enten fortynningsmiddel bare (kontrollgruppen) eller telmisartan (100 mikrogram per dag) intraperitonealt i 5 dager per uke. Svulstene ble målt hver uke med Vernier calipers. Vi beregnet tumorvolum ved hjelp av følgende formel: volum = lengde × bredde × høyde × 0,5236. Venstre ventrikkel (LV) trykket ble overvåket ved hjelp av en trykktransduser (WS-681G: Nihon Kohden, Tokyo) for å registrere topp positive og negative første-derivater av LV trykk. Data ble analysert ved hjelp LabChart programvare (ADInstruments, Colorado Springs, CO). Dyr ble avlivet ved anestesi natriumpentobarbital, hvoretter imidlertid reseksjon ble utført og tumorvekt ble målt. Svulster ble fiksert og farget for histologisk analyse.
Immunohistochemistry
vevsprøver ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin og innstøpt i parafin før histologisk snitting. Immunhistokjemi studier ble utført på formalin-fikserte deler av vevsprøver. Snittene ble forbehandlet med trypsin (10 mg per 50 ml i Tris-buffer, pH 8,1) i 10 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inkubasjon med anti-Ki-67 monoklonalt antistoff (1:1000 fortynning i PBS; Zymed Laboratories, San Francisco , CA) i 30 min. Objektglassene ble deretter vasket i PBS og inkubert sekvensielt i 15 minutter med peroksidase-konjugert svin anti-mus-immunoglobulin G (1:50 fortynning, Dako, København, Danmark). Farging ble utført ved hjelp av en Dako Autostainer. Lokalisering av reaksjonsprodukter ble utført ved hjelp av diaminobenzidene reaksjon.
Terminal Deoxynucleotidyltransferase-mediert Uridine trifosfat End-merking Analyse
DNA trådbrudd ble identifisert via en terminal deoxynucleotidyltransferase-mediert uridin trifosfat end-merking ( TUNEL) analyse, med en in Situ celledød Detection Kit (Roche) i samsvar med produsentens anvisninger.
Statistical Analysis
Alle forsøkene ble utført uavhengig minst tre ganger i tre eksemplarer per eksperimentell punkt . Alle numeriske data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Betydning ble bestemt ved å gjennomføre en
t
-test med Bonferroni korreksjon. En
P
verdien av 0,05 ble akseptert som betydelig
Resultater
Effekter av Telmisartan på spredning og levedyktighet av livmorkreft cellelinjer
in vitro
Vi undersøkte antitumor effekten av telmisartan, kandesartan, losartan og valsartan på tre livmorkreft cellelinjer in vitro, ved hjelp av en WST-1 analysen med en 2-dagers eksponering for disse ARB. Tre endometrial kreft cellelinjer (Ishikawa, HEC-59, og HHUA) viste signifikant følsomhet for telmisartan behandling på 1-100 mikrometer (Fig. 1 D). Ingen av de andre tre ARB (kandesartan, losartan og valsartan) påvirket levedyktigheten av livmorkreft cellelinjer (Fig. 1A-C). Siden vi funnet at telmisartan kunne hemme proliferasjonen av disse cellelinjer, undersøkte vi funksjonen av antitumor-virkningene av telmisartan gjennom PPARy i HHUA endometrial kreftceller in vitro, ved anvendelse av en WST-1 analysen med 2-dagers eksponering mot både telmisartan ved 10 eller 50 uM og en PPARy-antagonist, GW9662, ved 10 uM. Vi har funnet at tilsetningen av GW9662 inhiberte anticancer effekten av telmisartan 10 eller 50 uM (fig. 1E).
Anticancer virkninger av telmisartan via PPARy-avhengige reaksjonsveien. (A-D) Ishikawa, HEC-59, og HHUA endometrial cancer cellelinjer ble behandlet med telmisartan, kandesartan, losartan eller valsartan i forskjellige konsentrasjoner (1-100 uM) eller bærer (kontroll) i 48 timer, og proliferasjon (% av kontroll) ble målt i en WST-1-assay. Resultatene er midler ± SD av tre uavhengige eksperimenter med tredoble retter. *
P
0,05 vs. kontroll, **
P
0,01 vs. kontroll. (E) Effekt av GW9662 på telmisartan inhibering av HHUA celleproliferasjon. HHUA celler ble inkubert med telmisartan (10 eller 50 uM) i 48 timer fulgt av preinkubering med GW9662 (10 uM) i 30 minutter. Vi har funnet at tilsetningen av GW9662 inhiberte anticancer effekten av telmisartan 10 eller 50 uM. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Kolonner, midler; barer, SDS. *
P
0,05 vs. kontroll, **
P
. 0,01 vs. kontroll
apoptotiske Endringer i livmorkreft celler behandlet med Telmisartan
for å vurdere muligheten for telmisartan å indusere apoptose i kreftceller og til å skille de forskjellige typer celledød, vi dobbel-farget telmisartan-behandlede celler med annexin V og PI og analysert resultatene ved hjelp av flowcytometri. Annexin V binding kombinert med PI merking ble utført for forskjellsbehandling av tidlig apoptotisk (annexin V + /PI-) og sen apoptotisk (annexin V + /PI +) celler [19]. Etter behandlingen av endometrial kreft celler med telmisartan ved 100 uM, vi har oppdaget en samtidig økning i både annexin V + /PI- fraksjon (tidlig apoptotiske) og annexin V + /PI + (sen apoptotiske) subpopulasjoner (tabell 1).
Tap av mitokondrie transmembranpotensiale i respons på behandling med Telmisartan
Tap av mitokondrie transmembrane potensial (MTP) har vist seg å skje før atom kondens og caspaseaktivering, og er knyttet til cytokrom c utgivelse i mange, men ikke alle apoptotiske celler [20]. Behandling av endometrial kreft celler med telmisartan resulterte i en nedgang i MTP (tabell 1).
Effekter av Telmisartan på uttrykk for apoptose-relatert Proteiner
Vi undersøkte effekten av telmisartan på uttrykket av apoptose-relaterte proteiner i livmorkreft cellelinjer ved en Western blot-analyse (fig. 2). Bcl-2-familien av apoptose-regulerende proteiner funksjoner til enten å fremme (Bax, Bad, og Bak) eller inhiberer (Bcl-2, Bcl-xL, og Mcl-1) den apoptotiske respons på et bredt spekter av stimuli, inkludert kjemoterapi og strålebehandling [21]. Telmisartan ved 100 uM i 48 timer minsket ekspresjon av Bcl-2 og Bcl-xL, der spaltes fragmenter av caspase-3 ble påvist (Fig. 2).
HHUA-celler ble behandlet med telmisartan ved 10 eller 100 uM, og cellelysatene ble høstet etter 24 og 48 timer. Et Western blot-analyse ble utført med en serie av antistoffer (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, spaltet caspase-3 og GAPDH). Kontroll celler ble behandlet med bilen alene.
Effekter av Telmisartan på DNA Damage Response og celledød
uttrykk for kløyvet PARP ble undersøkt med ELISA etter behandling av HHUA celler med telmisartan i 48 timer. Telmisartan (100 uM) markert øket nivåene av spaltet PARP i HHUA celler (Fig. 3). For å belyse aktiviteten av effektorer i telmisartan-indusert apoptose, anvendte vi en Caspase-Glo 3/7 Assay, som måler caspase-3 og -7 aktiviteter. Etter behandling av cellene med HHUA telmisartan ved 100 uM i 48 timer, kaspase-3 og -7 aktiviteter ble oppregulert (fig. 4). Vi testet telmisartan-indusert DSB formasjon i HHUA celler. HHUA celler ble behandlet med 10-100 uM telmisartan i 24 eller 48 timer, og DSB ble påvist ved anvendelse av pulset-felt-gel-elektroforese (PFGE). Etter telmisartan behandling ble brutt DNA økte på en doseavhengig måte i HHUA celler (Fig. 5). Deretter utførte vi immunfluorescens farging av γ-H2AX å oppdage DSB sin. De telmisartan-behandlede HHUA celler hadde signifikant høyere nivåer av fluorescens sammenlignet med ubehandlede celler. Som vist i figur 6A, B, ble γ-H2AX oppregulert i HHUA-celler etter inkubasjon med telmisartan ved 10-100 uM i 24 eller 48 timer.
protein ekspresjon av PARP spaltet ble målt ved ELISA. HHUA celler ble behandlet med 100 uM telmisartan i 48 timer. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Kolonner, midler; barer, SDS. **
P
. 0,01 vs. kontroll
Aktivitetene caspase-3 og caspase-7 ble vurdert av caspase-Glo 3/7 analyser. HHUA celler ble behandlet med 100 uM telmisartan i 48 timer. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Kolonner, midler; barer, SDS. **
P
0,01 vs. kontroll
DSB dannelse ble analysert ved PFGE.. HHUA celler samles i agaroseplugger, og deres DNA ble separert etter størrelse på en agarosegel. Under elektroforese benyttede betingelser, forble høy molekylvekt genomisk DNA i brønnen, mens lavere-molekylvekt-DNA-fragmenter (flere MBP til 500 kbp) vandret inn i gelen og ble komprimert til en signalbåndet.
(A) Tid og dose avhengighet av histon H2AX fosforylering av telmisartan. HHUA-celler ble behandlet med 10 eller 100 uM telmisartan for angitte tider etterfulgt av farging ved hjelp av et anti-γ-H2AX antistoff. Deres kjerner ble avslørt av DAPI farging. (B) Prosent av γ-H2AX-positive celler. HHUA-celler ble behandlet med 10 eller 100 uM telmisartan i 24 timer eller 48 timer. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. De telmisartan-behandlede celler hadde signifikant høyere nivåer av fluorescens sammenlignet med ubehandlede celler. Resultater = betyr ± SD av tre uavhengige forsøk. Kolonner, midler; barer, SDS. *
P
0,05 vs. kontroll, **
P
. 0,01 vs. kontroll
Antitumor aktivitet
in vivo
Vi testet evnen av telmisartan for å hemme proliferasjonen av humane HHUA endometriale tumorer i immundefekte mus i løpet av 7 uker av behandlingen. Injeksjonen av HHUA-celler (5 x 10
6) førte til utviklingen av robuste tumorer in vivo. Som vist i figur 7A, administrering av telmisartan bemerkelsesverdig undertrykkes veksten av disse tumorer. Alle behandlingsgruppene hadde signifikant mindre svulster sammenlignet med fortynningsmiddel kontrollgruppene (
P
0,01). Vi målte tumorvolumer ved forskjellige tidspunkter gjennom hele behandlingen, og ved slutten av studien, ble tumorene omhyggelig dissekert og veiet. Funnene med hensyn til vekt parallelt volummålinger (data ikke vist). Tumor vektene var 77% lavere i behandlingsgruppene enn i kontrollgruppen (
P
0,01).
(A) HHUA celler (5 × 10
6) var bilateralt subkutant injisert i badebukser av nakne mus, danner to svulster per mus. Musene ble tilfeldig fordelt i kontrollen og eksperimentelle grupper. Telmisartan (100 ug /mus) eller fortynningsmiddel (kontroll) ble administrert intraperitonealt i 5 dager i uken i 7 uker. Etter 7 ukers behandling, ble tumorene fjernet fra hver mus og veiet. Tumorvektene i de to gruppene var signifikant forskjellige. Kolonner, midler; barer, SDS. **
P
0,01 vs. kontroll. (B) Effekten av telmisartan på HHUA tumorer i nakne mus. Endometrial carcinoma celler fra mus behandlet med telmisartan viste signifikant svakere farging for Ki-67 sammenlignet med kontroll endometrial carcinoma celler. (C) endometrial carcinoma celler fra mus behandlet med telmisartan gjennomgikk apoptose (TUNEL-positiv). Alle analyser ble utført tre ganger. Kolonner, midler; barer, SDS. **
P
. 0,01 vs. kontroll
I løpet av studien ble alle musene veid og deres LV presset ble registrert én gang i uken. Gjennomsnittlig kroppsvekt i behandlingsgruppene var 91% -104% av den gjennomsnittlige kroppsvekt i kontrollgruppen (data ikke vist). Ved baseline LV trykkverdiene var ikke forskjellig mellom gruppene (telmisartan gruppen, 52,8 ± 10,8 mmHg, kontrollgruppen, 52,6 ± 11,0 mmHg) (gjennomsnitt ± SD). En uke etter administrering, var gjennomsnittlig LV trykket av telmisartan gruppen var signifikant lavere enn den til kontrollgruppen (50,4 ± 7,1 mmHg vs. 68,8 ± 13,1 mmHg, henholdsvis;
P
0,01). Ved slutten av studien, LV trykket for kontrollgruppen var 68,8 ± 6,3 mmHg og den til den telmisartan gruppen var 58,0 ± 3,9 mmHg (
P
0,01)
. generelt, på tvers av alle kohortene, alle mus syntes å være sunn. ble ingen signifikante forskjeller i gjennomsnittlig vekt mellom fortynningsmidlet-behandlede mus, og de som mottok 7 uker med behandling (data ikke vist). HHUA tumorer ble prøvetatt for ekspresjon av Ki-67 ved en immunohistokjemisk analyse, og en TUNEL assay ble utført på formalinfikserte, parafininnstøpte seksjoner. De HHUA endometrial carcinoma celler behandlet med telmisartan utstilt negativ eller samlings svak farging for Ki-67 og så ut til å være under apoptose (dvs. de var TUNEL-positive). Kontroll HHUA endometrial carcinoma celler fra ubehandlede mus viste sterke kjerne farging for Ki-67 og var negative for apoptose (Fig. 7B, C).
Diskusjoner
Fedme, overflødig østrogen, type II diabetes og høyt blodtrykk er noen av de viktigste risikofaktorene for livmorkreft [4], [22] – [24]. PPARy tilhører en familie av atomhormonreseptorer som inkluderer østrogen og skjoldbruskkjertel hormon reseptorer [25], [26]
De foreliggende resultatene viste at blant de ARB testet.; bare telmisartan var i stand til å indusere inhibering av cellelevedyktigheten av endometrial cancer-cellelinjer. Den hemmende effekten av telmisartan ble redusert i nærvær av en PPARy-inhibitor, GW9662. Det ble rapportert det er viktig krysstale mellom PPARy og østrogen reseptor [25], [27], [28]. Ota et al. rapporterte at PPARy immunoreaktivitet ble påvist i 65% av endometrialt karsinom vev oppnådd fra pasienter ved immunohistokjemi. De fant også at en PPARy ligand, 15d-PGJ
2, har antiproliferativ aktivitet i livmorkreftceller (Ishikawa, Sawano, RL95-2 celler) [4]. Benson et al. rapporterte at telmisartan fungerte som selektive PPARy partiell agonist, aktivering av reseptoren til 25% til 30% av det maksimale nivå oppnådd ved den fullstendige agonister pioglitazon og rosiglitazon. Andre ARB mangler telmisartan potensial for reseptor-interaksjon og har forholdsvis liten eller ingen virkning på PPARy-aktivitet [7]. Derfor ville det være en mulig mekanisme, har den telmisartan kreft effekter via PPARy-avhengige reaksjonsveien.
Det er også blitt vist at telmisartan apoptose og DNA-fragmentering i humane urologisk kreft [8], [9] , [29]. Her har vi funnet at behandling med telmisartan betydelig økt antall apoptotiske celler i alle endometrial carcinoma cellelinjer studert. I annexin V-analysen og MTP evaluering, telmisartan indusert apoptose i 48 timer behandling ved 100 uM. Denne effekten var assosiert med en reduksjon i nivåene av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-XL. Kaspase 3/7 aktivitet økte også som reaksjon på stimuli av 48 timer telmisartan behandling ved 100 uM. Våre funn angå caspase-3-spalting og PARP-spaltning tyder på at denne apoptosome veien kan aktiveres etter behandling med telmisartan.
En rekke av kaskader av signaleringshendelser blir initiert som respons på DSB, for å utføre apoptose [30] , [31]. Ved hjelp av puls-felt gel elektroforese og immunfluorescens farging av γ-H2AX, fant vi at telmisaratan indusert DSB sin. H2AX er et medlem av familien histon H2A, og fosforyleringen av serin H2AX ved 139, som kalles «γ-H2AX,» er relatert til DSB sin [32] – [35]. En γ-H2AX protein blir ansett for å være de mest kjente proteiner i analyser for å måle den DNA-skade [36]. En DSB er den mest kritiske DNA-skade [37], [38]. Ett DSB er tilstrekkelig til å drepe en celle, når det ikke er reparert [37] – [39]. I den foreliggende undersøkelse, DSB sin forekom i HHUA celler etter 24 timer med 10 uM-telmisartan behandling. I motsetning til dette, Western blotting viste at caspase 3 cleavage var ikke klar etter 24 timer av 10 uM telmisartan behandling i HHUA celler. Disse dataene tyder på at DSB sin kan bli indusert før apoptose med telmisartan behandling.
Våre in vivo data indikerte at apoptose involverer tumorområdet skjedde i det nakne mus behandlet med telmisartan, og dette antitumor aktivitet ble ikke ledsaget av noen store bivirkninger, øke muligheten for at telmisartan kan tjene som en nyttig terapi for behandlingen av endometrial karsinom. Fordi vi startet telmisartan behandling dagen etter ondartede celler ble injisert i mus, kan vi ikke konkludere med at telmisartan er effektiv mot store svulster, som ofte observert i klinisk setting; videre studier er nødvendig for å avklare dette spørsmålet. Likevel fant vi at telmisartan viste dyp antitumor aktivitet in vivo, og vi bekreftet at en liten tumorbyrde kan bli utryddet av denne forbindelsen i mus. Dette funnet tyder på at telmisartan terapi kan være spesielt effektiv for personer som har minimal restsykdom etter kurativ kirurgi, cellegift og /eller strålebehandling. Selv om LV trykket av telmisartan gruppen ble redusert i løpet av disse eksperimenter som av telmisartan gruppen ble ikke endret i syv uker, og alle musene syntes å være sunn (data ikke vist).
mekanismen som telmisartan utøver sin anticancer aktiviteten~~POS=HEADCOMP er fortsatt uklart. I urologiske kreftceller, kan telmisartan megle potente anti-proliferative effekter gjennom PPARy [29]. I prostata kreft celler, telmisartan samhandlet med noen signalveier; en for å blokkere AT1R som en ARB, og den andre som en transkripsjonsfaktor som virker som PPARy ligand med PPARy avhengige og uavhengige interaksjoner [10]. Som andre ARB inhiberer signaltransduksjon gjennom epidermal vekstfaktor (EGF) eller interleukin (IL) -6-signaler, telmisartan hemmer også tilleggssignaler ved PPARy-aktivering [10], [40]. Yamamoto et al.
