Abstract
Redusert følsomhet for prostatakreft (PC) celler til strålebehandling utgjør en betydelig utfordring i klinikken. Aktivering av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), type en insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGF1R), og krysstale mellom de to signalveier har vært implisert i utviklingen av stråling motstand i PC. Denne studien vurderte effekten av målretting både reseptorer på regulering av radio-følsomhet i PC-celler. Spesifikke hemmere av EGFR og IGF1R, Erlotinib og AG1024, samt siRNA rettet mot EGFR og IGF1R, ble brukt til radio-sensitiv PC celler. Våre resultater viste at samtidig hemme både reseptorer betydelig dempet cellevekst og DNA-skade reparasjon, og økt radio-følsomhet i PC-celler. Disse effektene ble gjennomført ved synergistisk inhibering av homolog rekombinasjon-directed DNA-reparasjon (HRR), men ikke via hemming av ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ). Videre ble kompromittert HRR kapasitet skyldes redusert fosforylering av insulinreseptoren substrat 1 (IRS1) og dens etterfølgende interaksjon med Rad51. Den synergistiske virkning av EGFR og IGF1R inhibitorer ble også bekreftet i nakne mus xenograft-analyse. Dette er den første studien testing co-hemmer EGFR og IGF1R signalering i forbindelse med radio-følsomhet i PC, og det kan gi en lovende adjuvant terapeutisk tilnærming for å forbedre utfallet av PC pasienter til strålebehandling
Citation.: Wang Y, Yuan JL, Zhang YT, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Hemming av både EGFR og IGF1R Følsomme prostata kreft celler til Stråling av Synergistic Undertrykkelse av DNA homolog rekombinasjon Repair. PLoS ONE åtte (8): e68784. doi: 10,1371 /journal.pone.0068784
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 21 desember 2012; Godkjent: 02.06.2013; Publisert: 12. august 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiert av tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 30100185, nr 81250036, nr 30973000, nr 30872583, nr 81072116) og Foundation Natural Science of Shaan’xi provinsen (2009JQ4003). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall blant mannlige [1] pasienter. I løpet av kreft progresjon, er den første veksten av PC-celler androgen-avhengige, og disse cellene gjennomgår apoptose ved androgen uttømming. Som en konsekvens, ble androgen ablasjon ansett som standard behandling for PC i over 50 år [2]. Mange pasienter etter hvert utviklet en hormon-refraktær sykdom på grunn av veksten av androgen-ildfast kreftceller, noe som fører til svikt av androgen ablasjon og etterlater pasienter med færre terapeutiske muligheter [3], [4]. Kombinasjonen av definitive lokale terapier, for eksempel radikal prostatektomi sammen med adjuvant strålebehandling, har vist seg å forbedre overlevelsen av PC-pasienter [5], [6]. Imidlertid er en slik terapi utfordret av utvikling av resistens i tumorceller. Det er derfor av stor betydning for å utvikle nye terapeutiske strategier for å overvinne radioresistance og bedre radio-følsomhet ved å målrette molekylære machineries i androgen-uavhengig PC celler.
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og insulin-like growth faktor reseptor (IGF1R), to viktigste tyrosin kinase reseptorer, spiller avgjørende roller i kreftutvikling og progresjon gjennom regulering på celleproliferasjon, apoptose, forankringsuavhengig vekst, invasjon, angiogenese, kreft immunitet og motstand mot kjemoterapi og /eller strålebehandling [7]. Disse to reseptorene er ofte overuttrykt i mange humane kreftformer, inkludert PC [8], [9], [10], og derfor kan brukes som kandidater for målrettet cancerterapi. Faktisk hemmere av EGFR og annen EGFR familiemedlem Her2, inkludert Erlotinib, Lapatinib, Cetuximab og Gefitinib, er de mest suksessrike alternativer i dagens klinisk behandling av forskjellige humane kreftformer, som forventet imidlertid utviklingen av
de novo
resistens har blitt observert i klinikken etter lang tids bruk av disse medisinene, noe som tyder på at det finnes omkjørings mekanismer innenfor kreftceller [11]. Mekanistiske studier på de cellulære og molekylære hendelser viser at omfattende krysstale mellom EGFR og IGF1R signalering skjer på flere nivåer, og at blokkering av EGFR-signalering fører til forbedrede responser til IGF1R ligand, IGF [12], [13]. Disse data antyder at målretting begge reseptorer samtidig kunne gi bedre effektivitet i kreftbehandling og overvinne tumorresistens til et individ inhibitor, mens forbedre følsomheten til de enkelte inhibitorer for kreftterapi. Konsekvent, har studier vist at dual målretting av både reseptorer blokker deres gjensidige hyperfosforylering, hemmer spredning og induserer apoptose i flere kreftceller, inkludert PC og endetarmskreft [14], [15].
I denne studien har vi vurderes virkningene av målretting både EGFR og IGF1R signalering i svarene av PC celler til y-bestråling. Våre data viser styrken av målretting begge veier i modulerende atferd av PC celler etter strålebehandling og avslørte de underliggende mekanismene. Dette er en banebrytende studie som ytterligere rettferdiggjør kombinatorisk bruk av inhibitorer for EGFR og IGF1R trasé i behandlingen av PC.
Materialer og metoder
Cellekultur og behandling
menneskelige androgen-uavhengig PC celler DU145, PC3, ARCaP
E og ARCaP
M og humant normalt prostata epitel cellelinje PREC ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Den R503 var fra Experimental Animal Center for fjerde Military Medical University. Cellene ble behandlet med dimetylsulfoksid (DMSO, som bilen kontroll), 10 mm Erlotinib (EGFR inhbibitor, Eton Bioscience, San Diego, CA) og /eller 10 mm AG1024 (IGF1R inhibitor, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) (som eksperimentelle grupper) i 1 time. Celler ble bestrålt som beskrevet av Liu et al [16]. I noen eksperimenter ble cellene også tilført med IRS1 eller ikke-støydempere kontroll (NSC) sirnas (50 nM, Invitrogen, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens protokoll.
For å etablere bestråling tolerant underlinjer, PC celler ble bestrålt ved 2 Gy per dag, 5 dager i uken i en FCC-8000C
60Co irradiator. Etter seks måneder ble underlinjer av DU145 som overlevde ionisert bestråling etablert og oppkalt DU145-IIRR. Disse underlinjer ble deretter underkastet behandling og ytterligere forsøk.
klonogene assay
Den synergistiske kolonidannelse etter den kombinerte behandling med av EGFR og IGF1-inhibitorer og bestråling ble undersøkt ved monolags klonogene analyser. Celler ble serum-sultet over natten. Fem tusen celler ble sådd inn i 10-cm diameter vevskulturskåler med 10 ml medium. Cellene ble behandlet med AG1024 eller Erlotinib for 1 time og bestrålt ved angitte doseringen etter at de hadde levd opp til rettene. Kolonidannelse ble bestemt ved krystallfiolett farging ved hjelp av en Coulter partikkelteller på dag 10 etter såing celle. Overlevende fraksjon ble definert som kloningseffektiviteten av de behandlede celler dividert med den for kontrollcellene. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Flowcytometri analyse
For å analysere celle apoptose, celler (1 x 10
4 /brønn) ble sådd ut på seks-brønns plater. Etter 24 timer ble cellene serum sultet i 24 timer, og deretter behandlet med enten AG1024 eller erlotinib i 1 time. Celler ble deretter bestrålt ved dosering av 2 Gy. Ved 4 timer etter bestråling ble cellene høstet ved trypsinering, fiksert i 70% etanol ved 4 ° C i 2 timer og vasket i 5 ml PBS. Cellene ble deretter farget med 1 ml propidiumjodid (PI) løsning (0,2 mg av RNAse A, 0,02 mg PI, og 1 ml Triton X-100). DNA-innhold i forskjellige cellesyklusfaser ble bestemt ved FACS-strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). For å detektere apoptotisk hastighet i behandlede celler, ble cellene farget med Annexin V og PI, og deretter underkastet strømningscytometri, som beskrevet [16]. De Annexin V-positive og PI-negative celler som gjennomgår tidlig apoptose ble regnet som apoptotiske celler. Alle forsøkene ble utført i duplikater og data som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Protein utvinning og Western blotting
Ulike grupper av celler ble lysert med 1% SDS lysebuffer (Beyotime Inc., Beijing, Kina). For kjerneprotein ekstraksjon, ble cellene vasket med hypoton lyseringsbuffer (Teknova, Beijing, Kina), og dounced i cellen douncer (Wheaton Ltd, Millville, NJ). De nukleære komponenter ble deretter separert fra cytosoliske ekstrakter ved sentrifugering, etterfulgt av lysis i RIPA-buffer (Pierce Inc., Beijing, Kina).
Immunutfelling og Western-blot-analyse ble utført som beskrevet av Liu et al [17 ]. Følgende antistoffene var fra Cell Signaling: anti-γH2AX, anti-IRS1, anti-fosfor IRS1 (pY612), anti-IGF1R, anti-fosfor IGF1R, anti-EGFR, anti-fosfor EGFR (Y1068), anti-β-tubulin , anti-ERK, anti-fosfo-ERK, anti-AKT, anti-fosfo AKT (S473), anti-DNA-PK, anti-Ku70, anti-Ku80, og anti-XRCC4. Den anti-Lamin antistoff var fra Abnova (Shanghai, Kina). Den anti-HP-1α antistoff var fra Millipore (Shanghai, Kina). β-tubulin, Lamin og HP-1α ble brukt som laste kontroller.
immunfluorescens
γH2AX og Rad51 foci formasjonen ble undersøkt i henhold til Barber et al [18]. For immunfluorescens farging for γH2AX og Rad51 ble cellene fiksert i 1% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 70% etanol i 10 minutter ved romtemperatur. Etter vask med PBS inneholdende 0,1% Triton i 10 minutter, ble cellene permeabilisert med 0,5% Triton i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Etter tre vaskinger i PBS ble cellene blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 min. Deretter anti-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) eller anti-Rad51 antistoff (Oncogene forskning, 1:300) ble tilsatt i 5% BSA i PBS og inkubert med cellene ved 4 ° C over natten med forsiktig risting. Etter fire vaskinger i PBS ble cellene inkubert i mørket med et FITC-merket sekundært antistoff i 5% BSA ved en fortynning på 1:2000 for γH2AX og 1:200 for anti-Rad51 deteksjon i 1 time ved romtemperatur. Etter fire vaskinger i PBS ble kjernene farget i mørket med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 pg /ml, Invitrogen) i PBS i 5 min, og dekkglassene ble montert med Fluoromount G ( Southern Biotech., Birmingham, AL). Slides ble undersøkt på en Leica fluorescens mikroskop, med bilder tatt av en CCD-kamera og importert til Advanced SPOT Bildeanalyse programvare (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). For hver behandling tilstand, ble γH2AX eller Rad51 signaler bestemmes i minst 50 celler. Alle observasjoner ble validert fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Analyser for HR-rettet DNA-reparasjon (HRR) og den ikke-homolog ende bli (NHEJ)
Den kvantitative
in vitro
homolog rekombinasjon (HR) analysen ble utført ved anvendelse av PDR-GFP rekombinasjon reporter system [19]. Kort, PDR-GFP plasmid som uttrykker to ikke-funksjonelle GFP gener ble stabilt transfektert inn DU145 cellene. Et annet plasmid som koder for restriksjonsenzymet I SCE-I og en tredje plasmid som uttrykker rød fluorescerende protein (RFP) med en mitokondriell lokaliseringssignal for å indikere transfeksjonseffektivitet ble transient transfektert inn i celler som inneholder DU145 PDR-GFP plasmid. Når I-SCEI ble uttrykt, det produserte DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) innenfor SceGFP fragment og stimulert HRR å gjenopprette intakt GFP-genet. DNA reparasjon av HRR ble bedømt ved telling av celler med begge kjerne GFP signal og mitokondrielle RFP signal vs. alle positivt transfekterte celler, det vil si forholdet mellom celler med både røde og grønne signaler til de med bare røde signaler.
cellen frie NHEJ analysen ble utført som beskrevet tidligere [20] med atom utdrag fra 1 × 10
7 DU145 cellene.
In vivo
tumor strålebehandling
de dyreforsøk ble godkjent av etnisk komité for fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). 5 x 10
6 DU145-celler ble forhåndsblandet med Matrigel (BD Biosciences) for subkutan injeksjon i flanken av 10 uker gamle hunn nakne mus. Tjueto dager senere (dag 0), ble musene tilfeldig delt inn i 5 grupper, fem mus per gruppe, basert på behandlinger de vil motta: dvs. fikk kontrollgruppen ingen behandlinger; IR-gruppen mottok γ-bestråling av forskjellige doser på dagene 3, 6, 8 og 10, henholdsvis; IR + Erlotinib gruppen mottok γ-bestråling som bestrålings gruppe i tillegg til 100 mg /kg /d av oral erlotinib i 10 dager; IR + AG1024 gruppen fikk γ-bestråling, plus100 mg /kg /d av oral AG1024 for 10 dager; IR + AG1024 og Erlotinib mottatt γ-bestråling, pluss 100 mg /kg /d begge legemidler for 10 dager. Svulsten volum (V) ble overvåket hver tredje dag i syv uker ved å måle lengden (L) og bredde (W), og beregnes som V = 0,5 × L × B
2. Resultatet ble uttrykt som spredning indeks (PI, PI = V behandling /V-kontroll).
Statistisk analyse
Effekten av Erlotinib og AG1024 på hemming av celleproliferasjon, xenograft vekst, klonogene overlevelse og caspaseaktivering ble analysert statistisk ved hjelp av en uparet tosidige Student
t
test. Alle kvantitative data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter for
in vitro
eksperimenter eller fra alle dyr i gruppen for
in vivo
eksperimenter. P-verdien av ≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant. * Og ** er merket for P 0,05 og P . Henholdsvis 0,01, sammenlignet med kontrollceller i alle figurene
Resultatene
Reduksjon av tumorcellelevedyktighet og induksjon av apoptose etter målretting av EGFR og /eller IGF1R før bestråling behandling
i denne studien, må vi først vurderte indusert følsomhet for ulike kreftceller for stråling
in vitro
. Vi vokste og behandlet ulike kreftcellelinjer med Erlotinib (10 mm) og /eller AG1024 (10 mm) for 1 time og deretter bestrålt dem med 2 Gy. Våre data viser at tumorcellelevedyktighet ble signifikant redusert, og tumorcelle-apoptose forsterkes ved bestråling etter hemming av både EGFR og IGF1R, i forhold til bestrålingsbehandling alene eller bestråling pluss blokkering av enten reseptoren (figur 1 A, B). Nærmere bestemt, når sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller, enten AG1024 eller erlotinib vesentlig redusert tumorcellelevedyktighet i epitel-PC-cellelinjer (P 0,05), men den mest robuste vekst-inhibitorisk effekt ved bestråling ble oppnådd ved samtidig anvendelse av begge inhibitorer (P 0,05, sammenlignet med AG1024 eller erlotinib behandling i DU145, PC3 og ARCaP
E-celler) (figur 1A). I kontrast, AG1024 og /eller Erlotinib kunne ikke radio-bevisst normal prostata epitel cellelinje PREC (figur 1A). Våre data viser også at det i både DU145 og PC3-celler, AG1024 betydelig redusert fosforylering av IGF1R, mens erlotinib dramatisk inhiberte fosforylering av EGFR, og heller ikke viser kryssaktivitet på den andre reseptoren, noe som indikerer at begge inhibitorer fungere potent og spesielt (figur S1).
A, Radio-følsomhet analyse av celler behandlet med EGFR og IGF1R hemmere. Kreftceller fra forskjellige grupper ble behandlet uten (kontroll) eller med AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge i 1 time og deretter utsatt for radio-følsomhet klonogene analysen. Etter 10 dager ble klonene fiksert og farget. Gjenlevende fraksjonen ble beregnet i henhold til kimtall og platekledning effektivitet. B, Radio-følsomhet analyse av celler behandlet med EGFR og IGF1R sirnas. Celler av forskjellige grupper ble transfektert med ikke-tie kontroll siRNA (NSC-siRNA), EGFR og /eller IGF1R siRNA, og deretter utsatt for radio-følsomhet klonogene analyse som beskrevet i panel A. C, apoptose av celler behandlet med EGFR og IGF1R inhibitorer. Prostatakreftcellelinjer ble forbehandlet med AG1024 eller erlotinib ved indikerte konsentrasjoner i 1 time, og deretter bestrålt i 2 Gy. Etter 4 timer, ble de farget med Annexin V og propidiumjodid for strømningscytometri for å bestemme andelen av apoptotiske celler. D, apoptose av prostata kreft cellelinjer transfektert med EGFR og /eller IGF1R siRNA. Celler av forskjellige grupper ble transient transfektert med NSC siRNA, IGF1R siRNA eller EGFR siRNA i 24 timer, og deretter bestrålt for 2 Gy. Apoptose ble analysert som i panel C. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med kontrollcellene
I tillegg epitelceller PC celler, vi også vurdert effekten av målretting både EGFR og IGF1R signalering i radio-allergi respons. av mesenchymale-lignende PC celler. For dette formål har vi brukt ARCaP
M, idet mesenchymale motstykke av ARCaP
E utviklet av Graham et al [21]. Begge cellelinjer utviser minimal uttrykk for androgen reseptor [22]. I samsvar med tidligere funn av Buck et al [14], kombinert behandling med EGFR og IGF1R hemmere kunne ikke synergi hemmer mesenchymale cellevekst som følge av bestråling, som det gjorde for epithelial vekst (figur 1A).
For å unngå de ikke-spesifikke effekter assosiert med små molekylære inhibitorer, vi også gjentok eksperimentet i figur 1A ved hjelp av siRNA spesifikk for EGFR og IGF1R (figur 1B). Som vist i fig S2, både siRNA arbeidet effektivt i banket ned IGF1R og EGFR, respektivt. Med enkel eller dobbel knockdown av EGFR og /eller IGF1R av siRNA, vi oppnådd lignende resultater som i figur 1A (figur 1B).
Neste, vi preget de potensielle apoptotiske effektene av disse to hemmere ved hjelp av flowcytometri analyse. Som vist i figur 1C, DU145, PC3 og ARCaP
E celler viste forbedret radio-følsomhet følgende økende doser av AG1024 og /eller Erlotinib, mens ARCaP
M var bare følsom for AG1024, men ikke til Erlotinib. Kombinert behandling med Erlotinib og AG1024 synergi radio-bevisst DU145, PC3 og ARCaP
E-celler, men ikke ARCaP
M celler. Når man sammenligner DU145 cellene til PC3 celler, fant vi at det tidligere er mer følsomme for Erlotinib enn sistnevnte, gitt at 10 mm Erlotinib induserte en robust apoptotisk respons over en mikrometer Erlotinib i DU145 cellene, mens ikke mye økning i apoptose ble observert i PC3 celler ved de samme doser av erlotinib. Lignende resultater ble også oppnådd med siRNA rettet mot EGFR og /eller IGF1R (figur 1D).
Forbedring av radio-følsomhet av EGFR og IGF1R hemmere ved forringelse av DNA DSB reparere
For å forstå den molekylære mekanismene bak forbedret radiosensitivitet av kreftceller i respons til AG1024 og /eller erlotinib behandling, bestemt vi kapasiteten av DNA dobbel tråd pause (DSB) i DU145 og PC3-celler, ettersom DSB utøver de mest dødelige effekt på celler indusert ved γ -irradiation. Ved å overvåke nivået av histon-protein H2AX fosforylering på den C-terminale serin 139 rest, også kjent som γH2AX, et velkjent og følsom DSB markør, vi viste at det var en hurtig og robust fosforylering av H2AX ved 1 time etter bestråling i både kjøretøy-behandlet kontroll DU145 og PC3 celler (Figur 2A), som raskt gikk ned på 4 timer, og returnerte til basalnivået på 24 timer, noe som tyder på gjennomføring av DSB reparasjon. I motsetning til tumorceller forbehandlet med AG1024, erlotinib, eller begge viste en forsinket H2AX fosforylering topp ved 4 timer, og kontinuerlig H2AX fosforylering til 24 timer etter bestråling, noe som tyder på svekkelse av DSB reparasjon etter AG1024 og erlotinib behandling (Figur 2A, B ). Dessuten var det en betydelig forskjell mellom AG1024 + Erlotinib gruppe og AG1024 eller Erlotinib gruppe (5 og 10 Gy, P 0,01), noe som indikerer en additiv effekt av co-inhibtion på DSB reparasjonsprosessen (figur 2B)
A, DSB markør γH2AX uttrykk tidsforløp etter bestråling: Celler ble serumsultede over natten, deretter behandlet med 10 mm AG1024 og /eller 10 mikrometer Erlotinib. Western-blot av cellene bestrålt ved dosering av 2 Gy, og høstet ved de indikerte tidspunkter. HP-1α protein ble anvendt som en kontroll lasting. Dataene ble deretter kvantifisert ved bilde J programvare og uttrykt som prosent av kontrollen. B, Immunofluorescensanalyse påvisning av γH2AX foci formasjon etter bestråling. Cellene ble behandlet med eller uten AG1024 og /eller erlotinib i 1 time, og bestrålt ved forskjellige doser. Cellene ble fiksert etter 24 timer. De innfellinger viser representative bilder med grønn γH2AX signal og blå DAPI atom farging. C, DSB reparasjon analyse for HRR. Serum-sultet DU145-celler i fravær eller nærvær av AG1024 (10 uM) eller erlotinib (10 pM) ble transient transfektert med to vektorer, en som uttrykker I-SCEI cDNA for å generere DSB sin av GFP-cDNA, og et annet uttrykk for rødt fluorescerende protein med en mitokondriell lokaliseringssignal for å indikere transfeksjon effektivitet. DNA reparasjon av HRR ble evaluert ved forholdet mellom celler med både røde og grønne signaler til de med bare røde signaler. De innfellinger viser representative bilder av celler positive og negative for HRR. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av prosentandelen av celler som var positive for DNA-reparasjon av HRR fra tre uavhengige eksperimenter. D, DSB reparasjon analyse for NHEJ. DU145-celler forbehandlet med eller uten AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge deler. Tilsvarende nukleære ekstrakter ble inkubert med det lineariserte plasmid pBluscript KS (+) i et cellefritt system for å måle NHEJ. Det lineariserte plasmid-DNA uten behandling med de nukleære ekstrakter (DNA bare) og den kjernefysiske ekstrakt fra kontrollceller uten plasmidet (atom ekstrakt only) ble anvendt for den negative kontroll. Nuclear ekstrakt fra R503 fibroblaster ble anvendt som en positiv kontroll. Pilene viser posisjonene til linearisert plasmid og dimer. E, Vest-blot analyse påvise NHEJ relatert protein. DU145-celler forbehandlet med eller uten AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge deler, og deretter bestrålt i NHEJ-relaterte kjerneprotein (DNAPK, K70 /80, XRCC4). Lamin ble anvendt som en kontroll lasting. * P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med kontrollcellene
Effekter av EGFR og IGF1R hemmere om nedskrivning av DSB reparere gjennom hemming av HRR, men ikke fra NHEJ
.
for å skille om svekket DSB reparasjon skyldtes en feil i HRR eller NHEJ, de to store trasé for DSB reparasjon, vi kvantitativt vurdert HRR med PDR-GFP rekombinasjon reporter, og vurdert NHEJ å bruke en
in vitro
cellefritt assay [20]. Som vist i figur 2C, for DU145-celler, kombinert behandling med AG1024 og Erlotinib er en potent redusert HRR nivå sammenlignet med bærerkontrollen eller hvert middel alene (P 0,05). I motsetning til dette atom ekstraktet behandlet med individuell inhibitor eller begge var ute av stand til å endre
in vitro
ligering av pBluescript KS (+), sammenlignet med den kjernefysiske ekstrakt fra kjøretøyet kontrollceller (figur 2D). For denne analyse ble den kjernefysiske ekstrakt fra R503 celler anvendt som den positive kontrollen, som demonstrert av Yang et al [23]. I tillegg uttrykk for NHEJ-relaterte DNA reparasjonsproteiner, inkludert DNA-PK, Ku70, Ku80 og XRCC4, ikke ble påvirket av AG1024, Erlotinib eller både i DU145 celler (figur 2E), noe som tyder på at hemming av disse to signalveier ikke svekke NHEJ-initierte DNA DSB reparasjon, en av de vanligste formene for DSB reparasjon i pattedyrceller.
Undertrykkelse av signal crosstalk på flere nivåer ved å hemme både EGFR og IGF1R
Tidligere studier avdekket omfattende crosstalk mellom EGFR og IGF1R signalveien på flere nivåer [14]. Våre data ovenfor har vist at co-hemming av EGFR og IGF1R kunne additivt radio-bevisst PC cellene gjennom nedskrivning av HRR DSB reparasjon. For ytterligere å undersøke hvordan samspillet mellom de to reseptorene påvirker DSB reparasjon, utførte vi immunoprecipitation-vestlig blot å undersøke fysisk interaksjon mellom EGFR og IGF1R i DU145 og PC3 celler etter γ-bestråling. Våre data viser at uten bestråling, disse to reseptorene interaksjon med hverandre i begge tumorcellelinjer, og at denne sammenheng ble ikke signifikant endret ved 24 timer etter bestråling (figur 3A). Videre bestemmes vi nedstrøms signal transduksjon av en reseptor som respons på liganden av den andre reseptoren. Som vist i figur 3B, for DU145 og PC3-celler, fosforylering av EGFR ble øket på en doseavhengig måte til IGF-I-behandling i begge celler, men var signifikant redusert ved samtidig behandling med EGFR-inhibitor, erlotinib. Tilsvarende, fosforylering av IRS1, den store IGF1R signalmolekyl, ble forbedret etter behandling med økende konsentrasjoner av EGF, men ble hemmet etter tilsetning av AG1024 (figur 3C). I tillegg har vi funnet at liganden for hver reseptor, dvs. IGF-I og EGF, var tilstrekkelig til å aktivere disse målgener i DU145 og PC3-celler. Imidlertid er det mest robuste aktivering ble oppnådd ved samtidig behandling med både IGF-I og EGF, mens blokkering av disse reseptorene signalanlegg med enten AG1024 eller erlotinib var i stand til å redusere aktiveringen av disse målgener, men den mest potente reduksjon ble observert i DU145 og PC3 celler forbehandlet med begge hemmere (Figur 3D). Disse dataene antyder at samtidig behandling med EGFR og IGF1R hemmere var i stand til å undertrykke sin crosstalk og i sin tur blokkere deres nedstrøms signalering, inkludert PI3K /AKT sti og MAPK veien.
A, Immunpresipitasjon detektere EGFR /IGF1R interaksjon. DU145 og PC3-celler ble bestrålt ved en dose på 2 Gy. Deretter cellulære proteiner ble ekstrahert og underkastet immunutfelling assay detektering av EGFR og IGF1R interaksjon. B, aktiverer IGF-I EGFR i DU145 og PC3-celler. Celler ble serum-sultet over natten, og deretter utsatt for IGF-I stimulering i 30 minutter. EGFR fosforylering ble oppdaget av Western blot. C, aktiverer EGF IRS1, den avgjørende faktoren for IGF1R signalveien i DU145 og PC3 celler. Celler ble serum-sultet over natten, og deretter utsatt for EGF-stimulering i 30 minutter. IRS1 fosforylering ble oppdaget av Western blot. D, MAPK eller AKT aktivering etter EGFR og IGF1R simulering av hemming. DU145 og PC3 cellene ble behandlet med eller uten AG1024 (10 mm), Erlotinib (10 mm), AG1024 pluss Erlotinib; IGF (50 ng /ml), EGF (50 ng /ml), eller EGF pluss IGF i 30 minutter. Deretter ERK1 /2 uttrykk og phosphrylation, AKT uttrykk og phosphrylation, IRS1 uttrykk og phosphrylation ble bestemt ved Western blotting. β-tubulin ble brukt som en lasting kontroll.
Effekter av EGFR og IGF1R hemmere om undertrykkelse av IRS1 /Rad51-mediert homolog rekombinasjon
Vår nåværende data på AG1024 og Erlotinib regulere IRS1 fosforylering /aktivering innblandet potensialet involvering av IRS1 /Rad51-mediert HRR svar på y-bestråling i PC-celler, som tidligere studie viste også [24]. Faktisk våre data viste at IRS1 fosforylering ble indusert ved γ-bestråling med maksimal aktivering oppnås ved 4 timer etter γ-bestråling i DU145 og PC3-celler, mens toppen av IRS1 fosforylering ble forsinket til 8 timer etter γ-bestråling etter behandling med AG1024 eller Erlotinib alene. I kontrast, samtidig behandling med både AG1024 og Erlotinib betydelig redusert IRS1 aktivisering ikke bare på basalnivået (0 timer etter bestråling), men også til enhver tid peker opp til 24 timer etter bestråling (Figur 4A).
A, Western blot som viser nivået av p-IRS1 ved forskjellige tidspunkter etter 2 Gy γ-bestråling av DU145 og PC3-celler forbehandlet med eller uten AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM), eller begge deler i 24 timer. β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Representanten gel Bildet vises på toppen og kvantifisering p-IRS1 /β-tubulin-forholdet fra tre uavhengige eksperimenter vist i bunnen. B, Immunpresipitasjon viser samspillet mellom IRS1 og Rad51 i atom ekstrakt av DU145 og PC3 celler. C, Dannelse av nuclear Rad51 foci som analysert ved hjelp av immunofluorescens farging. DU145 og PC3 cellene ble opprettholdt med eller uten AG1024 (10 mm), Erlotinib (10 mm) eller begge (venstre fire søyler), mock-transfektert (pseudotreated), eller transfektert med uspesifikk kontroll siRNA (NSC siRNA) eller med IRS1 siRNA (høyre tre søyler). De innfellinger viser representative bilder med grønn Rad51 signal og blå DAPI atom farging. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med AG1024 /Erlotinib- behandlede eller pseudotreated celler; ** P 0,01, sammenlignet med AG1024- eller erlotinib-behandlede celler. D, Rad51 immunfluorescens farging av DU145 og PC3 celler behandlet med LY292004, PD98059, eller Erlotinib fulgt av γ-bestråling. Atom Rad51 foci dannelse ble bestemt i det samme som i C. innfellinger viser representative bilder med grønn Rad51 signal og blå DAPI atom farging. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05, sammenlignet med de bestråles kun celler
Deretter vi bestemt fysisk interaksjon mellom IRS1 og Rad51 i den kjernefysiske brøkdel av celler fulgt γ-bestråling hjelp immunoprecipitation. Som vist i figur 4B, behandling med kjøretøy, AG1024, Erlotinib eller AG1024 pluss Erlotinib ikke signifikant endring nivåer av IRS1 eller Rad51 protein, mens nivåene av IRS1-assosiert med Rad51 ble dramatisk redusert i celler behandlet med AG1024 pluss Erlotinib, som er konsistent med vesentlig redusert nivå av fosfo-IRS1 i disse celler. Disse dataene viste at AG1024 pluss Erlotinib behandling trykt IRS1 samspill med Rad51, noe som indikerer EGFR og IGF1R co-hemming kan hemme DNA dobbel tråd pause reparasjon av hemming av HRR.
I tillegg har vi også bestemt subcellulære lokalisering av Rad51 som danner kjernefysisk foci i områder av DNA-lesjoner. Våre data viser at ca. 15% av vehikkelbehandlede kontrollcellene var positive for Rad51 foci etter eksponering for y-bestråling.
