Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreftdødelighet i verden i dag . Selv om noen fremskritt i kreftbehandling lunge har blitt gjort, er pasientens overlevelse fortsatt dårlig. MicroRNAs (mirnas) kan fungere som onkogener eller tumor-suppressor gener i menneske malignitet. Mir-34-familien består av tumor-undertrykkende mirnas, og den reduserte uttrykket har blitt rapportert i ulike kreftformer, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I denne studien fant vi at MIR-34a og MIR-34C target platelet-derived growth factor receptor alpha og beta (PDGFR-α og PDGFR-β), celleoverflate tyrosin kinase reseptorer som induserer spredning, migrasjon og invasjon i kreft. MiR-34a og MIR-34C ble nedregulert i lungesvulster i forhold til normalt vev. Videre har vi identifisert en invers korrelasjon mellom PDGFR-α /β og MIR-34a /c-ekspresjon i lungen tumorprøver. Til slutt, MIR-34a /c overekspresjon eller nedregulering av PDGFR-α /β ved sirnas, sterkt utvidet respons på TNF-relatert apoptose induserende ligand (TRAIL) og samtidig redusere vandrende og invasiv kapasitet av NSCLC-celler.
Citation : Garofalo M, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. (2013) MiR-34a /c-Dependent PDGFR-α /β Nedregulering hemmer tumordannelse og forbedrer TRAIL-indusert apoptose i lungekreft. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10,1371 /journal.pone.0067581
Redaktør: Noriko Gotoh, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan
mottatt: 10 november 2012; Godkjent: 23 mai 2013; Publisert: 21 juni 2013
Copyright: © 2013 Garofalo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health CA152758. Forfatterne er takknemlige for forskning støtte fra Ohio State University målrettet investering i Excellence Award. MG er en mottaker av Kimmel Scholar Award 2011. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. GJN er ansatt i Fylogeni , Inc. Det er ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød på verdensbasis [1]. Til tross for mange års forskning, prognosen for pasienter med lungekreft er fortsatt dystre. Den mest hyppige typen, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) (85%), viser en samlet fem års overlevelse på 15%. Isoformer av blodplate-avledet vekstfaktor reseptor (PDGFR) og dens ligand, PDGF, utgjør en familie av reseptorer og ligander som er involvert i proliferative og prosurvival signalering i cellene. Den PDGFR /PDGF-systemet innbefatter to reseptorer (PDGFR-alfa og PDGFR-p) og fire ligander (PDGFA, PDGFB, PDGFC, og PDGFD). Ligandbinding induserer reseptordimerisering, slik autofosforylering av spesifikke tyrosinrester og påfølgende rekruttering av en rekke signaloverførings molekyler. PDGFR regulerer normal cellevekst og differensiering [2] og ekspresjon av aktivert PDGFR fremmer onkogen transformasjon [3]. Tallrike
in vitro Hotell og
in vivo
studier viste at hemming av PDGFR-α signale forstyrrer kreft celle overlevelse i undergruppe av gastrointestinal stromal tumor (GIST) med aktive PDGFR-α mutasjoner [4, 5]. I en fersk studie av 150 NSCLC pasientprøver, aktivert PDGFR-α ble påvist i 13% av tilfellene [6], noe som tyder på at en undergruppe av disse pasientene kan ha nytte av behandling rettet mot PDGFR-α. Dessuten har PDGFR-α overekspresjon blitt observert i metastatisk versus ikke-meta medulloblastoma pasientprøver og forstyrre PDGFR-α-funksjonen hemmet metastatisk potensial for medulloblastoma celler in vitro [7]. På grunn av dets progrowth rolle i cellesignalisering, har PDGFR-α blitt et attraktivt terapeutisk mål i en rekke humane maligniteter. I ikke-småcellet lungekreft, er cytoplasma PDGFR-α uttrykk ved svulst en negativ prognostisk indikator [8], som bekrefter at PDGF akse kan være biologisk relevant. Alle medlemmer av PDGF familien skjermen potent angiogen aktivitet
in vivo
, og fra dette synspunkt, PDGF-B /PDGFRp aksen var den mest omfattende evaluert. I null-mus ble det vist at PDGF-B og PDGFRp er kritisk involvert i vaskulær utvikling. Rollen PDGF /PDGFR i vaskulær utvikling er støttet av knockout eksperimenter [9,10]. MicroRNAs (mirnas), en klasse av ~ 22 nt endogene RNA, er viktige regulatorer av genekspresjon og har vært implisert i regulering av kritiske prosesser som deregulerte i kreftceller, som proliferasjon [11] differensiering [12] og apoptose [13 ]. Endringer i miRNA uttrykket i kreft er dokumentert i en rekke studier og foreslår at mirnas kritisk bidra til kreftcellen fenotype [14,15]. Videre har enkelte miRNA-kodende gener blitt klassifisert som onkogene eller tumorundertrykkende gener i henhold til deres funksjon i cellulær transformasjon og endret ekspresjon i tumorer.
I 2007 rapporter fra flere laboratorier har vist at medlemmer av MIR-34 familien er direkte p53 mål, og at deres oppregulering indusert apoptose og cellesyklus arrest [16,17]. I pattedyr omfatter MIR-34 familien tre bearbeidet mirnas som er kodet av to forskjellige gener: MIR-34a er kodet av sin egen avskrift, mens MIR-34b og MIR-34c deler en felles primær transkripsjon. Videre arrangøren regionen MIR-34a, MIR-34b og MIR-34c inneholder CpG øyer og avvikende CpG metylering reduserer MIR-34 familien uttrykk i flere typer kreft [18,19,20].
I denne studien, viser vi at MIR-34a og MIR-34C, er sterkt nedregulert i NSCLC celler og lungesvulster, mens de er sterkt uttrykt i normale lunge vev. Videre MIR-34a og MIR-34C, ved å målrette PDGFR-α og PDGFR-β, øke TRAIL-indusert apoptose og redusere invasivitet av lungekreft celler. Videre tyder våre resultater, for første gang, at combinatory behandling av TRAIL og PDGFR hemmere kan være effektive for anti-NSCLC behandling.
Resultater
MiR-34a og MIR-34C mål PDGFR -α og PDGFR-β 3 «UTR
Blant mirnas, MIR-34 familiemedlemmer spiller viktige kreft undertrykkende roller, som de er direkte regulert av p53 og komponere p53 nettverk [16,17]. En tidligere studie viste at Mir-34 metylering var til stede i NSCLC og var signifikant relatert til en ugunstig klinisk utfall [20]. Først analyserte vi av Real Time PCR (QRT-PCR) MIR-34a, -34b og -34c uttrykk i 5 forskjellige NSCLC cellelinjer med p53 WT, mutant eller null (Figur S1 A i File S1). MiR-34a, -34b og -34c hatt lav eller fraværende uttrykk i alle de fem cellelinjer (figur S1b i File S1). For å identifisere MIR-34a, -34b, og -34c mål, utførte vi en bioinformatikk søk (Targetscan, Pictar) for mulige mRNA mål. Blant søker mål, 3 «UTR av menneskelig PDGFR-α og PDGFR-β inneholdt regioner (PDGFR-a nukleotider 2670-2676, 2699-2705, PDGFR-beta nukleotider 1535-1541) som passet frøet sekvensene av HSA-speil 34a, -34b og -34c (Figur 1a). PDGFR-α og PDGFR-β har blitt rapportert å være overuttrykt og relatert til dårlig resultat i lungekreft [21]. For å kontrollere om PDGFR-α og PDGFR-β var direkte mål av MIR-34a, -34b og -34c, PDGFR-α 3 «UTR, som inneholder to MIR-34a, -34b og -34c bindingsseter og PDGFR-β 3» UTR, inneholdende en MIR-34a, -34b -34c og bindingssete (figur 1a, b), ble klonet nedstrøms for luciferase-åpne leseramme. Interessant, økt ekspresjon av MIR-34a og MIR-34C, og ikke MIR-34b, ved transfeksjon, bekreftet ved QRT-PCR (data ikke vist), redusert betraktelig luciferase-aktivitet, noe som indikerer en direkte interaksjon mellom mirnas og PDGFRα og PDGFRp 3 «UTR (Figur 1c, d). Target gen undertrykkelse ble reddet av mutasjoner i de komplementære frø områder (Figur 1b, c, d). Til sammen tyder resultatene på at Mir-34a og MIR-34c og ikke Mir-34b direkte rettet mot PDGFR-α og PDGFR-β.
(a) PDGFR-a og PDGFR-beta 3 «UTR inneholde henholdsvis to og en spådd MIR-34a, -34b og -34c bindingssteder. I figuren er vist justeringen av frø regioner av MIR-34a /c med PDGFR-α og PDGFR-β 3 «UTR. Nettstedene til målet mutagenese er merket med rødt. _deleted nukleotider. (B) PGL3 kontroll-PDGFR-a konstruksjoner som inneholder to PDGFR-a bindingsseter (i rødt). Delesjon av ett av de to PDGFR-alfa-setene ble brukt til å generere de mutante luciferase palsmids. (C-d) PDGFR-α og PDGFR-β 3 «UTR er direkte mål av MIR-34a og MIR-34C. pGL3-PDGFR-alfa og pGL3-PDGFR-β luciferase konstruksjoner, som inneholder en vill-type (venstre side av histogrammer), eller mutert (høyre side av histogrammer) PDGFR-α og PDGFR-β 3 «UTR, ble transfektert inn i Calu -6 celler. Relativ undertrykkelse av ildflue luciferase uttrykk ble standardisert til en transfeksjon kontroll. Rapportør ble utført tre ganger med i det vesentlige identiske resultater. * P 0,0001, ** P. 0,05 etter to tailed Student t test
MiR-34a og MIR-34c i omvendt forhold til PDGFR-α /β uttrykk
in vitro
og
in vivo
Deretter analyserte vi konsekvensene av ektopisk uttrykk for MIR-34a og -34c i Calu-6 og H1703 celler. Vi valgte disse to cellelinjene på grunn av de høye ekspresjonsnivåer av PDGFR-α (H1703 og Calu-6) og PDGFR-β (Calu-6) (data ikke vist). Øket ekspresjon av MIR-34a og MIR-34C ved transfeksjon ble bekreftet ved QRT-PCR (data ikke vist) og deretter effekten på PDGFR-α og PDGFR-β mRNA og proteinnivåer ble analysert ved QRT-PCR og western blot. MiR-34a og -34c (og ikke MIR-34b) overekspresjon signifikant redusert PDGFR-α og PDGFR-p-mRNA (figur 2a) og de endogene proteinnivå, sammenlignet med celler transfektert med en egge pre-MIR (figur 2b). Uttrykket nivåer av de fire PDGF ligander (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) etter MIR-34a og MIR-34c håndheves uttrykk ble også evaluert i både Calu-6 og H1703 celler. PDGFD var knapt uttrykt i begge cellelinjer; Vi fant ikke noen variant av uttrykket av PDGFA, PDGFB og PDGFC (data ikke vist). Oppsummert disse resultatene støttet bioinformatikk spådommer indikerer PDGFR-α og PDGFR-β 3 «UTR som mål for Mir-34a og -34c.
(a) QRT-PCR viser PDGFR-α og PDGFR-β mRNA downregulation i Calu-6 og H1703 celler etter MIR-34 og MIR-34c, men ikke Mir-34b håndhevet uttrykk (b) MIR-34a og MIR-34c håndhevet uttrykk reduserer endogene nivåer av PDGFR-a /p proteinnivået i H1703 og Calu-seks NSCLC. Cellene ble transfektert med enten eggerøre, MIR-34a eller MIR-34C i 72 timer. PDGFR-α og PDGFR-β ekspresjon ble undersøkt ved western blot. Lasting kontroll ble oppnådd ved bruk av GAPDH-antistoff. * P 0,05, ** P. 0,001 av to tailed Student t test
For å verifisere nedregulering av MIR-34a og -34c også
in vivo
, 9 lungesvulster (blant adenokarsinom og plateepitelkarsinom) og de tilstøtende histologisk normale lungevev ble analysert for MIR-34a og -34c uttrykk. Som vist i figur 3a og b, MIR-34a og MIR-34C ekspresjon var lavere i tumoren sammenlignet med normale prøver (figur 3a, b).
(a-b) QRT-PCR på 18 lunge tumor og normalt vev. MiR-34a og MIR-34C er nedregulert i svulstene i forhold til normal lunge vev. (c) Boksplott som viser MIR-34a og MIR-34C uttrykk i 48 lunge normale og kreft vev. (d) XY spredningsplott som viser invers korrelasjon mellom MIR-34a /c og PDGFR-α /β. Tosidige Student t test ble brukt til å bekrefte betydningen. P . 0,05
Videre analyserte vi MIR-34a, 34c og PDGFR-α /β mRNA uttrykk i 24 primære humane lunge vevsprøver sammenlignet med 24 normalt vev. MiR-34a -34c og var nesten umulig å oppdage i tumoren og høyt uttrykt i normal lunge prøver testet (figur 3c). Bemerkelsesverdig var en invers korrelasjon mellom MIR-34a /c og PDGFR-α og PDGFR-β observert (figur 3d). For ytterligere å underbygge disse funnene, in situ hybridisering (ISH) analyse ble utført ved hjelp av 5′-dig-merket LNA prober på lungesvulster og normalt vev, etterfulgt av immunhistokjemi (IHC) for PDGFR-α og PDGFRp. De fleste lungecancerceller viste lav ekspresjon av MIR-34a og høy ekspresjon av PDGFR-α /β, mens den tilstøtende ikke-ondartede lunge uttrykt PDGFR-α sjelden og rikelig uttrykt MIR-34a. MiR-34a og PDGFR-α /β uttrykk i de fleste av de 107 forskjellige svulster som ble analysert var i utgangspunktet gjensidig utelukkende (figur 4a, b og figur S2 i File S1).
(a-b) Immunohistochemistry og i situ hybridisering på 107 lungekreft vevsprøver. MiR-34a (blå) og PDGFR-α /β (brun /rød, henholdsvis i RGB, og hver fluoriserende rød nyanse omdannet bilde) ekspresjon var ikke-reversibelt relatert i lunge cancer og de tilstøtende normalt lungevev. Disse seriesnitt ble analysert for MIR-34a-ekspresjon ved in situ hybridisering, etterfulgt av immunhistokjemi for PDGFR-α /β. (A) representant eksempel: Co-uttrykk analyse av MIR-34a og PDGFR-α. Merk manglende uttrykk i det sammenslåtte bildet (panel b) (fluoriserende gul = co-uttrykk). (B) Representant eksempel: MIR-34a = blå (panel a), PDGFR-β = rød (panel b), co-uttrykk = gul (panel c). RGB = Vanlig Grønn Blå bilde av ISH /LHC reaksjon vist i paneler a-c. Scale bar indikerer 50 mikrometer. Forstørrelsen er den samme for alle panelene.
MiR-34a og MIR-34c vinne TRAIL motstand av NSCLC cellene gjennom PDGFR-α og PDGFR-β downregulation
TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er et medlem av tumornekrosefaktor-familien, er kjent for å indusere apoptose i en rekke forskjellige tumortyper. TRAIL er i stand til å spesifikt induserer celledød i kreftceller mens sparsom normale celler og blir nå testet som et lovende anti-svulst agent i kliniske studier [22]. Men mange tumorer inkludert NSCLC er motstandsdyktig mot stien og dermed begrense sin terapeutisk anvendelse. Siden PDGFR-α og PDGFR-β regulerer PI3K /akt og ERK1 /2 trasé [23,24,25], vi neste undersøkt ved immunfarging, ekspresjon og /eller aktivering av noen av de som er involvert i disse banene følgende mir proteiner -34a og MIR-34c håndhevet uttrykk eller PDGFR-α /β lyddemping av siRNAs. Som vist i figur 5a, fosforylering nivåer av ERK redusert etter MIR-34a og MIR-34C håndhevet ekspresjon sammenlignet med celler transfektert med kontroll mir. PDGFR-α stanse redusert aktivering av både Akt og ERK1 /2 (figur 5b). Vi har tidligere vist at PI3K /AKT pathway spiller en nøkkelrolle i TRAIL-indusert apoptose [26], derfor effekten av MIR-34a og MIR-34c overekspresjon på celle overlevelse og TRAIL motstand av NSCLC ble undersøkt. Først spilte vi en spredning analyse på Calu-6 og H1703 TRAIL semi-resistente celler etter håndheves uttrykk for MIR-34a og MIR-34C. 48h etter transfeksjon cellene ble utsatt for TRAIL for 24 timer og deretter celleproliferasjon ble undersøkt ved hjelp av en MTT analyse. Calu-6 og H1703 celler som overuttrykker MIR-34a og -34c viste en signifikant lavere spredning hastighet i forhold til kontrollcellene (Figur S3A i File S1). Videre caspase 3/7 analyse viste en økning i følsomhet etter TRAIL MIR-34a -34c og håndhevet ekspresjon eller PDGFR-α /β stanse, sammenlignet med celler transfektert med en kodet MIR eller siRNA (figur 5c, d).
(a) Western blot i Calu-6 celler etter MIR-34a, -34b og -34c tvunget uttrykk. MiR-34a eller MIR-34c og ikke MIR-34b tvunget til uttrykk senker PDGFRp ekspresjonsnivåer og reduserer aktivering av ERK1 /2. (B) Western blot som viser inaktivering av Akt og ERK trasé etter PDGFR-α demping. (C) Caspase 3/7 assay. MiR-34a og -34c håndhevet uttrykk i Calu-6 og H1703 semi-resistente celler, øker responsen på TRAIL-indusert apoptose. (D) caspase 3/7 analysen viser at PDGFR-α eller PDGFR-β stanse øker responsen på TRAIL-indusert apoptose. (E) PDGFR-α eller PDGFR-β overekspresjon i H460-TRAIL-sensitive celler avtar responsen på legemidlet. (F) Kombinert behandling av PDGFR-inhibitor (20 uM) og forskjellige konsentrasjoner (TRAIL 0-100-150 ng /ml) i 24 timer sensitizes NSCLC-celler til TRAIL-fremkalt apoptose. * P 0,001, ** P . 0,05
Videre er overekspresjon av PDGFR-α og PDGFR-β i H460-TRAIL-sensitive celler, økt resistens mot medikamentet (figur 5e og fig S3c Fil S1). Motsatt, behandling av Calu-6 celler med en PDGFR hemmer betydelig økt følsomhet for TRAIL-indusert apoptose (figur 5f og Figur s3D i File S1). Intriguingly, overekspresjon av PDGFR-α eller PDGFR-β (ved bruk av to plasmider som kun inneholder de kodende sekvenser og ikke den 3 «UTR av PDGFR-α /β) sammen med MIR-34a eller MIR-34C, redusert følsomhet for TRAIL-fremkalt apoptose, som vurdert av både MTT og caspase 3/7 analysen (Figur S4 i File S1). Resultatene tyder på at PDGFR-α og PDGFR-β spille en viktig rolle i TRAIL-indusert apoptose og at PDGFR inhibitor kan sensitiv NSCLC celler til sti med viktige terapeutiske konsekvenser.
PDGFR-α /β downregulation av speil 34a og MIR-34c hemmer migrasjon og invasivitet av NSCLC celler
Fordi PDGFR-α /β regulere PI3K /AKT vei, særlig involvert i migrasjon og invasjon av ulike svulster [27,28], vi undersøkt om Mir -34a /c kan påvirke NSCLC migrasjon og invasjon gjennom PDGFR-α og PDGFR-β downregulation. For å direkte teste den funksjonelle rollen MIR-34a /c i tumorigenesis, overexpressed vi disse to mirnas eller taushet PDGFR-α /β i Calu-6 eller H1703 celler. Forbløffende nok observerte vi en betydelig reduksjon av trekkende og invasive egenskapene til Calu-6 og H1703 celler etter MIR-34a eller MIR-34c overekspresjon (figur 6a) samt etter PDGFR-α og PDGFR-β downregulation (figur 6b), bekreftet også av ripe sår analysen (figur 6c). For ytterligere å bekrefte at PDGFR-α og PDGFR-β var involvert i tumordannelse av NSCLC-celler, MIR-34a og -34c ble transfektert i Calu-6-celler alene eller i kombinasjon med et plasmid som overuttrykker bare den kodende sekvens og ikke den 3 «UTR av PDGFR-α og PDGFR-β. MiR-34a /c håndhevet uttrykk redusert migrasjon og invasjon av Calu-6 celler, men overekspresjon av PDGFR-α eller PDGFR-β, sammen med de to microRNAs, delvis restaurert migrasjons og invasjons evner, noe som tyder på at MIR-34a /c regulere NSCLC tumorgenese, i det minste delvis, gjennom PDGFR-α /β (figur 6 d, e).
(a) MiR-34a -34c og håndhevet uttrykk reduserer trekkende og invasive egenskapene til H1703-celler. (B) PDGFR-α og PDGFR-β lyddemping reduserer trekkende og invasive egenskapene til Calu-6 celler. RFU = Relative Fluorescens Units. (C) Representative bilder av ripete områder av konfluent monolag av Calu-6 celler transfektert med MIR-34a /c eller kontroll miRNA (MIR-Ctr) på 0h, 12h og 24h etter såret med en pipette tips. Scale bar, 100 mikrometer. Forstørrelsen er den samme for alle plater. (D-e) PDGFR-α og PDGFR-β overekspresjon delvis redder trekkende og invasive egenskapene til Calu-6 celler. * P. 0,05
Diskusjoner
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i både menn og kvinner over hele verden
1. The American Cancer Society anslår 156,940 dødsfall av lungekreft i USA for 2011 alene [29]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for majoriteten av alle lungekrefttilfeller og er en ledende årsak til kreftdødelighet [30].
Den høye dødeligheten assosiert med lungekreft har bedt mange uttømmende innsats til identifisere nye terapeutiske mål og behandlingsmetoder for denne dødelige sykdommen. Blodplate-avledet vekstfaktor-reseptorer (PDGFRs) og deres ligander, blodplate-avledede vekstfaktorer (PDGFs) spiller viktige roller i mesenchymale cellemigrering og proliferasjon. Unormalt av PDGFR /PDGF er tenkt å bidra til en rekke sykdommer hos mennesker og spesielt kreft [31].
microRNAs er små kodende RNA som viser deregulering i de fleste kreftformer. Det er økende bevis for at de spiller vesentlige roller i patogenesen og prognose av menneskelige maligniteter og i motstanden mot cellegifter [32,33]. Tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) utløser apoptose i tumorceller, men når de brukes alene, er den ineffektiv ved behandling av TRAIL-resistente svulster. Denne motstanden er utfordrende for TRAIL-basert anti-kreft terapi. I denne studien fant vi at MIR-34a og MIR-34c er sterkt downmodulated både NSCLC celler og lungesvulster i forhold til normalt vev. Tvangs uttrykk for MIR-34a og MIR-34C downregulated PDGFR-α og PDGFR-β mRNA og proteinnivåer. Luciferase og vestlige blot eksperimenter vist at PDGFR-α og PDGFR-β er direkte mål av MIR-34a og MIR-34c, men ikke fra MIR-34b. Motstanden i mange typer kreft til konvensjonell kjemoterapi er en viktig faktor for å undergrave vellykket behandling av kreft. AKT aktivering bidrar også til tumorgenese og tumormetastase, og som vist sist, resistens mot kjemoterapi [26,34]. Som et resultat, både
in vitro
og
in vivo-studier
kombinerer lavmolekylære inhibitorer av PI3K /Akt vei med standard kjemoterapi har vist seg vellykket i å dempe kjemoterapeutisk resistens. Nærmere bestemt inhiberende AKT-aktivitet kan være en gyldig metode for å behandle kreft og øke effektiviteten av kjemoterapi.
Protein kinaser er viktige regulatorer av de fleste cellulære signalveier. Blant dem, reseptor-tyrosin-kinaser (RTK), for eksempel PDGFR, spille sentral rolle i å fremme cellevekst og proliferasjon av transduse ekstracellulære stimuli til intracellulære signalkretsene [35]. En fremtredende del av den intracellulære signal maskiner er PI3K /Akt (PKB) /mammalian target of rapamycin (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) pathway [36,37]. Avvikende aktivering av denne reaksjonsvei ved mutasjon av en hvilken som helst av flere gener som er kjent å forekomme i de fleste humane cancere gjennom ulike mekanismer [38,39]. I et tidligere arbeid [26], vi demonstrert at MET, gjennom aktivering av PI3K /AKT vei, indusert tumordannelse og TRAIL motstand i NSCLC. Derfor hypotese vi at PDGFR-α /β, gjennom aktivering av AKT Banen bør være involvert i TRAIL-fremkalt apoptose. Faktisk overekspresjon av MIR-34a og MIR-34c eller nedregulering av PDGFR-α /β ved sirnas, sterkt økte responsen av semi-resistente NSCLC celler til Trail-indusert apoptose. Viktigere, kombinert behandling av et PDGFR-inhibitor med TRAIL, økt apoptose og redusert celleproliferasjon, som vurdert av caspase 3/7 analyse og MTT-analyser. Til sammen tyder resultatene på at kombinert behandling av TRAIL med PDGFR hemmere kan bevisstgjøre en undergruppe av lungesvulster, uttrykke PDGF reseptorer, til stoffet. Videre er det vel kjent at PI3K /AKT, også de ERK1 /2 trasé regulerer cellulær migrering og invasjon av forskjellige krefttyper [40,41]. Rapporterte vi at MIR-34a og MIR-34C overekspresjon eller PDGFR-α /β stanse hemmet migrering og invasjon kapasitet av Calu-6 og H1703-celler, sammenlignet med celler transfektert med en kodet mir eller siRNA kontroll. Tvangs ekspresjon av PDGFR-α eller PDGFR-β delvis gjenopprettet NSCLC migrering og invasjon støtte at reguleringen av ekspresjonen av disse reseptorene ved MIR-34a /c spiller en viktig rolle i NSCLC tumorigenesis. Men vi erkjenner at andre MIR-34a /c-mål inkludert c-Met [16] og AXL [42] kan også være involvert. Mens dette manuskriptet var under forberedelse Silber et al. rapportert at MIR-34a uttrykk var lavere i proneural hjernesvulst i forhold til andre svulst subtyper og identifisert PDGFR-α som en direkte mål av MIR-34a [43]. Her rapporterer vi at ikke bare MIR-34a men MIR-34c nedregulerer også PDGFR-α i NSCLC celler. Videre viser vi at PDGFR-β er en MIR-34a /c direkte mål, mens vi ikke fikk se noen vesentlig effekt på uttrykk for PDGFR-α og PDGFR-β etter MIR-34b håndhevet uttrykk. Bemerkelsesverdig, viser vår studie at hemming eller nedregulering av PDGFR-α og PDGFR-β av MIR-34a /c fiendskap tumorigenicity og øker følsomheten for TRAIL-indusert celledød med viktig terapeutisk anvendelse for fremtidig anti-tumor terapi for lungekreft.
Materialer og metoder
lungekreft cellelinjer og vevsprøver
Menneske H460, A549, H1299, H1703 cellelinjer ble dyrket i RPMI medium som inneholder 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) og med 2 mM L-glutamin og 100Uml-en penicillin-streptomycin. Calu-6-celler ble dyrket i MEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 100Uml-en penicillin-streptomycin. 9 lungesvulster (inkludert adenokarsinom og plateepitelkarsinom) og deres vanlige kolleger ble vennlig levert av Dr. S.P. Nana-Sinkam, Pulmonary, Allergi, Critical Care og Sleep Medicine, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Columbus, OH. 48 lunge normal og svulst vevsprøver ble gitt fra Avdeling for patologi, Ohio State University. Alle menneskelige vev ble oppnådd i henhold til en protokoll godkjent av Ohio State Institutional Review Board.
Luciferase assay
De 3 «UTR av de menneskelige PDGFRA og PDGFRB gener, ble PCR forsterket ved hjelp av følgende primere:
PDGFR-α FW 5 «TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3»
PDGFR-α RW 5 «TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 «
PDGFR-β FW 5′ TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3
PDGFR-β RW 5 «TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3»
og klonet nedstrøms for Renilla luciferase stoppkodon i pGL3 kontroll vektor (Promega). Disse konstruksjonene ble brukt til å generere, ved invers PCR, de p3′-UTRs- mutant-plasmider ved hjelp av følgende primere:
PDGFR-α Mut1 FW 5 «ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3»
PDGFR-α Mut1 RW 5 «CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT
PDGFR-αmut2 FW: 5′ ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3 «
PDGFR-αmut2 RW: 5′ AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3 «
PDGFR-β Mut FW 5′ -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 «
PDGFR-β Mut RW 5′-GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3′
Calu-6 celler ble transfektert med 1 ug p3’UTR-PDGFR-α, p3 «UTR-PDGFR-β eller med p3’UTRmut-PDGFR-α og p3’UTRmut-PDGFR-β, 1 ug av et Renilla luciferase-ekspresjon konstruere PRL-TK (Promega) ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon og analysert med Dual Luciferase Assay (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo.
Western Blot analyse
Totale proteiner fra NSCLC ble ekstrahert med radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) buffer (0.15mm NaCl, 0,05 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% Triton, 0,1% SDS, 0,1% natriumdeoksycholat og 1% Nonidet P40). Eksempel ekstrakt (50 mikrogram) ble løst på 7,5 til 12% SDS-polyakrylamidgeler (side) ved hjelp av en mini-gel apparat (Bio-Rad Laboratories) og overført til Hybond-C ekstra nitrocellulose. Membranene ble blokkert i 1 time med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween 20, inkuberes over natten med primært antistoff, vasket og inkubert med sekundært antistoff, og visualisert ved kjemiluminescens. De følgende primære antistoffer ble brukt: anti-PDGFR-α, anti-PDGFR-β, anti-ERK1 /2, anti-p-ERK, anti-pakt, anti-total AKT, anti-GAPDH-antistoff (Cell Signaling). Et sekundært anti-kanin eller anti-mus immunglobulin G (IgG) antistoff peroksydasekonjugatet (Chemicon) ble brukt.
Real-time PCR
Real-time PCR ble utført ved hjelp av en standard TaqMan PCR Kit-protokollen på en Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Den 10 mL PCR reaksjon inkludert 0,67 mL RT produkt, en mL TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 mM TaqMan probe, 1,5 mM fremover primer og 0,7 mm revers primer. Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners plate ved 95
° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95
° C i 15 s og 60
° C i 1 min. Alle reaksjoner ble kjørt i triplikat. Terskelen syklus (CT) er definert som den fraksjonelle syklus nummeret som fluorescensen passerer den faste terskel. Den sammenlignende CT fremgangsmåte for relativ kvantisering av genekspresjon (Applied Biosystems) ble benyttet for å bestemme miRNA ekspresjonsnivåer. Y-aksen representerer 2 (-ΔCT), eller den relative ekspresjon av de forskjellige Mirs. Mirs ekspresjon ble beregnet i forhold til U44 og U48 rRNA. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og dataanalyse ble utført ved hjelp av programvare (Bio- Rad).
Celledød og celleproliferasjon kvantifisering
For deteksjon av caspase 3/7 aktivitet, ble cellene dyrket i 96-brønners plater, i tre eksemplarer, ble behandlet med TRAIL (100-150ng /ml) og analysert ved bruk av Caspase-Glo 3/7 Assay kit (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Kontinuerlige variable er uttrykt som middelverdier ± standardavvik (S.D.). Cellelevedyktigheten ble undersøkt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-dipheniltetrazolium-bromid (MTT)-celle Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Metabolsk aktive celler ble påvist ved å tilsette 20 ul av MTT til hver brønn. Etter 1 time med inkubering ble platene analysert i en Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories).
anti-PDGFR-a og anti-PDGFR-β sirnas transfeksjon
Cellene ble dyrket til 50% samløpet og transient transfektert i 72 timer ved hjelp Lipofectamine 2000 med 100 nM anti-PDGFR-α og /eller med 100nM anti-PDGFR-β SMARTpool sirnas eller kontroll sirnas (Dharmacon), et basseng på fire mål spesifikk 20-25 nt sirnas utformet å slå ned genuttrykk.
Mirna låst nukleinsyre in situ hybridisering av formalinfiksert, parafininnebygd vev seksjon
in situ hybridisering (ISH) ble utført på deparaffinized menneskelige lunge vev ved hjelp av tidligere publisert protokoll [44], som innbefatter en fordøyelse i pepsin (1,3 mg /ml) i 30 minutter. Sekvensen til proben som inneholder den dispergerte låst nukleinsyre (LNA) modifiserte baser med digoxigenin konjugert til 5′-enden var: 5 «ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3». Sonden cocktail og vev miRNA ble ko-denaturert ved 60
° C i 5 minutter, etterfulgt av hybridisering ved 37
° C over natten og en stringens vask i 0,2X SSC, 2% bovint serumalbumin ved 4
° C i 10 minutter. 0,05.
