Abstract
Bakgrunn
E
sophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er svært utbredt i Kina og andre asiatiske land, som en viktig årsak til kreft-relaterte dødelighet . ESCC viser komplekse kromosomavvik, inkludert flere strukturelle og numeriske avvik. Kromosomavvik, som gjentatte presiseringer og homozygot slettinger, direkte bidra til tumorigenesis gjennom å endre uttrykket av viktige onkogener og tumorsuppressorgener.
metodikk /prinsipp Funn
T
o forstå rollen av genetiske forandringer i ESCC patogenesen og identifisere kritiske forsterkning /sletting mål, utførte vi genome-wide 1-Mb rekke komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyse for 10 brukte ESCC cellelinjer. Tilbakevendende kromosom gevinster ofte ble oppdaget på 3q26-27, 5p15-14, 8p12, 8p22-24, 11q13, 13q21-31, 18p11 og 20q11-13, med hyppige tap også funnet på 8p23-22, 11q22, 14q32 og 18q11-23 . Gevinst av 11q13.3-13.4 var den hyppigste endring i ESCC. Innenfor denne regionen,
CCND1
onkogen ble identifisert med høy forsterkning og overekspresjon i ESCC, mens
FGF19 Hotell og
SHANK2
ble også bemerkelsesverdig over-uttrykk. Dessuten, en høy konkordans (91,5%) av genet forsterkning og protein overekspresjon av
CCND1
ble observert i grunnskolen ESCC svulster.
CCND1
forsterkning /overekspresjon var også signifikant korrelert med lymfeknutemetastase av ESCC.
Konklusjon
Disse funnene antyder at genomisk gevinst på 11q13 er den viktigste mekanismen som bidrar til forsterkning. Nye onkogener identifisert innen 11q13 amplicon inkludert
FGF19 Hotell og
SHANK2
kan spille viktige roller i ESCC tumorigenesis
Citation. Ying J, Shan L, Li J, Zhong L Xue L, Zhao H, et al. (2012) Genome-Wide Screening for genetiske endringer i kreftfaren ved aCGH Identifiserer 11q13 Amplification Onkogener Associated med Nodal metastasering. PLoS ONE 7 (6): e39797. doi: 10,1371 /journal.pone.0039797
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 6 oktober 2011; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 25 juni 2012
Copyright: © 2012 Ying et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (# 30801344 # 30928012) og Nova Program (No. 2009A70) Beijing. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er en av de mest aggressive kreftformer har sin opprinnelse i mage-tarmkanalen, og er rangert som den sjette største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i verden [1]. Dens forekomst varierer mellom ulike regioner i verden, med Kina som et høyrisiko-område. I noen distrikter i nord og sentrale Kina, overstiger forekomsten 100 tilfeller /per 100 000 per år [2]. Histologisk er kreftfaren klassifisert som esophageal adenokarsinom og esophageal plateepitelkarsinom (ESCC). De fleste av tilfellene meldt i USA er esophageal adenokarsinomer, men i Kina og andre asiatiske land, er ESCC den dominerende typen som står for ca 90% av alle tilfeller. Til tross for fremskritt i multimodale behandlinger, ESCC fortsatt et alvorlig kreft-omsorg problem i mange land med svært lave 5-års overlevelse ( 30%) [3]. Det er således av stor klinisk verdi for å lete etter sensitive og spesifikke biomarkører for tidlig deteksjon og prognose av kreft, så vel som nye terapeutiske mål.
Genomiske amplifikasjoner og delesjoner bidra til human tumorgenese ved å forandre ekspresjon nivåer av kritiske onkogener og tumorsuppressorgener (TSGs). Til tross for sin høye utbredelsen har ESCC ikke undersøkt så intensivt som sin adenokarsinom motstykke. Arbeidet har blitt satt til å identifisere brutto kopi antall endringer av både ESCC cellelinjer og svulster, inkludert karyotypering, fluorescens
in situ
hybridisering (FISH), konvensjonell komparativ genom hybridisering (CGH) og tap av heterozygositet (LOH) analyserer . Ifølge tilgjengelige data publisert av nå, er de mest siterte kromosom presiseringer i ESCC 3Q, 4Q, 5p, 8p, 7q, 9q, 10q21, 11q13-q22, 18p11.3, 20Q og 22qtel [4] – [12]. Presiseringer husing onkogener, f.eks 11q13 (
CCND1
,
EMS 1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
), 8q24
(MYC)
, har vært konsekvent observert i mer enn ett studier [4] – [12]. Kromosom tap recurrently involvere 3p, 5q, 9 p, 13q, 18q og 21q, der målet gener som
FHIT
,
APC
,
RB1 Hotell og
CDKN2A
er plassert [4] – [12]. I de senere årene, høy oppløsning matrise-basert CGH (aCGH) har blitt brukt til å identifisere målet onkogener og TSGs gjennom å definere tilbakevendende gevinster og tap på ulike kreftformer. Inntil nylig, to studier utført aCGH analyse på primær ESCC prøver, avslører tilbakevendende, høyt nivå presiseringer i 3q27.1, 7p11, 8q21.11, 8q24.21, 11q13.3, 11q22, 12q15-q21.1, 18q11.2 og 19q13.11-q13.12, og homozygot slettinger i 4q34.3-q35.1 og 9p21.3 [13]; [14]. Men sammenlignet med «rene» ESCC cellelinjer, primære ESCC prøvene inneholder mye normale celler som kan påvirke aCGH resultater på forskjellige måter. Selv om flere omfattende hele genomet studier på ESCC cellelinjer har blitt rapportert, blir cellelinjene brukes hovedsakelig stammer fra japansk ESCC (TE-serien) og sørafrikanske ESCC pasienter henholdsvis [15] – [17]. Profilering av flere ESCC cellelinjer stammer fra forskjellige høyrisikoområder i Asia via aCGH vil ikke bare tillate identifisering av tilbakevendende kromosomforandringer i asiatisk ESCC, men også gi verdifull innsikt for fremtidige studier ved hjelp av disse cellene linjene som ESCC modeller.
I denne studien har vi profilerte 10 brukte ESCC cellelinjer stammer fra fastlandet kinesisk (EC1, EC18 og EC109), Hong Kong Chinese (HKESC1, HKESC2, HKESC3 og SLMT1) og japansk (KYSE70, KYSE410 og KYSE520) pasienter for hel-genom DNA kopiantall endringer ved hjelp aCGH analyse. Blant identifiserte endringer, forsterkning av 11q13 er den hyppigste gevinst observert, husing
FGF19
,
SHANK2 Hotell og
CCND1
. Vi videre funnet at
CCND1
uttrykk ofte ble oppregulert i grunnskolen ESCC svulster, og DNA forsterkning bidrar til det overuttrykk, som er korrelert med lymfeknutemetastase av primære ESCC svulster.
Resultater
Genomisk Profiler av ESCC cellelinjer ved 1-Mb aCGH
ti ESCC cellelinjer ble analysert ved hjelp av en-Mb aCGH (Sanger 3040-BAC /PAC klone array). Signalintensitetsforhold for hver BAC ble behandlet og vist som log2 tomter ved hjelp SeeGH programvare [18]. Figur 1 viser representative SeeGH karyograms av en ESCC cellelinje (EC18) analysert, viser identifisering av ulike gevinster og tap. Andre SeeGH karyograms av ESCC cellelinjer analysert er vist i figur S1. Figur 2 oppsummerer de recurrently endrede områder (med log2 forholdstall mer enn 1 eller mindre enn 1). Generelt kromosom gevinster ble oftere påvist enn tap. De mest hyppige endringer inkludere forsterkning av 11q13 (70%) og fullstendig tap av 18q11-23 (50%). Andre gevinster som forekommer i tre eller flere cellelinjer er 3q26-27 (40%), 5p15-14 (50%), 8p12 (30%), 8p22-24 (30%), 13q21-31 (30%), 18p11 ( 30%) og 20q11-13 (40%). Andre tap som forekommer i tre eller flere cellelinjer er 8p23-22 (40%), 11q22 (30%) og 14q32 (30%) (fig. 2).
Normaliserte log2 signalintensitetsforhold ble plottet ved bruk av SeeGH programvare. En log2 signal-forhold på 0 representerer tilsvarende kopitall mellom prøven og referansen DNA (detaljer i Materialer og Metoder). Cytoband mønster for hvert kromosom er vist i den venstre. Vertikale linjer betegne log2 signalforhold fra -2 til +2 med kopiantall øker i retten og synkende i venstre. Hver mørk blå prikk representerer en enkelt BAC klone.
Unormalt med ≥20% frekvens på 10 ESCC cellelinjer vises. * Regioner med unormalt i ≥50% cellelinjer er vist i fet skrift.
Forsterkning og Overuttrykte 11q13 Gener i ESCC cellelinjer
Blant regionene identifisert med tilbakevendende endringer, forsterkning av 11q13 0,3 til 13,4 er den hyppigste gevinst i ESCC (fig. 3A), særlig i de cellelinjer avledet fra kinesiske pasienter (6/7 cellelinjer, 85%). Flere gener med potensielle onkogene funksjoner har blitt identifisert i dette locus, inkludert
CCND1 Hotell og
CTTN
. Dermed 11q13 ble videre undersøkt for bekreftelse av gevinster og identifisering av forsterkede gener, ved duplex genomisk DNA PCR i 10 ESCC cellelinjer.
CCND1
er adressert til midten av 11q13 fragment, og høyt nivå forsterkning av
CCND1
ble bekreftet i 6/10 cellelinjer (Fig. 3B, C), mens
CTTN
utstilt det nest høyeste nivået av forsterkning (i 5/10 cellelinjer).
, aCGH profiler av seks ESCC cellelinjer på
CCND1
locus. Normaliserte log2 signalforhold ble plottet. Amplifikasjoner ble definert som log2 signalintensitet ≥1. Horisontale linjer betegne log2 signalforhold fra -1 til 3 med kopi antallet øker oppover. Hvert svart /fargerik prikk representerer en enkelt BAC klone. Navn på relaterte BAC kloner er også vist. Avskrift kart av kjernen 11q13 amplicon vises i bunnen.
B
, Semi-kvantitativ duplex genomisk DNA PCR-analyse av
CCND1
i 10 ESCC cellelinjer og 3 normale PBMC prøver. Signalintensitet prosenter av
CCND1 Twitter /
GAPDH
vises.
C
, Oppsummering av genkopitallet endringer av flere gener innenfor 11q13 amplicon. Tall som vises i tabellen er folder av kopiantall av ESCC cellelinjer i forhold til gjennomsnittsverdiene av tre PBMC prøver. PBMC, perifert blod mononukleære celle.
Flere gener rundt
CCND1
11q13 ble videre undersøkt av semi-kvantitativ RT-PCR i ESCC cellelinjer. Resultatene viste at
FGF19
og
SHANK2
ble også bemerkelsesverdig overuttrykt i ESCC cellelinjer, mens bare svakt eller ikke uttrykt i normal spiserøret eller udødelig normale celler (fig. 4), selv om ingen åpenbar forsterkning av
SHANK2
ble påvist i disse cellelinjene.
FGF3 plakater (data ikke vist) og
4
var i utgangspunktet ikke uttrykt i noen ESCC cellelinje eller normal spiserøret. Overekspresjon av
CCND1 Hotell og
CTTN
ble også observert i de fleste ESCC cellelinjer i forhold til normal spiserøret, selv om de ble vanligvis uttrykt i normal spiserør og udødelig celler (Fig. 4). Samlet utgjør disse dataene bekreftet at 11q13 er den hyppigste forsterkning i ESCC og avgrenset flere gener inkludert
CCND1
,
CTTN
,
FGF19 Hotell og
SHANK2,
som potensielle kritiske onkogener berørt.
forsterkning status for 11q13 regionen ved aCGH og
CCND1
av multipleks DNA PCR er listet nederst. +, Forsterket; – Ikke forsterket. 23x, 25x, 30x: RT-PCR-sykluser. Alle andre gener ble undersøkt ved RT-PCR med 30 sykluser, med
GAPDH
for bare 23 sykluser.
CCND1 Overuttrykte i Primær ESCC og dens Clinicopathological Association
Expression of CCND1 protein ble videre undersøkt ved immunhistokjemi i ESCC vev microarray (TMA) fra 171 primær ESCC og tilstøtende kirurgisk margin histologiske normale esophageal vev. Saker med 10% av kreftceller som viser positiv atom farging ble skåret for CCND1 overekspresjon. Ninety-fire av de 171 tilfellene (55%) viste CCND1 overekspresjon, inkludert 42 tilfeller av karakteren 1+, 35 tilfeller av karakteren 2+ og 17 tilfeller av klasse 3+ (Fig. 5A). I motsetning til dette, bare spredte positive celler ble funnet i basalceller av normal esophageal epitel.
.
En
,
Topp paneler
, immunhistokjemisk farging for
CCND1
.
Venstre
, spredt positivitet av
CCND1
, spesielt i basal laget, er sett i normal esophageal epitel (original forstørrelse, × 200).
Middle
, er et tilfelle av ESCC negativt for
CCND1
uttrykk (original forstørrelse, × 200).
Høyre
, diffus og sterke kjerne farging for
CCND1
i dette tilfelle ESCC (original forstørrelse, × 200).
Bottom paneler
, FISH analyse. Grønne signaler referere til referanse probe av chr 11 cent mens røde signaler er target-probe for
CCND1
.
Venstre
, unamplified i normal esophageal epitel,
Middle
, en unamplified ESCC tilfelle.
Høyre
, en forsterket ESCC tilfelle.
B
. Resultater av
CCND1
forsterkning og uttrykk nivåer i 94 parafin-embedded primære ESCC.
Vi testet sammenhengen mellom CCND1 overekspresjon og clinicopathological funksjoner, inkludert tumor størrelse, klasse, lymfeknute metastase, og pasientens alder. CCND1 overekspresjon var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase (
p
= 0,006) (tabell 1), men ikke med PT, klasse, eller pasientens alder (
p
0,05, henholdsvis). I tilfellene med CCND1 overekspresjon, var det ingen signifikant forskjell om lymfeknutemetastase, mellom CCND1 høy-uttrykk grupper (klasse 2+ og 3+) og lav-uttrykk gruppe (klasse 1+) (
p
= 0,37).
CCND1 Overuttrykte Som følge av Gene Amplification, men ikke aktivert β-catenin Signa
for å bekrefte genamplifisering av
CCND1
i grunnskolen ESCC og undersøke foreningen med sin overekspresjon, søkte vi fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse med kommersiell
CCND1
sonde sammen med CEP 11 sonde i 94 tilfeller.
CCND1
ble forsterket i 50 tilfeller (53,2%) og ikke-forsterket i 44 tilfeller (46,8%) (fig. 5B). Videre genamplifikasjon av fisk og protein overekspresjon av immunhistokjemi for
CCND1
viste 91,5% (
κ
= 0,69) samstemmighet.
immunohistochemically, kjernekraft farging for β-catenin var positiv på bare 4/94 tilfeller (4,3%). Alle β-catenin positive tilfeller var negative for CCND1 ved immunhistokjemi.
Diskusjoner
ESCC er den sjette mest dødelige kreft på verdensbasis, og står for 90% tilfeller av alle esophageal kreft i Kina [19]. Selv om forekomsten av ESCC er lavt i vestlige land, er denne svulsten vanlig i Asia, spesielt i enkelte regioner i Kina som Henan-provinsen og byen Shantou [20]; [21]. Som andre kreftformer, miljømessige og genetiske faktorer bidrar til ESCC patogenesen. Tobakk, alkohol, varm drikke /mat, kosttilskudd mangel og akalasi har vært ansett som store miljømessige risikofaktorer for ESCC, som avslørt av epidemiologiske studier [21]; [22]. I mellomtiden, cytogenetiske og molekylærgenetiske analyser demonstrerte flere genetiske avvik i ESCC, inkludert kromosom tap og gevinster. Opplysning av disse avvikene vil føre til bedre forståelse av ESCC patogenesen, og videreutvikle therapeutics og biomarkører for prediksjon av metastasering og prognose. I denne studien gjennomførte vi en omfattende undersøkelse av genomiske avvik i ESCC med høy oppløsning matrise-baserte CGH, å avgrense minimal kromosomale regioner av presiseringer og slettinger. Resultatene gir detaljerte bilder av flere genetiske lesjoner i ESCC genomer, og også gi hint for videre identifisering av kritiske onkogener og TSGs i denne malignitet
I samsvar med tidligere funn [4] -. [14], tilbakevendende gevinster inkludert 11q13 (
CCND1
,
EMS 1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
) og 8q24
(MYC)
, og tap inkludert 3p, 5q, 9 p, 13q, 18q og 21q med målgener som
FHIT
,
APC
,
RB1 Hotell og
CDKN2A
, ble identifisert i ESCC cellelinjer i denne studien. Blant amplikonene oppdaget, er 11q13.3-13.4 den hyppigst forsterkes kromosom regionen. To gener,
CCND1 Hotell og
CTTN
ligger i denne regionen, ble identifisert med høyt nivå presiseringer i flere ESCC cellelinjer. Mens undersøkt på mRNA-nivå, har vi funnet flere gener, inkludert
CCND1 CTTN, FGF19 Hotell og
SHANK2
, ble ofte overuttrykt i ESCC cellelinjer. Nylig Sawey et al rapporterte at
CCND1 Hotell og
FGF19
var to kjøre onkogener i leverkreft [23]. I denne studien har vi fokusert på
CCND1
. Vår studie bekreftet hyppig forsterkning (53,2%) og konkordant protein overuttrykk (51,1%) av
CCND1
i primær ESCC. Videre er en positiv sammenheng mellom
CCND1
forsterkning /overekspresjon og lymfeknutemetastase i ESCC ble observert, noe som indikerer at
CCND1
kan tjene som en prognostisk markør for ESCC, i tråd med andre studier ([ ,,,0],24] – [27] i tillegg til forsterkning, kan CCND1 overekspresjon være drevet av transkripsjonsregulering, slik som Wnt signalveien Beta-catenin er et nøkkelmedlem av Wnt signalveien, som er blitt foreslått involvert i spiserørskreft initiering.. og progresjon [28]. i denne studien ble bare 4,3% (fire i 94) av ESCC tilfeller ble identifisert med beta-catenin atom uttrykk. resultatene indikerer at den genomiske gevinst på 11q13 i ESCC er den primære mekanisme som resulterer i
CCND1
forsterkning og overekspresjon. Denne mekanismen har også blitt rapportert i andre krefttyper som hode og nakke kreft [29], hypofysesvulster [30], og brystkreft [31].
CTTN er en aktin-assosiert protein stillas, binder og aktiverer aktin-relaterte proteinkompleks (Arp2 /3), og dermed regulerer actin forgrenede nettverk ved dannelse av dynamiske kortikale actin tilknyttede strukturer.
CCND1 Hotell og
CTTN
ofte co-forsterket i kreft [32] – [34]. Tidligere
CTTN
har blitt identifisert som en
bona fide
onkogen ligger på 11q13 involvert i ESCC karsinogenese, bidra til metastasering av ulike caners inkludert ESCC, bryst, hepatocellulær, og hode og nakke plateepitel cellekreft [32] – [34]. FGF19, en fibroblast vekstfaktor, sammen med CCND1, ble nylig rapportert å være et lokomotiv onkogen i leverkreft [23]. Involvering av FGF19 og andre nye onkogener identifisert i ESCC patogenesen og de relaterte molekylet mekanismene må undersøkes nærmere.
Blant andre hyppige kromosom gevinster, er 3q26-27 en roman fragment oppdaget i ESCC. Velkjente onkogener bosatt i denne regionen er
EVI1
,
EIF5A2 Hotell og
PIK3CA
, som har blitt rapportert å vise potensielle onkogene funksjoner. I tillegg
TRIO Hotell og
CTNND2
på 5p,
MYC
8q22,
KLF5 Hotell og
POU4F1
13q og
NKX2.2
20p ble også ansett for å spille onkogene roller i andre svulster [35]; [36] og kan bidra til ESCC kreftutvikling. Regioner høyt nivå slettinger som inneholder kjente eller kandidat TSGs ble også påvist, inkludert 18q11-23 inneholder
SMAD2, SMAD4 Hotell og
DCC plakater (EC1, EC109, HKESC3, SLMT1 og KYSE70), 8p22 inneholder
DLC1 plakater (EC1, KYSE70, 410 og 520) og en region på 14q32 inneholder
DLK1 Hotell og
MEG3 plakater (EC1, EC109 og KYSE70). Andre høyt nivå slettinger som inneholder kandidat TSGs inkluderer 4q21.23-21.3 (
MAPK10
,
PTPN13 Hotell og
ARGAP24
), 7p21.2 (
DGKB
), 7q35 (
CNTNAP2
), 8q11 (
CEBPD
), 10p11 (
PARD3
), 13q31.1 (
SPRY2
) og 16q22 -23 (
ATBF1
). De fleste av disse slettede regioner av ESCC har også blitt rapportert i en eller flere andre krefttyper [37]; [38]. Viktigere, genetiske /epigenetiske forstyrrelser eller endrede uttrykket nivåer av enkelte TSG kandidater som er nevnt ovenfor, inkludert
SMAD2
,
SMAD4
,
DCC
,
DLC1 Hotell og
PARD3, etter har blitt rapportert i ESCC svulster og cellelinjer, noe som indikerer at aCGH studien bruker flere tumorcellelinjer kan lette identifisering av kritiske kreftgener i humane tumorer. [39] -. [42]
I konklusjonen, ble flere minimal regioner av overstrykninger og amplikonene påvist i 10 brukte ESCC cellelinjer i denne studien, og flere nye onkogener som ligger i den mest forsterket region 11q13, inkludert
FGF19
,
SHANK2 Hotell og
CCND1
, har blitt identifisert. Denne studien gir viktige data for videre identifisering og karakterisering av kritiske onkogener og TSGs involvert i ESCC patogenesen.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Ti ESCC cellelinjer (EC1, EC18, EC109, HKESC1, HKESC2, HKESC3 og SLMT1 er fra kinesiske pasienter, mens KYSE70, KYSE410 og KYSE520 er fra japanske pasienter) og tre udødelig normale esophageal epiteliale cellelinjer (Het-1A, NE1 og NE3) ble brukt i studien [ ,,,0],43]. Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C.
tumorprøver
det er totalt 171 formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) Kinesisk ESCC prøver (2007-2008) og tilstøtende kirurgisk margin histologiske normale esophageal vev ble oppnådd, etter å ha mottatt pasientenes skriftlig informert samtykke og Institutional Review Board (IRB) godkjennelse fra Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. Alle pasientene var tidligere ubehandlet (dvs. uten kjemoterapi eller strålebehandling), med resektable primære svulster. Gjennomsnittsalderen for pasientene var 58 år (range 33-78), og mann til kvinne ratio var 4.2: 1 (138: 33). Hematoxylin og eosin (HE) -stained seksjonene ble anmeldt for å bekrefte diagnosen og definere kreftområder. Tumorstadium (PT) og karakteren ble definert i henhold til gjeldende WHO klassifisering av svulster.
Array CGH Analyse
Høy molekylvekt kromosomalt DNA ble isolert fra cellelinjer ved hjelp av Qiagen kit (Qiagen , Hilgen, Tyskland). Renheten og molekylvekten av DNA ble undersøkt på agarosegeler. 1-Mb oppløsning hel-genom matriser med 3040 BAC /PAC kloner ble levert av Sanger Institute, UK (https://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/) [44]. Clones detaljer er oppført i Ensembl (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html)
Array-CGH ble utført med små modifikasjoner [43] -. [45]. I korthet, ble prøve-DNA (600 ng) merket med Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia), mens henvisnings DNA fra normale perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra friske kinesiske donorer med Cy3-dCTP ved bruk av BioPrime Array CGH Genomisk etikettsystemet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Unincorporated nukleotider ble fjernet ved hjelp Rensing Module følger med i merkeordningen. Merkede prøver og normal-DNA (50 ul hver) ble blandet og etanolutfelt sammen med 67,5 ul av humant Cot-1 DNA (Invitrogen). Deretter ble det blandede DNA ble resuspendert i 30 pl av hybridiseringsbuffer, denaturert og prehybridisert i et fuktighetskammer inne i en hybridiserings-ovn ved 5 rpm i 2 timer ved 37 ° C. Den prehybridiserings Blandingen ble fremstilt som følger: 80 ul sildesperm-DNA (10 mg /ml, Sigma) og 67,5 ul av humant Cot-1 DNA (Invitrogen) ble utfelt, suspendert på nytt i 120 ul hybridiseringsbuffer og denaturert i 10 minutter ved 72 ° C. Etter prehybridiserings ble prehybridisert sonde lagt inn på lysbildet, og inkuberes ved 5 rpm i 48 timer ved 37 ° C. Lysbilder ble skylt og vasket tre ganger, lufttørket og lagret ved 4 ° C.
hybridiserte lysbilder ble skannet med en Axon 4000B scanner (Axon Instruments Inc, Union City, CA) og analysert med GenePixPro 4,0 bilde analyse programvare hvor flekkene ble definert og median fluorescensstyrkene ble beregnet. Bakgrunns trekkes fluorescensstyrkene ble importert til en spesialdesignet Microsoft Excel-regneark mal. En bestemt sted ble ekskludert hvis de dupliserte stedene har en forskjell på + 10%. De gjennomsnittlige verdier av dupliserte flekker ble presentert i grafisk produksjon i form av gjennomsnittlig log2 (Cy5 /Cy3) ratio mot avstand langs hver enkelt kromosom (Mb). Kromosomkopitall endringer ble scoret som hemizygous tap dersom log2 forholdet ble alt fra -0,2 til -0,7, og homozygot delesjon dersom -0,7, eller genomisk gevinst for log2 ratio på 0,2 til 0,5, og forsterkning hvis 0,5. endringer Kopier nummer sett på kjønnskromosomer ble ekskludert i analysen.
Multiplex Genomisk PCR
Multiplex PCR tillates en semi-kvantitativ vurdering av DNA forsterkning /tap.
GAPDH
genet ble valgt som en intern kontroll. Vi forsterket
CCND1 Hotell og internkontrollen samtidig. For
CCND1
, et par av primere (termin: 5′-tgctgcgaagtggaaaccat og omvendt: 5′-caacaagttgcagggaagtc) genereres et PCR produkt av 227 bp. For
GAPDH
, et par av primere (termin: 5′-gcctcactccttttgcagac og omvendt: 5′-gatgaccttgcccacagcct) genereres et PCR produkt av 157 bp. PCR-reaksjoner ble utført i et endelig volum på 20 ul inneholdende 200 mM deoksynukleotidtrifosfater, 2,5 mM MgCl
2, 50 ng DNA, 0,5 mM av hver oligonukleotid og 0,5 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaksjonsbetingelsene var som følger: en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, fulgt av 30 sykluser bestående av 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler og visualisert. Alle reaksjoner ble utført minst to ganger i uavhengige eksperimenter.
Semi-kvantitativ revers transkripsjon PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celle pellets bruker TRI Reagens (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH). Revers transkripsjon PCR (RT-PCR) ble utført som beskrevet [43], ved hjelp av
GAPDH
som en kontroll. Primerne for alle genene vil bli gitt på forespørsel. PCR programmet benyttet en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 sykluser av reaksjon (94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek) (eller 23, 25 sykluser for CCND1), med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min.
ESCC Tissue Microarray (TMA)
for hvert tilfelle ble både tumor og normalt vev duplisert med en diameter på 1 mm på et objektglass. Før prøven oppkjøpet, HE-farget FFPE lysbilde av hvert tilfelle ble observert under et mikroskop og plasseringen av typisk karakteristisk morfologi ESCC og omkringliggende normalt vev ble sirklet. Det ble tatt prøver fra i sirklene steder i parafinblokken ved hjelp av Beecher Instruments Tissue Arrayer (Silver Springs, MD). For hver blokk ble to 1 mm kjerner utstanset fra de innsirklede områder i giverblokken og kledd på mottakerblokken for å sikre representasjonen av prøvene, og unngå manglende informasjon på grunn av et tap av vev kjerner. Totalt 171 ESCC prøver, 54 eksemplarer av tilsvarende normal slimhinne ble kledd på to mottaker blokker. Tissue microarray seksjoner (4 mikrometer) ble kuttet 24 timer før immunhistokjemi.
Automatisert Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført med en Ventana Benchmark XT Autostainer (Ventana, Tuscon, USA), ved hjelp av monoklonale kanin anti- human CCND1 /cyklin D1 (klon SP4) og monoklonal mus anti-human β-catenin (Clone β-catenin-1) fra DAKO (Glostrup, Danmark) med Ventana Ultra kits (Ventana, Tucson, USA). Platene ble inkubert i 24 minutter ved 37 ° C med primære antistoffer. Diaminobenzidin eller 3-amino-9-etylkarbazol ble anvendt som kromogener og Glassene ble motfarget med hematoksylin før montering. Begge kromogenene brukes på vanlige fulle seksjoner før TMA testing ga samstemmige resultater både når det gjelder overflater og intensiteter av farging. Negative kontroller ble skapt ved utelatelse av primært antistoff, og erstatning med fosfat-bufret saltvann (PBS).
CCND1 og β-catenin ekspresjonsnivåer ble bestemt semikvantitativt ved anvendelse av en fire-lags poengsystem, basert på det positive nukleær farging brøkdel av tumorceller (grad 0 = 0-10%, klasse 1 + = 11-25%, karakter 2+ = 26-50%; klasse 3+ = 51-100%). En score på 0 ble ansett negativ mens en score på 1+, 2+ eller 3+ ble ansett positiv. For β-catenin, kan flekker i cytoplasma har vært til stede, men ble ikke tatt med i bestemmelsen av positivitet.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
For FISH analyse av
CCND1
genamplifisering, to direkte-merkede prober ble brukt, Vysis
CCND1 Twitter /CEP11 FISH Probe Kit inkludert LSI
CCND1 plakater (11q13) SpectrumOrange mot
CCND1 plakater (11q13) og CEP11 SpectrumGreen (Vysis /Abbott, IL, USA) mot cent av kromosom 11. FISH analyse ble gjort i henhold til «LSI Locus Spesifikk Identifier DNA-prober» fra Vysis.
CCND1
genet til kromosom 11 cent forholdet ble målt i minst 60 kjerner fra kreftceller og en gjennomsnittlig poengsum ble tatt. Observere mer enn to kopier av
CCND1
for hvert kromosom 11 ble ansett for å være et positivt tegn for
CCND1
genamplifikasjon.
Statistical Analysis
Statistisk analysen ble utført ved hjelp av SPSS versjon 12.0. Sammenhengen mellom FISH og IHC resultater og klinisk-patologisk variablene er utført ved hjelp av χ
2-test. For alle tester, en
p
-verdi av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
hele genomet profiler av 10 ESCC cellelinjer ved 1-Mb aCGH. Normaliserte log2 signalintensitetsforhold ble plottet ved hjelp SeeGH programvare. En log2 signal-forhold på 0 representerer tilsvarende kopitall mellom prøven og referansen DNA (detaljer i Materialer og Metoder). Cytoband mønster for hvert kromosom er til venstre for hver tomt. Vertikale linjer betegne log2 signalforhold -2 til 2 med kopi tallet øker til høyre og reduserer til venstre. Hvert svart prikk representerer en enkelt BAC klone
doi:. 10,1371 /journal.pone.0039797.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dr Tzer Jing Seng for hjelp av matrise-CGH, profs Gopesh Srivastava og George Tsao (University of Hong Kong) for noen ESCC og normale esophageal epiteliale cellelinjer, og DSMZ (tysk samling av mikroorganismer og amp; cellekulturer). for KYSE cellelinjer (Shimada et al, Cancer 69: 277-284, 1992)
.
