Abstract
WNT5A, et medlem av WNT familien av utskilt lipid-modifisert glykoproteiner, er en kritisk regulator av en rekke utviklingsprosesser, inkludert lem formasjon, lunge morphogenesis, intestinal forlengelse og melkekjertlene utvikling. Altered WNT5A uttrykk har vært forbundet med en rekke kreftformer. Interessant, i visse typer av kreftformer, som hematologiske ondartede sykdommer og kolorektal karsinom, er WNT5A inaktivert og utøver en tumor undertrykkende funksjon, mens i andre krefttyper, for eksempel melanom og gastrisk karsinom, er WNT5A overuttrykt og fremmer tumorprogresjon. Den mekanismen som WNT5A oppnår disse forskjellige aktivitetene i kreft er dårlig forstått. Her gir vi bevis for at
WNT5A
genet produserer to protein isoformer, WNT5A lang (WNT5A-L) og WNT5A-kort (WNT5A-S). Amino-terminal sekvensering og en WNT5A-L-spesifikt antistoff viser at de modne og utskilt isoformene er distinkte, med WNT5A-L bærer ytterligere 18 N-terminale aminosyrer. Biokjemisk analyse indikerer at begge rensede proteiner er like med hensyn til deres stabilitet, hydrofobisitet og WNT /β-catenin signaleringsaktivitet. Likevel, modulering av disse to
WNT5A
isoformer, enten gjennom ektopisk uttrykk eller knockdown, viser at de utøver forskjellige aktiviteter i kreftcellelinjer: mens WNT5A-L hemmer spredning av tumorcellelinjer, fremmer WNT5A-S deres vekst . Til slutt viser vi at ekspresjonen av disse to WNT5A isoformer er endret i bryst og cervix karsinomer, så vel som i de mest aggressive neuroblastom tumorer. I disse kreftformer, er WNT5A-L ofte nedregulert, mens WNT5A-S er funnet overuttrykt i en betydelig andel av tumorer. Til sammen gir vår studie tyder på at de forskjellige aktivitetene til WNT5A i kreft kan tilskrives produksjonen av to
WNT5A
isoformer.
Citation: Bauer M, Bénard J, Gaasterland T, Willert K, Cappellen D (2013)
WNT5A
Koder To isoformer med separate funksjoner i kreft. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10,1371 /journal.pone.0080526
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 10. juli, 2013, Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 18.11.2013
Copyright: © 2013 Bauer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Association pour la Recherche sur le Cancer (DC), Institut National du Cancer (JB), Société Française des Kreft de l’Enfant (JB), den europeiske bindevevs Cancer Network (DC og MB) og ved California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, RB1-01406, KW). MB ble tildelt stipend fra Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche og fra CIRM (TG2-01154). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
WNT5A
genet koder for en av de 19 wnt ligand familiemedlemmer. Ved binding til FZD (frizzled) [1], ROR1 /2 (Reseptor-tyrosin-kinase-lignende Orphan-reseptorer) [2,3] eller RYK (Reseptor-lignende tyrosinkinase) [4] reseptorer og LRP5 /6 (Low density lipoprotein receptor -relaterte Protein) co-reseptorer [5,6], wnt proteiner modulere kanoniske wNT /β-catenin signalveien, samt en rekke ikke-kanoniske β-catenin uavhengig trasé [7,8]. Wnt trasé spiller viktige roller under embryogenesen og voksent vev homeostase ved å regulere cellevekst, spredning, overlevelse, adhesjon og migrasjon. Endringer i WNT signalering blir ofte forbundet med onkogenese [7-9]. Spesielt, avvikende ekspresjon av visse WNTs, inaktivering av mutasjoner av APC og AXIN tumor-suppressorer og onkogene aktiverende mutasjoner i β-catenin (CTNNB1) har vist seg å bidra til celletransformasjon via deregulering av gener, for eksempel
c-MYC
og
CCND1 plakater (cyclin D1). Epigenetisk stanse av gener som koder for Wnt antagonister, slik som løselig decoy reseptorer SFRP (Utskilt frizzled Related Protein) eller DKK, også fører til deregulering av veien og har blitt observert i flere kreftformer [7]. En nylig omfattende studie av kolorektal kreft funnet at over 94% av kreft bærer mutasjoner i en eller flere wnt aliserte komponenter [10].
Blant Wnt signalkomponenter innblandet i onkogenese, er WNT5A spesielt interessant: det fungerer både som et oncoprotein og en tumor suppressor. I melanomer og mage og bukspyttkjertel karsinom,
WNT5A
er recurrently uttrykt og utøver en pro-onkogen funksjon ved å fremme spredning og /eller invasjon og metastase [11-16]. I kontrast,
Wnt5a
heterozygote mus er disponert for å utvikle B-celle lymfom gjennom tap av Wnt5a funksjon, og
WNT5A
genet inaktivering av somatiske slettinger eller hypermethylation er hyppig i human leukemi, lymfom og tykktarmskreft [17-20]. I tillegg hemmer WNT5A spredning av leukemi, lymfom og kolorektal karsinom-celler, noe som viser dens tumor undertrykkende funksjon i disse kreftformene [17,19,20]. Endelig har vi og andre vist at
WNT5A
uttrykk er nedregulert i menneskelige brystcarsinomer og spiller en tumor suppressor rolle ved å hemme spredning og /eller metastase [21-24]. Forskjeller i Wnt reseptor repertoar, og dermed i signalveier som utløses av WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], kunne forklare disse motstridende aktiviteter WNT5A i kreft. Her utforsket vi en alternativ mekanisme som WNT5A kunne utøve disse forskjellige aktivitetene, nemlig gjennom uttrykket og produksjon av forskjellige WNT5A isoformer. Nærmere bestemt har vi funnet at et amino-terminalt trunkert WNT5A isoform utstillinger tumorfremmende aktivitet, mens den full-lengde WNT5A protein utviser tumorundertrykkende aktiviteter.
Resultater
WNT5A
genet koder for to protein isoformer
For å finne ut om
WNT5A
koder flere protein isoformer, vi analysert sekvenser deponert i databaser og søkte etter mulige alternative transkripsjoner. Vi fant
WNT5A
genet produserer minst tre mulig
WNT5A
transkripsjoner fra alternativ transcriptional starte nettsteder. En transkripsjon starter på ekson 1 [19,20,28] og er spådd å kode et 380 aminosyre-WNT5A protein forløper, fra heretter referert til som WNT5A-L (Long) (figur 1A, B, Tall S1A og S1B). De to andre transkripter initiere 718 og 578 nukleotider oppstrøms for exon 2, i et alternativt ekson 1β (figur 1A, fig S1A og S1B). Begge ekson 1B-initiert transkripsjoner er forutsagt å kode for et 365 eller 360 aminosyrer (avhengig av bruk av startkodonet ved posisjon 16 eller 21 i forhold til start-kodonet av WNT5A-L) forløper protein, betegnet som WNT5A-S (Short), og mangler de første 15 eller 20 N-terminale aminosyrer sammenlignet med det WNT5A-L-forløper ([29] figurene 1A, B, fig S1A og S1B).
A. Oppbygging av den menneskelige
WNT5A
genet og alternative transkripsjoner. Nummererte boksene indikerer eksoner, med 5 «og 3» uoversatt (UTR) regioner i grå og kodende områder i svart. nt: nukleotider, kb: kilo base. Blå og røde piler og stiplede linjene indikerer henholdsvis posisjonene til de ulike transkripsjonsinitieringsseter områder i ekson 1 og exon 1β og spleising av ekson 1- og ekson 1B-initiert transkripsjoner. Blå og røde stjerner indikerer oversettelse innvielses kodoner for de WNT5A-L og WNT5A-S isoformer ligger i exon 1 og exon 2, henholdsvis. Blå og røde lyn piler indikerer posisjonen til målet sekvenser av
WNT5A-L Hotell og
WNT5A-S
bestemt kort interfering RNA (siRNA). B. Multiple aminosyresekvens innretting av den N-terminale ende av de WNT5A forløperproteiner. Den blå M betegner den mest sannsynlige startkodonet av WNT5A-L, mens den røde Ms betegne de mest sannsynlig startkodonene av WNT5A-S. De grå piler indikerer stillingene signal peptid spaltningsseter for begge isoformer som spådd av SignalP 4,1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Blå og røde piler indikerer posisjonen til de observerte første aminosyrer i det modne WNT5A-L og WNT5A-S-proteiner, henholdsvis, og således posisjonen for den observerte signalpeptidet spaltningssete for hver isoform. C. Påvisning av renset WNT5A isoformer. Venstre panel: Immuno-blot for WNT5A viser at begge isoformer er av samme molekylvekt (
≈43kDa). Høyre panel: Coomassie beiset gel viser at renset WNT5A forberedelsene er ren med stor grad ikke målbare forurensende proteiner. D. En anti-mus Wnt5a antistoff gjenkjenner begge isoformer (venstre panel), mens en (høyre panel) anti-kanin WNT5A-L spesifikt antistoff oppdager WNT5A-L, men ikke WNT5A-S isoform.
E. Triton X-114
faseseparasjon demonstrerer at både WNT5A isoformer skillevegg til den hydrofobe /organisk fase. WNT5A proteiner ble påvist ved immuno-blot-analyse med et anti-Wnt5a antistoff. F. Inkubasjon av rensede WNT5A isoformer ved 37 ° C i de angitte tidsrom indikerer at deres
i
vitro
stabilitet er lik. WNT5A proteiner ble detektert som i E og bandet intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare.
Den samlede exon-intron struktur av den menneskelige
WNT5A
genet er sterkt konservert i andre virveldyr, inkludert mus, kylling og sebrafisk (figur S2A).
WNT5A
genet er delt inn i 5 bevarte eksoner. Lengde, sekvens, og spleiseseter i kodon over eksoner 2 – 5 er høyt konservert. Den uoversatt regionen ekson 1 er mer avvek, men spleisesetet er bevart. Dette exon-intron ordning er også bevart i det nært beslektede
WNT5B
genet, som kommenterte i pattedyr genomer. Det er interessant alternativ ekson 1β, som er innleiret i den første intron, er også til stede i disse virveldyr. Hos mus er ekson 1β oppdaget i alternative Wnt5a utskrifter og aksjer betydelig homologi med den menneskelige sekvens. I en parvis innretting, elementet omfatter oppstrøms regulatoriske regionen og exon 1 β er 95% konservert mellom menneske og mus (figur S2B). Hos fugler (kylling og Sebrafink), har denne alternative exon ikke er merket, men tilstedeværelsen av et sterkt konservert sekvens med et spleisedonor ved 3′-enden indikerer at dette exon 1β er til stede. Den parvise justering mellom kylling og sebra Finch av dette elementet viser 96% bevaring. Videre er to korte sekvenser innenfor disse elementene svært konservert mellom pattedyr (mus og mennesker) og fugler (kylling og sebra Finch) (figur 2B). Fisk (sebrafisk og stingsild) inneholder også en svært konservert element i denne regionen. Selv om dette element ikke er blitt kommentert som en exon er i databasen, den forhøyede bevaring (74%) antyder tilstedeværelse av en ytterligere ekson i fisken (figur 2B). Sammen, den observerte høye grad av sekvenskonservering genomisk tyder på at alternative Wnt5a transkripter, i likhet med de som er beskrevet her, er tilstede i mange arter virveldyr. Til slutt blir innrettingen av amino-terminale aminosyrer av human, mus og kylling Wnt5a viser at startkodon M21 (posisjon i forhold til start-kodonet av WNT5A-L) fullstendig konservert (figur 1 B), noe som tyder på at WNT5A-S initierer i denne posisjon.
Begge WNT5A proteiner blokkere Wnt3a-aktivering av β-catenin /TCF-drevet transkripsjonen aktivitet i HEK 293 (TOP-Luciferase, A.) og MDA-MB-231 (TOP-GFP reporter, B.). Celler ble behandlet med renset Wnt3a og en økende konsentrasjon av WNT5A i 24 timer (A) eller 48 timer (B). C. Ved transfeksjon, både WNT5A isoformer forstyrre endogen (MDA-MB-231, venstre panel) og WNT1-indusert (HeLa, panel høyre) β-catenin /TCF-drevet transkripsjon i MDA-MB-231 (venstre panel) og HeLa-celler (panel til høyre). Celler ble transfektert med kontroll, WNT5A-L eller WNT5A-S ekspresjonsvektorer alene, eller sammen med en WNT1 ekspresjonsvektor og analysert for β-catenin /TCF-drevet TOP-luciferase reporter-aktivitet. En ekspresjonsvektor som koder for en dominant-negativ form av TCF4 (ΔNTCF4) ble anvendt for å interferere med den endogene rapportøraktivitet i MDA-MB-231-celler. D. Både WNT5A isoformer fremme DVL fosforylering. L-celler (venstre panel) og C2C12 celler (panel høyre) ble behandlet med WNT5A isoformer (10 nM, 2 timer) og helcellelysater ble immuno-strøket med de angitte antistoffer. Begge WNT5A isoformer, samt Wnt3a (10 nM, 2 timer), førte til en mobilitetsforskyvning av Dvl1 og Dvl2 proteinene, noe som tyder på at dvl proteiner er post-translasjonelt modifisert ved fosforylering som respons på både kanoniske (Wnt3a) og ikke-kanonisk Wnt (WNT5A) signalering. Bare Wnt3a induserte akkumuleringen av β-catenin protein. Merk: p-catenin opphopning i respons til Wnt3a i C2C12 celler er ikke synlig i disse helcellelysater fordi disse cellene inneholder store mengder av membran /adherens krysset forbundet β-catenin
Som tilfellet. for de fleste utskilte proteiner, er wnt forløperne spaltes i aminoenden for å fjerne signalsekvensen for derved å gi det modne polypeptidet. Et signal peptid cleavage prediksjon algoritme (
SignalP 4,1 Anmeldelser – https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) spår at begge WNT5A forløpere gi proteiner med enten 343 aminosyrer (start med QVVIEA … ) eller 338 aminosyrer (start med ANSWWS …). Sistnevnte spådd cleavage området har høyest cleavage score (Y-score på 0,625 for WNT5A-S [starter på M21] og 0,246 for WNT5A-L). Imidlertid amino-terminal sekvensering av mus Wnt5a indikerte at signalsekvens spalting fant sted ved en posisjon 24 rester nedstrøms fra det forutsagte området [3]. Videre, siden den 15 aminosyre-forskjell i den N-terminale sekvens av WNT5A-L og WNT5A-S-forløpere kan påvirke posisjonen av signalpeptidet spalting, vi eksperimentelt bestemte identiteten av aminoendene av de modne proteiner.
For å identifisere posisjonen for signalpeptidet spalting og den første aminosyre av den modne proteiner, renset vi begge WNT5A isoformer. Ved hjelp av en tidligere utviklet CHO-ekspresjonssystem [30], vi uavhengig er overuttrykt hver WNT5A isoform og renset dem fra det kondisjonerte medium (CM), i henhold til publiserte protokoller [3,31]. Begge WNT5A isoformer ble utskilt i CM i like nivåer (data ikke vist), og ble renset til nær homogenitet (~ 95% rent, bedømt ved Coomassie-farging, figur 1C). Amino-terminal sekvensering viste det rensede WNT5A-L-protein for å starte en aminosyre nedstrøms av den forutsagte signalpeptid-spaltningssetet, og dermed generere et 337 aminosyre protein som begynner med sekvensen NSWWS … (figur 1B, Fig S1B og S1C). Den utskilte WNT5A-S-protein manglet en ekstra amino-terminale 18 aminosyren til å generere et protein på 319 aminosyrer som starter med sekvensen IIGAQ … (figur 1B, Fig S1B og S1C). Derfor er de to isoformer generere proteiner med forskjellige aminoterminale sekvenser. Den WNT5A-S-amino-terminus likt det i mus Wnt5a, som tidligere ble identifisert ved amino-terminale peptid-sekvensering [3]. Interessant, gjorde signal peptid cleavage algoritme ikke forutsi denne posisjonen som en sannsynlig åsted for signalsekvensen cleavage for enten WNT5A-L eller WNT5A-S (Y-score på 0,16 for WNT5A-S og 0,113 for WNT5A-L).
for å bekrefte den distinkte amino terminal sammensetningen av både modne WNT5A isoformer, genererte vi et antistoff rettet mot WNT5A-L-spesifikke 18 aminosyre (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). I Immuno-blotter, den WNT5A-L-spesifikt antistoff bare anerkjent WNT5A-L og ikke WNT5A-S (figur 1D). Dette viser at ekson 1- og ekson 1β-initiert
WNT5A
transkripsjoner produsere ulike WNT5A proteiner som er forskjellige i sin amino termini. Mekanismen ved hvilken disse to forløpere er differensielt prosessert for å gi forskjellige modne proteiner er foreløpig uklart, men vi spekulere at forskjeller i aminoendene påvirke valget av behandlingen maskineri å spalte proteinene ved forskjellige posisjoner. Videre studier er nødvendig for å løse disse spørsmålene.
wnt proteiner er meget hydrofobe, en egenskap formidles av kovalent binding av i det minste ett lipid molekyl til en konservert rest [31,32]. Denne modifikasjon er viktig for riktig prosessering og sekresjon [32,33]. I tillegg, som avslørt av Wnt-Fzd co-krystallstruktur, er det lipid delen kritisk for reseptorbinding [34]. For å møte om de to WNT5A isoformer skilte seg i sine hydrofobe egenskaper, og følgelig i sine lipid modifikasjoner, vi brukte faseseparasjon egenskap av detergenten Triton X-114. Vi observerte ingen forskjell mellom de to isoformer, da de begge fordelt likt til den organiske fase (figur 1E), således som tyder på at begge isoformer er tilsvarende modifisert. For å teste om de to isoformer avvek i deres stabilitet, vi inkuberes hvert protein ved 37 ° C i opptil 60 timer. Immuno-blot påvisning indikerte at begge proteinene brytes ned til like priser (figur 1F). Derfor er de to WNT5A isoformer oppfører seg på samme måte med hensyn til deres
in vitro
stabilitet og hydrofobisitet. Det er imidlertid mulig at hver isoform har forskjellige biokjemiske egenskaper i en
in vivo
omgivelser, en mulighet vi ikke har adressert.
Effekter av WNT5A-L og WNT5A-S-isoformer på signalerings trasé
Flere wnt signalveier har blitt beskrevet og foreslått. Den mest vanlig studerte og best etablerte vei, ofte referert til som den kanoniske WNT vei, omfatter β-catenin som en sentral formidler. Andre ikke-kanoniske trasé, som fungerer uavhengig av β-catenin, er dårlig forstått. I det minste, er disse to banene tenkte å dele følgende komponenter: Wnt ligander, FZD reseptorer og Dishevelled (DVL) signaldetektorer. Selv om WNT5A er hovedsakelig assosiert med ikke-kanonisk WNT signalering, er det også blitt funnet å aktivere kanonisk β-catenin signalisering i bestemte forhold [3]. Vi har undersøkt om de WNT5A isoformene forskjellig innvirkning på β-catenin /TCF signalveien. For dette formål genereres vi to cellelinjer, HEK-293 og MDA-MB-231, som bærer et WNT /β-catenin spesifikke rapportørsystem. Dette reporter systemet består av en WNT responsive element består av 7 multimerized TCF bindingsseter (referert til som TOP for TCF Optimal Promoter [35,36]), som regulerer uttrykket av en reporter gen, enten Luciferase for HEK 293 celler (HEK293- TOP-Luciferase, figur 2A, figur S3A) eller GFP for MDA-MB-231 celler (MDA-MB-231-TOP-GFP, figur 2B Figur S3b). Disse rapportør cellene er potente aktiveres ved Wnt3a (figur 2A og B), en WNT protein som vanligvis brukes til å stimulere den kanoniske signalveien. I kontrast, verken WNT5A isoformen aktivert eller konsekvent modulert den basale aktiviteten til disse journalistene (Figur S3A og S3b), noe som indikerer at disse cellulære systemer ikke gir det riktige miljøet for å koble WNT5A aliserte til den kanoniske β-catenin veien.
Sensitive og robuste cellebaserte analyser for ikke-kanoniske WNT signale er knappe. Imidlertid har ikke-kanoniske WNT signale vist seg å motvirke WNT /β-catenin signalering, en aktivitet som kan analyseres ved hjelp av TOP-reporter system [3]. Vi har funnet at begge WNT5A isoformer inhibere WNT3A-indusert aktivering reporter på en doseavhengig måte (figur 2 A og B). Disse resultater viser at, til tross for forskjellen i deres amino-termini, begge WNT5A proteiner potent antagonisere WNT /β-catenin signalering. Tilsvarende hemmende effekter av WNT5A-L og WNT5A-S-isoformer på WNT /β-catenin-drevet reporter ble observert når cellene ble transfektert med ekspresjonsvektorene (figur 2C) i stedet behandlet med renset WNT5A-L og WNT5A-S-proteiner. Derfor, i disse analysene, er WNT5A isoformene viser lignende biologiske aktiviteter når den leveres som rensede proteiner eller transfekterte gener.
WNT signalering, kanoniske og ikke-kanoniske, fører til hyperfosforylering av DVL proteiner, signalmolekyler som fungerer umiddelbart nedstrøms FZD reseptorer. Denne post-translasjonell modifikasjon av dvl proteiner lett kan påvises ved hjelp av en elektroforetisk mobilitet skift [37-39]. Vi har funnet at behandling av to cellelinjer (mus L-celler og mus myoblast C2C12-cellelinje) med enten WNT5A isoform, samt WNT3A, induserer en mobilitetsforskyvning av dvl proteiner, som detektert ved immuno-blotting for Dvl1 og Dvl2 (figur 2D). Men etter avtale med de forskjellige aktivitetene til WNT3A og WNT5A isoformer på WNT /β-catenin signal (Tall 2A, 2B, figur S3A, S3b), bare Wnt3a, men ikke WNT5A isoformer, indusert opphopning av β-catenin protein, som dokumentert i L-celler. Dette β-catenin akkumulering av proteiner, er ikke tydelig i C2C12 celler som allerede uttrykker høye nivåer av β-catenin (figur 2D). Tatt sammen, våre data tyder på at de to WNT5A isoformer oppviser identiske biologiske aktiviteter i den etablerte cellebasert WNT aliserte analyser.
Expression of WNT5A isoformer i kreftcellelinjer og normalt vev
Tidligere studier av WNT5A uttrykk har ikke diskriminert mellom de to isoformer er beskrevet her. Derfor har vi målt sine transkripsjonsnivåer i kreftcellelinjer og i normalt vev ved å utføre kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) med isoform-spesifikke primere (se tabell S1 og figur S1). Denne analysen viste at ekspresjonen av disse isoformene er meget variabel mellom de enkelte kreftcellelinjer. For eksempel, mens MDA-MB-231 (avledet fra et bryst karsinom) og SH-SY5Y (avledet fra en neuroblastom) uttrykker overveiende
WNT5A-L
, HeLa celler (avledet fra en cervix karsinom) uttrykker overveiende
WNT5A-S plakater (figur 3A). Andre cellelinjer, inkludert MCF-7 (avledet fra en bryst-karsinom) eller IMR-32 (avledet fra en neuroblastom) uttrykker ekstremt lave nivåer av enten WNT5A isoform (figur S4A). Selv om mindre kvantitativ, gel analyse av endepunkts RT-PCR produktene fremstilt av representative cellelinjer bekreftet QRT-PCR data (figur S4A). Vi neste analysert transkripsjonsnivåer av WNT5A isoformer i normale voksne vev. Vi oppdaget
WNT5A-L
uttrykk i nesten alle vev, bortsett fra fettvev. I motsetning til dette har vi oppdaget
WNT5A-S
ekspresjon bare i placenta, og, i mindre grad, i luftrøret og tynntarmen (fig S4B).
A. WNT5A isoform uttrykk i tre kreftcellelinjer. Transkripsjonsnivåer av
WNT5A
isoformer ble bestemt i MDA-MB-231 (brystkreft), HeLa (cervix karsinom), og SH-SY5Y (neuroblastom) ved QRT-PCR og normalisert etter
EF1-α
mRNA (normalisering av
GAPDH
mRNA og
18S
rRNA produsert lignende resultater). Mean forholdstall (
WNT5A
isoformer /
EF1-α
) ± SEM fra uavhengige målinger er vist. B. Effekter av ektopisk uttrykk for WNT5A-L og WNT5A-S isoformene på spredning. De angitte cellelinjer ble omformet med ekspresjonsvektorer koder WNT5A-L (blå linje), WNT5A-S (rød linje) eller ingen WNT (svart linje) og celletall ble bestemt ved 3 og 6 dager. WNT5A-S øker mens WNT5A-L synker proliferativ priser. Data (gjennomsnitt ± SEM fra tre bestemmelser) fra et representativt eksperiment vises. Hvert eksperiment ble utført minst tre uavhengige ganger. C. isoform spesifikke sirnas redusere uttrykk for hver WNT5A isoform. Effektiviteten av WNT5A-L og WNT5A-S-isoformen knockdown (KD) ble evaluert i MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y transfektert med kontroll siRNA og
WNT5A
isoform-spesifikk siRNA (KD).
WNT5A
isoformene transkripsjonsnivåer ble målt ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og normalisert etter
EF1-α
mRNA (normalisering av
GAPDH
mRNA og
18S
rRNA produsert lignende resultater). D. Effekter av siRNA-mediert knockdown (KD) av WNT5A-L og WNT5A-S isoformene på spredning. Cellene ble transfektert med sirnas spesifikke for WNT5A-L (blå linje) eller WNT5A-S (rød linje) og celletall ble bestemt ved 3 og 6 dager. En egge siRNA fungerte som kontroll (svart linje). Co-transduksjon av celler med en WNT5A-S-ekspresjonsvektor redder virkningen av WNT5A-S-spesifikke siRNA (stiplet rød linje). Data (gjennomsnitt ± SEM fra tre bestemmelser) fra et representativt eksperiment vises. Hvert eksperiment ble utført minst tre uavhengige ganger. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0.005; ****
P
0,001. E. Differential regulering av
AXIN2 Hotell og
CDK8
uttrykk ved isoform-spesifikke knockdown av WNT5A. Transkripsjonsnivåer av
AXIN2 Hotell og
CDK8
ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR-analyse (normalisert ved
EF1-α
mRNA) i kontroll MDA-MB-231 (brystkreft ), HeLa (cervix carcinoma) og SH-SY5Y (neuroblastom) celler, og i respons til siRNA-mediert knock-down (KD) av WNT5A-L eller WNT5A-S. Gjennomsnittlig forholdstall ± SEM fra uavhengige målinger er vist.
WNT5A-S fremmer og WNT5A-L undertrykker vekst av kreftcellelinjer
For å studere funksjonene til de WNT5A isoformer, manipuleres vi deres uttrykk i flere cellelinjer, inkludert MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y og analysert fenotypiske konsekvenser (figur 3B-D, figur S5). Siden signaleringsaktiviteter av rensede proteiner wnt er kortvarige [30] og biologiske analyser generelt krever lange perioder med stimulering, benyttet vi transfeksjon av
wnt
gener i stedet for anvendelse av rensede proteiner. Ektopisk ekspresjon av WNT5A-L vesentlig redusert antall celler i disse cellelinjer (figur 3B). ble det ikke observert noen tegn på øket celledød (data ikke vist), noe som indikerer at WNT5A-L virker til å inhibere celleproliferasjon. I kontrast, ektopisk uttrykk for WNT5A-S fremmet spredning av MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y celler (Figur 3B)
Ved hjelp isoform spesifikke sirnas (se Figur S1, Tabell S2). Vi forstyrret uttrykk for hver WNT5A isoform (Figur 3C). De sirnas var i stand til å spesifikt knockdown sine mål på opptil 80% som bestemt ved QRT-PCR (figur 3C). Viktigere, hver WNT5A isoform er selektivt hemmet ved det tilsvarende siRNA uten å påvirke nivåer av den andre isoformen. I samsvar med spredning fremme effekter av WNT5A-S ektopisk uttrykk, knockdown av WNT5A-S redusert antall celler (figur 3D). Selv i celler som uttrykker lave WNT5A-S-nivåer, for eksempel MDA-MB-231 (figur 3A), knockdown av WNT5A-S-isoformen produsert en sterk hemmende effekt (figur 3D). Cellen hemming som følge av WNT5A-S siRNA ble reddet i alle testede cellelinjer av co-transduksjon med en WNT5A-S vektor blottet for siRNA målsekvens (figur 3D, KD WNT5A-S + redning). Disse livredning data viser at virkningen av denne siRNA skyldes WNT5A-S knock-down fremfor ikke-spesifikke off-target effekter. Videre WNT5A-S knockdown økt celledød i de tre cellelinjer (figur s5a) og indusert caspase aktivitet i MDA-MB-231 og HeLa (figur S5b). Imidlertid ≥3-gangers reduksjon i celletall (figur 3D) skredet den observerte beskjeden økning i celle-død (fig S5a), noe som tyder på at WNT5A-S knockdown hovedsakelig svekket proliferasjon. I motsetning til dette, knockdown av WNT5A-L hadde ingen virkning på celleformering (figur 3D), celledød eller kaspase-aktivitet i de 3 cellelinjer (figur 3D, fig S5a, B). Samlet utgjør disse eksperimentene viser at endogent og ectopically uttrykt WNT5A isoformer utøve klare effekter i bryst, livmorhals og neuroblastom tumorcellelinjer, med WNT5A-S fremme og WNT5A-L hemme celledeling. Siden vi ikke observerer forskjellige signal aktiviteter for WNT5A-L og WNT5A-S i WNT /β-catenin og DVL fosforylering analyser (figur 2), spekulerer vi at disse vekstfremmende og hemmende aktiviteter WNT5A er uavhengige av den kanoniske WNT signalveien .
I et forsøk på å identifisere en mekanisme som WNT5A isoformer utøve forskjellige effekter på spredning, skjermet vi uttrykket av flere kjente Wnt regulert gener. Vi fant at uttrykket av to gener,
AXIN2 Hotell og
CDK8
, som begge har vært innblandet i ulike aspekter av WNT signaliserer [7,40,41], ble ulikt regulert av isoform- spesifikk knockdown av WNT5A. Knockdown av WNT5A-L, men ikke WNT5A-S, førte til en nedgang i
AXIN2
uttrykk i tre testet cellelinjer (MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y, Figur 3E). I kontrast, knockdown av WNT5A-S, men ikke WNT5A-L, førte til en økning i
CDK8
uttrykk i 2 av 3 cellelinjer (MDA-MB-231 og HeLa) og en reduksjon i SH- SY5Y (Figur 3E). Denne informasjonen gir en potensiell molekylær forbindelse mellom de observerte ulike effekter av WNT5A isoformer på spredning og genregulering og indikerer at hver WNT5A isoform treffer genuttrykk i en tydelig måte. Videre uttømmende studier, som transkriptomet analyse vil være nødvendig for å identifisere og definere trasé som formidler disse forskjellige effekter.
nedregulering av WNT5A-L og overekspresjon av WNT5A-S isoform i kreft
For å finne ut om de respektive pro- og anti-proliferative funksjoner av WNT5A-S og WNT5A-L isoformene er relevante for onkogenese, vi analyserte sine uttrykk nivåer av QRT-PCR i primærtumorprøver fra bryst og livmorhals karsinomer og neuroblastomer. I forhold til normale bryst vev,
WNT5A-L
ble nedregulert ≥3 ganger i 46% (14 av 30) av brystcarsinomer (
P
= 0,04) (Figur 4A) .
WNT5A-S
var umulig å oppdage i normalt brystvev og overexpressed i en liten undergruppe av brystkreft (4 av 30, 13%, n. S.) (Figur 4A). I normal livmor cervix epitel, både
WNT5A-L Hotell og
WNT5A-S
ble uttrykt,
WNT5A-L
å være den dominerende isoform (figur 4B). Sammenlignet med normal cervix,
WNT5A-L
ble nedregulert ≥3 ganger i 53% (8 av 15) av cervix karsinom (
P
= 0,047). I kontrast,
WNT5A-S
ble oppregulert ≥4 ganger i 40% (6 av 15) av disse tumorer (
P
= 0,045) (figur 4B). Neuroblastomer, pediatriske kreftformer i det sympatiske nervesystemet, kan deles inn i lav og høy risiko svulster med 90% og 30% for å overleve, henholdsvis. Halvparten av den høye risikoen neuroblastomer er dødelig i løpet av 2 år fra diagnose [42]. Høyrisiko neuroblastomer viste lav
WNT5A-L
uttrykk oftere enn lave svulster risiko (55% -22 av 40- versus 21% -8 av 37-,
P
= 0,004), og dermed noe som antyder at WNT5A-L nedregule korrelerer med høy risiko neuroblastom.
