Abstract
Bakgrunn
Protein og antistoff arrays har dukket opp som en lovende teknologi for å studere protein uttrykk og protein funksjon i en high-throughput måte. Disse arrays representerer også en ny mulighet til å profilere protein uttrykk nivåer i kreftpasienters prøver og å identifisere nyttige biosignatur for klinisk diagnose, sykdom klassifisering, prediksjon, narkotika utvikling og pasientbehandling. Vi søkte antistoff arrays for å oppdage et panel av proteiner som kan tjene som biomarkører for å skille mellom pasienter med eggstokkreft og normale kontroller.
Metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av en case-control studie design 34 ovarian kreftpasienter og 53 alderstilpassede friske kontroller, vi profilert uttrykket nivåer av 174 proteiner ved hjelp av antistoff array-teknologi og bestemt ca125 nivå ved hjelp av ELISA. Uttrykket nivåer av disse proteinene ble analysert ved hjelp av 3 diskriminantfunksjoner metoder, herunder kunstige nevrale nettverk, klassifisering treet og split-poeng analyse. Et panel av 5 serumproteinmarkører (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R-alfa, og OPG og CA125) ble identifisert, noe som effektivt kan oppdage kreft i eggstokkene med høy spesifisitet (95%) og høy følsomhet (100%), med AUC = 0,98, mens CA125 alene hadde en AUC på 0,87.
Konklusjon /Betydning
Vår pilotstudie har vist lovende sett av 5 serum markører for deteksjon eggstokkreft.
Citation: Jiang W, Huang R, Duan C, Fu L, Xi Y, Yang Y, et al. (2013) Identifisering av fem serumprotein Markører for påvisning av Eggstokkreft av antistoff Arrays. PLoS ONE 8 (10): e76795. doi: 10,1371 /journal.pone.0076795
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 28 august 2013; Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble delvis støttet av RayBiotech biomarkører Pilot Grant. Forfatterne ønsker å uttrykke sin takk for støtte fra ledende vitenskapsprosjekt for Guangzhou økonomisk utvikling distriktet (2009L-P180); Program hundre ledende innovatører og entreprenører (LCY201111); Guangdong innovativ forskning team program (201001s0104659419) og forskningsmidler fra den økonomiske utviklingen distriktet Guangzhou (2010Q-P450). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Weidong Jiang, Ruochun Huang og Ruo-Pan Huang er ansatte i RayBiotech, Inc. , som utvikler og kommersialiserer protein array-teknologi og produkter. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft er den tredje hyppigste kreft og er en av de viktigste årsakene til kreft død blant kvinner i USA og Europa [1-3]. De fleste symptomer på eggstokkreft er vage og lik de ofte opplevd med mer vanlig, ikke-livstruende helsemessige forhold; disse kan inkludere abdominal hevelse eller oppblåsthet, bekkensmerter eller ubehag, smerter i korsryggen, tap av appetitt eller mett raskt, vedvarende dårlig fordøyelse, gass eller kvalme og endringer i tarm eller blære vaner. Som et resultat, er nesten 80% av ovarialcancer diagnostiserte pasienter på senere stadier. Dessverre er det 5-års overlevelse for pasienter med klinisk avansert eggstokkreft bare 15% til 20%, i slående kontrast til en 5-års overlevelse på over 90% for pasienter med stadium I sykdom. Derfor er det presserende å oppdage og utvikle biomarkører for eggstokkreft screening og tidlig oppdagelse.
Foreløpig CA-125 og bildebehandling er de 2 vanligste metodene for eggstokkreft screening tester. Imidlertid er disse 2 markører, enten brukt alene eller i kombinasjon, er ikke nyttige screening eller diagnostiske formål på grunn av lav spesifisitet og /eller følsomhet. For eksempel har serum CA-125 er vist å ha en følsomhet på . 98%, men en spesifisitet på bare 50-60% for tidlig stadium sykdommen [4-6]
Flere studier er blitt rapportert å identifisere serum eggstokkreft biomarkører ved hjelp av multiplex antistoff array-teknologi [7-9]. Dr. Lokshin gruppe identifisert en gruppe av seks serum protein markører, inkludert interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), epidermal vekstfaktor (EGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), monocytt kjemotiltrekkende protein -1 (MCP-1), og CA-125, som oppviste signifikant forskjell i serumkonsentrasjoner mellom eggstokkreft og kontrollgruppene med 84% sensitivitet på 95% spesifisitet [7]. Dr Gil Mor gruppe identifiseres et panel på 6 biomarkører, CA-125, osteopontin (OPN), insulinlignende vekstfaktor 2 (IGF-II), makrofag migrerings inhibitorisk faktor (MIF), leptin og prolactin, som viste en følsomhet på 95,3 % og en spesifisitet på 99,4% for påvisning av kreft i eggstokkene [8]. Ved hjelp av menneskelige biotin-baserte antistoff arrays, vist vi serum uttrykk profiler av 507 proteiner i serumprøver fra 47 pasienter med eggstokkreft, 33 pasienter med benign eggstokkene massene og 39 friske, alderstilpassede kontroller og identifiserte vesentlige forskjeller i proteinuttrykk mellom normal kontroller og pasienter med eggstokkreft (
P
0,05). Ved klassifiseringsanalyse og splitt-poeng analyse av disse 2 grupper, en 6-markør panel av proteiner, som besto av interleukin-2-reseptor alfa (IL2Rα), endotelin, osteoprotegerin (OPG), vaskulær endotelial vekstfaktor D (VEGF-D ) og betacellulin (BTC), kan brukes til å skjelne eggstokkkreftpasienter fra normale individer [9]. Disse studiene sterkt at antistoff array-teknologi har vist store løftet i oppdagelsen og utviklingen av serum eggstokkreft biomarkør profiler og sterkt at serum cytokin paneler kan være nyttig som biomarkører for tidlig deteksjon av eggstokkreft.
I denne studie, brukte vi vår 174-markør, sandwich-ELISA-baserte antistoff array-paneler til skjermen serumprøver fra 34 eggstokkreft pasienter og 53 friske frivillige for å identifisere et serum protein markør panel for påvisning av kreft i eggstokkene.
Resultater
Validering av 174-markør semi-kvantitative cytokin arrays (figur 1, 2)
Panel A (til venstre) viser sterk intra-assay korrelasjon (samme prøven analysert på samme glass-slide , testet på samme dag); Panel B (midten) viser sterk inter-assay korrelasjon (samme prøven analysert på ulike glassplater, testet på ulike dager); Panel C (til høyre) viser dårlig samsvar mellom kreft og normale prøver analysert på de samme glass, testet på samme dag
Panel A (til venstre) viser representative fluorescerende signalbilder rekke G6.; Panel B (midten) viser representative fluorescerende signalbilder for matrisen G7; Panel C (til høyre) viser representative fluorescerende signalbilder for utvalg G8.
I denne studien har vi brukt antistoff array-teknologi for å bestemme uttrykket profiler av 174 cytokiner i serum fra eggstokkreft pasienter og alders- tilsvarende friske normale kontroller. Cytokiner i denne studien inkluderte anti-inflammatoriske cytokiner, proinflammatoriske cytokiner, vekstfaktorer, angiogene faktorer eller kjemotaktiske cytokiner, blant andre. Noen av disse cytokinene velig er endret hos eggstokkreft pasienter fra våre egne studier og litteratur, men vårt brede skjermen på 174 proteiner også inkludert mange andre typer markører som en del av en «objektiv» tilnærming for å bruke høy-innhold, high-throughput cytokin antistoff arrays for å profilere de cytokin nivåer fra eggstokkreft pasienters serum med mål om å identifisere potensielle diagnostiske biomarkører.
Først må vi fastslått ytterligere reproduserbarheten til analysen i analyse av humant serum ved hjelp av scatter-plot analyse. Intra-lysbilde reproduserbarhet for de glass-slide-baserte matriser ble bedømt ved å teste replikere porsjoner av de samme prøvene med to deloppstillinger som er trykt på den samme lysbilde og analysert samtidig. Den inter-lysbilde reproduserbarhet ble bestemt ved hjelp av to ulike sider som skrives ut med de samme matriser ble analysert ved hjelp av dupliserte porsjoner av de samme prøvene på to ulike dager. Pearsons korrelasjonskoeffisienter for intra-lysbilde og inter-lysbilde reproduserbarhet var 0,923 (
P
0,001) og 0,899 (
P
0,001) henholdsvis, noe som tyder høy reproduserbarhet av analysen. I kontrast, Pearsons korrelasjonskoeffisient for kreft vs. normale prøvene var 0,226 (
P
0,005)., Noe som tyder på at kreftprøver og normale prøver er fra to forskjellige populasjoner
Neste, serum fra totalt 34 eggstokkreft pasienter og 53 friske kontroller ble analysert for uttrykk nivåer av 174 cytokiner med mål om å finne nye diagnostiske markører for kreft i eggstokkene. Disse serumprøver ble i hovedsak hentet fra våre samarbeidspartnere og var alders- og kjønns matchet (tabell 1). Menneskelig cytokin Antistoff Arrays ble brukt til å profilere uttrykk mønstre for 174 cytokiner i alle 87 pasienters serum. Signalet intensitet er proporsjonal med ekspresjonsnivået av et protein i hver prøve. Matrisen Dataene ble deretter normalisert basert på det gjennomsnittlige positive styresignalstyrken for hver matrise. Median signal intensiteter av hvert sted ble så korrigert for lokal bakgrunn. For å etablere en signalterskel, signalintensiteten cut-off-verdi ble bestemt ved +/- 2SD av 10 buffer blank styresignalintensitetene, hvor matriser ble inkubert med blokkeringsbuffer i stedet for pasientens serumprøver. Noen verdier som overstiger terskelsignalet ble betraktet som ekte signaler (dvs. en positiv påvisning av cytokin). Verdier lavere enn signal cut-off ble tildelt en verdi på 1. Hvis målte signalintensitetsverdier fra alle prøvene for en bestemt cytokin ble en, ble de cytokiner fjernet fra listen for videre analyse.
Eggstokkreft
Sunn Kontroll
Totalt antall
3453Mean Age61.751.2Median Age6656.2Age Range26-7928-79
Kreft Characteristis
Histologi
Serous Adenoocarcinoma29Mucous Adenocarcinoma4Germline tumor1
Stage
Stage I4Stage II3Stage III IV25NA2Table 1. Studer befolknings egenskaper.
CSV ned CSV
Identifikasjon av serumproteinmarkører av kunstige nevrale nettverk analyse (figur 3)
3a. Kunstige nevrale nettverk analyse av 174-markør antistoff matrise resultater sammenligne eggstokkreft og friske kontroller. Prøvene som representerer både treningssettet og forutsigelse sett er vist i diagrammet.
3b. De 8 beste markører med størst effekt i kunstige nevrale nettverk analyse av 174-markør antistoff arrays i eggstokkreft og friske kontroller presenteres.
Etter normalisering og filtrering, ble dataene deretter utsatt for kunstig nevrale nettverk (ANN) analyse. Signalintensitetsdata for individuelle pasienter ble tilfeldig delt inn i treningssettet (N = 51) eller forutsigelse sett (N = 36). I prediksjon oppdagelse fasen, ble treningssettet analysert ved hjelp leave-en kryssvalidering tilnærming. Gjennom denne analysen, ble totalt 8 prediktorer identifisert. Disse 8 prediktorene ble deretter brukt til å forutsi den sykdomsstatus i forutsigelse settet. Riktig avtale spådd sykdomsstatus ved bruk av 8-markør panel med klinisk diagnose i treningssettet og prediksjon sett var henholdsvis 82% og 80%.
Identifisering av 5-markør panel for påvisning av kreft i eggstokkene (Tall 4 og 5)
Panel A (øverst til venstre): Dot histogram tomt med 5-analytt delt poengene klassifisering av sera fra friske kontroll (N) og eggstokkreft (CA). Riktig klassifisert normale serumprøver bør ha en score på 0-2, mens prøver fra eggstokkreft pasienter bør ha en score på 3-5; Panel B (øverst til høyre): ROC-kurven for 5-markør panel av split-poengsum analyse av eggstokkreft vs. friske kontroller. ROC er kurven plottet av følsomhet (sanne positive) mot en-spesifisitet (falske positive) verdier; Panel C (nederst til høyre): Tabell bruker fem-markør split-poengene for å klassifisere eggstokkreft pasienter. En cut-off score på tre ble brukt.
Neste, av disse 8 markører, valgte vi fire, makrofag stimulerende protein alfa (MSP-alfa), vev hemmer av metalloproteinaser-4 (TIMP-4 ), blodplate avledet vekstfaktor reseptor alfa (PDGF-R alfa), og osteoprotegerin (OPG), for hierarkisk klyngeanalyse i SPSS programvare. Ved hjelp av 4-markør panel ovenfor, ble 83% av prøvene korrekt identifisert (95% av friske kontroller og 62% av ovariekreft).
Til slutt ble alle 87 prøvene analysert ved hjelp av de ovenfor angitte 4 blodprøver pluss CA125 bruker split-poeng analyse. Ved hjelp av stillingen cutoff på 3, 100% ovarian cancer og 95% frisk kontrollprøver ble korrekt identifisert, noe som gir den totale riktig avtale på 96,6%.
Siden CA125 er den mest anvendte markør for eggstokk-kreft, sammenlignet vi AUC mellom CA125 alene som i vår 5-markør panel, som bestemmes av ROC kurver. CA125 alene har en AUC på 0,87. På den annen side, har vår nylig identifiserte 5-markør panel en AUC på 0,98. Dermed har vår pilotstudie identifiserte en lovende sett med 5 serummarkører for tidlig deteksjon av kreft i eggstokkene.
Validering av 5-markør panel for påvisning av kreft i eggstokkene med ELISA-analysen (figur 6)
Nivåer av to proteinmarkører (MSP-alfa og TIMP-4) som er identifisert som blir uttrykt forskjellig i eggstokkreft prøver ved hjelp av antistoff arrays ble bekreftet med ELISA. De antistoff-array-data var fullstendig overensstemmende med ELISA-dataene i klassifisere sera fra ovarian cancer-pasienter og friske kontroller. Antistoff array-data er vist som median rekke signalintensitet (FI), og ELISA data vises som gjennomsnitt proteinkonsentrasjonen (ng /ml).
For å bekrefte multipleks påvisning av tabelldata, vi utførte enkelt-target-ELISA-analyser for å kvantitativt måle ekspresjonsnivåene av disse cytokinene hver for seg, og disse resultatene ble sammenlignet med matrisedata. De relative ekspresjonsnivåer for proteiner som målt ved sonden og ELISA var like (se figur 6). Alle 4 markører (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa og OPG) identifisert ved ANN analyse og split-poengene analyse ble bekreftet av ELISA kits. Figur 6 viser representative data for to av disse markørene, MSP-α og TIMP-4.
Diskusjoner
CA125 er en av de viktigste biomarkører for eggstokkreft. Det er ofte brukt effektivt for overvåking av behandlingsrespons og oppdager tilbakefall av eggstokkreft. Imidlertid er CA125 alene ikke er et nyttig diagnostisk markør for klinisk anvendelse på grunn av sin lave spesifisitet; med en grenseverdi på 35 IU /ml referanse, CA125 viste begrenset spesifisitet på 50-60% med følsomheten til 98% for tidlig stadium sykdommen [4-6]. Heving av CA125 er synlig i ca 0,2 til 5,9% friske kvinnelige og 2.2-27.8% pasienter med godartet ovarian sykdommer [10]. Heving av CA125 ble observert hos bare 50% av fase I ovarian kreftpasienter og økes til 90% eller høyere i stadium III og IV eggstokkkreftpasienter [11].
På grunn av kompleksiteten og heterogenitet av eggstokk-kreft, det er usannsynlig at en enkelt biomarkør vil være i stand til å detektere alle subtyper og stadier av sykdommen med en høy spesifisitet og sensitivitet. Ved å søke litteratur og annen kilde, Drs. Polanski og Anderson har kompilere en liste over 1261 proteiner som antas å være forskjellig uttrykt i menneskelig kreft [12]. Blant dem er 260 kandidat biomarkører ansett som «high-prioritet», fordi de har vært innblandet som potensielle kreftmarkører i flere publikasjoner i litteraturen og fordi de fleste av dem har blitt rapportert å være synlig i serum eller plasma. Vi inkluderte mange av disse biomarkører i vår antistoffbasert biomarkør screening.
Cytokiner er en mangfoldig gruppe proteiner består av cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, interferoner, adipokines og lymfokiner og spille mange viktige roller i fysiologisk og patologisk prosesser. Det er også vel kjent at cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, angiogenesefaktorer, proteaser, apoptotiske faktorer, reseptorer, adhesjonsmolekyler og adipokines spiller viktige roller i kreftutvikling, progresjon og metastasering. Økende bevis tyder på at et komplekst nettverk cytokin som er involvert i kreft i eggstokkene. En rekke autokrine og parakrine cytokin løkker er blitt identifisert i eggstokk-kreft og påvirke biologi av denne tumor. Påvisning av uttrykk mønstre av flere cytokiner kan gi ny innsikt om kreft biologi, identifisere nye molekylære mål for kreftbehandling og oppdage nye biomarkører for diagnose og prognose av sykdommen [13,14].
I denne studien har vi demonstrerte effektiviteten av screening en semi-kvantitativ,-sandwich-baserte antistoff-matrisen detektere et panel av 174 markører i serumet til 34 ovarian cancer-pasienter og 53 alderstilpassede friske kontroller for å identifisere et panel av 5 serumproteinmarkører, inkludert CA125, at effektivt kan oppdage kreft i eggstokkene med høy spesifisitet (95%) og høy følsomhet (100%) med AUC på 0,98. Disse markørene ble validert med ELISA-analysen.
Vi observerte at CA125 alene har en AUC på 0,87, på den annen side, har vår nylig identifiserte 5-markør panel en AUC på 0,98, noe som indikerer bedre effektivitet når påvisning av CA125 er kombinert med andre 4 antatte protein biomarkører for påvisning av kreft i eggstokkene (TIMP-4, OPG, PDGF-R-alfa, og MSP-alfa).
TIMP-4 representerer matriksmetalloproteinase (MMP) superfamilien. MMP’er er viktige elementer i extraceullular matriks (ECM) nedbrytning, herunder regulerer frigivelsen av ECM-bundet cytokiner og vekstfaktorer, noe som fører til angiogenese, cellulær invasjon og, til slutt i mange kreftformer, metastase. Disse MMP er kontrollert og regulert av flere TIMPs, hvorav flere ser ut til å spille en avgjørende rolle i tumorigenesis. Chegini Lab har rapportert forhøyet ekspresjon av TIMP-4 in ovarian cancer vev ved IHC analysen, noe som indikerer den potensielle rolle i tumorgenese av eggstokkreft [15].
OPG hører til TNF-superfamilien, og kan være knyttet til nukleær faktor kappa-light-kjeden enhancer av aktiverte B-celler (NFkB) og tumor nekrose faktor-relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) signalveier. OPG ble først identifisert ved sin evne til å regulere den homeostase av ben remodeling. Imidlertid Piche Lab rapportert at OPG kan tjene som sådan overlevelsesfaktor ved å beskytte TRAIL-fremkalt apoptose in ovarian cancer-celler, noe som indikerer dens potensielle rolle i utvikling og progresjon av kreft i eggstokkene [16].
PDGF-R-a- er en reseptor i PDGF-superfamilien. Tjener som angiogene vekstfaktorer, PDGFs spille viktig rolle i cellevekst, kjemotaksis, angiogenese og, i sammenheng med kreft, rekonstruksjon av stromale tumor microenvironments. Jakobsen Lab rapportert at PDGF-R alfa viste høyere uttrykk i eggstokkreft vev sammenlignet med tilstøtende normalt vev [17]. Det ble også rapportert at PDGF-R alpha er uttrykt oftere i serøs karsinom enn i endometriod og mucinkjertler svulster [18], som er konsistent med funnene i vår studie, der de fleste av svulster som ble testet (29 av 34) var serøs .
MSP er en vekstfaktor som er involvert i aktivering makrofag stimulere reseptor-1 (MSTR1). Alfa kjede av MSP (MSP-alfa) skilles ut av spalting av pro-MSP. Det er rapporter som viser at MSP pathway spiller en viktig rolle i metastase [19].
I sammendraget, ved hjelp av 174-markør cytokin antistoff array-teknologi, vi identifisert et panel av 5 serumproteinmarkører som kan oppdage ovarian kreft med både høy spesifisitet og høy følsomhet, noe som indikerer sin lovende program i personlig medisin for påvisning eggstokkreft. I tillegg vurderer at en relativt liten utvalgsstørrelse (N 100) som brukes i denne undersøkelsen oppnådde en ekstremt høy følsomhet (100%) og relativt høy spesifisitet (95%), kan vi tilby noe håp om at validering av multi-biomarkør panel kan en dag være nyttig å screene for en dødelig kreft som sjelden blir diagnostisert i en tidlig fase.
protein og antistoff arrays har dukket opp som en lovende teknologi for å studere protein uttrykk og protein funksjon i en høy gjennomstrømning måte. Disse protein og antistoff arrays presentere en ny mulighet til å profilere protein uttrykk nivåer i kreftpasientprøver og identifisere nyttige biosignatur for legemiddelutvikling og pasientbehandling. Vår 5-markør panel effektivt kunne skille eggstokkreft fra friske kontroller Disse 5 individuelle markørene er ikke unikt for eggstokkreft, som vist ved deres uttrykk i andre krefttyper, inkludert brystkreft [18-22], lunge kreft [23], colorectal kreft [24], prostatakreft [25,26], levercellekarsinom [27], bukspyttkjertel kreft [28], etc. Derfor vil det være svært viktig og interessant å undersøke om denne kombinasjonen av 5-markører kan oppdage andre krefttyper også. To av de viktigste komponentene i biomarkører program er av høy kvalitet på pasientprøver og høye innhold screening og high-throughput teknologier. Derfor vil kombinasjonen av påviste antistoff-basert gjenkjenning teknologi og plattformer fra oss og godt karakterisert pre-diagnostiske prøver fra PLCO ved National Cancer Institute (NCI) gir en unik mulighet for biomarkører og validering [29,30]. Slike undersøkelser vil ikke bare tjene til å validere spesifikk biomarkør panel identifisert i denne studien; de vil bidra til å validere bruk av antistoff arrays som et high-throuput tilnærming for å identifisere kreft biomarkører for sykdom screening og testing.
Materialer og metoder
Denne protokollen er godkjent av sterling Institutional Review borde. IRB-ID: 3303. Gjennomgangen Styret er sterling selvstendig tjeneste, Inc ligger i 6300 Powers Ferry veien, suite 600-351, Atlanta, GA 30339. Skriftlig samtykke ble innhentet da samle prøver fra både pasienter og friske kontroller
Etisk Uttalelse
Skriftlig samtykke ble innhentet da samle prøver fra både pasienter og friske kontroller.
Prøvetaking
serum~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP fra 34 pasienter diagnostisert med tidlig stadium (I og II) eller sent stadium (III og IV) eggstokkreft og 53 alderstilpassede friske kontroller inkludert i studien ble hentet fra tilknyttede sykehus, Sun Yat-sen-universitetet. I korthet, ble ca 2 ml venøst blod fra pasienter. Serum ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C inntil behov. Informasjon om eggstokkreft diagnose, iscenesettelse, histologi, klasse og alder var tilgjengelig for oss, men de unike pasient identifikatorer, for eksempel navn, adresse, fødselsdato, ble ikke gitt.
Antistoff array-teknologi
Halv kvantitative sandwich-baserte antistoff arrays (RayBio
® Menneskelig cytokin Array G-Series 2000) ble utviklet som 3 forskjellige arrays (humant cytokin arrays G6, G7 og G8), hver representerer et unikt sett av 54 60 antigen-spesifikke antistoffer for å detektere en total av 174 serum markører på en glass-slide matrise. Et par av antistoffer som er nødvendig for å påvise hver analytt. Glass ble skrevet ut som 4 eller 8 identiske subgruppene som består av flekker av hvert antigen-spesifikke Apture antistoff for denne matrisen. De tilsvarende påvisnings antistoffene var biotin-merket og kombineres som en enkelt cocktail reagens for senere bruk. Trykte objektglass ble plassert i kammersammenstillinger for å tillate for inkubering av hver deloppstilling med en annen prøve. Etter blokkering hvert sub-array med en blokkerende buffer, ble under arrays inkubert med serumprøver. Etter omfattende vasking for å fjerne ikke-spesifikk binding, ble cocktail av biotinylerte antistoffer deteksjons tilsatt til oppstillingene. Etter omfattende vasking, ble tabell lysbilder inkuberes med et streptavidin-konjugert fluor (HiLyte Fluor ™ 532, fra AnaSpec, Fremont, CA). De fluorescerende signalene ble deretter visualisert ved hjelp av laserbasert skanner system (GenePix 4200A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ved hjelp av den grønne kanalen. For å øke nøyaktigheten ble to replikater per antistoff oppdaget, og gjennomsnitt av median signalintensitet for begge stedene (minus lokal bakgrunn subtraksjon) ble benyttet for alle beregningene. Gjennom disse forbedringene, kan vi få en variasjonskoeffisient (CV) på ca 10% ved hjelp av vårt glass lysbilde plattform.
ELISA analyse
ELISA ble utført i henhold til RayBio® ELISA anvisningen (RayBiotech , Inc., Norcross, GA, USA). I korte trekk, pre-belagte 96-brønners ELISA-plater med fangede antistoffer ble først blokkert ved hjelp av en blokkerende buffer. Duplicate porsjoner (100 mikroliter per brønn) fortynnet sera og flere fortynninger (dvs. konsentrasjoner) av standard protein ble lastet på ELISA-platen. Platene ble deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur (RT). Ubundne materialer ble vasket ut, og biotinylert anti-cytokin deteksjonsantistoff ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 1 time ved RT. Etter vasking ble 100 mikroliter streptavidin-HRP konjugert reagens tilsatt til brønnene, og platen ble inkubert i 30 minutter ved RT. Etter omfattende vasking ble fargefremkalling utført ved inkubasjon med HRP-substrat. Etter tilsetning av stoppløsning, ble den optiske tetthet (OD) ved 450 nm bestemt for hver brønn ved anvendelse av en mikroplateavleser, og konsentrasjonene av prøvene ble bestemt ved sammenligning med standardkonsentrasjonskurver.
Analyse av data
en justert t-test ble brukt til å teste signifikans mellom protein uttrykk nivåer i eggstokkreft og friske kontrollprøver.
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
For å bestemme signal terskel, signaler fra arrays ble målt i fravær av prøver (med blokkeringsbuffer som en blank) og gjentatt 10 ganger. De signaler som genereres ved hjelp av emnene ble gjennomsnitt og standardavvik (SD) ble beregnet. Signaler med verdier lavere enn gjennomsnittet blank signal + 2xSD ble ansett som bakgrunn.
Dataene ble også analysert ved hjelp av nevrale nettverk. Dette kraftige verktøyet tillater oss å finne felles protein uttrykk profiler for å forutsi kreft. I fase I studie ble 80% av prøvene randomisert til treningssettet, og de resterende 20% av prøvene ble anvendt som testsett. Fordelen med denne tilnærmingen er suksessen til prediksjon vil bli mer nøyaktig over tid, etter hvert som flere data er tilgjengelige.
Dataene ble også analysert ved split-poeng analyse. Delingspunktet deler utfallsrommet i to intervaller, en for eggstokkreft og en for vanlige kontroller. Den beste split-poengene til hver markør ble valgt for å sikre minimering av feilsorterte prøver. For hver markør, ble en score fra 0 tildelt en prøve hvis den falt i normal kontroll intervallet for at markør; en score på 1 ble tildelt en prøve hvis den falt i eggstokkreft intervall. Overall, en person ble tildelt en poengsum som summen av disse er tildelt score for
N
ulike markører. Derfor omfanget av slik stillingen var mellom 0 til
N
. En gitt terskel (
T
) ble valgt til optimalt separat eggstokkreft fra friske kontroller, dvs. et gitt individ med en total poengsum
T
er spådd å ha normal status, mens en person med en total poengsum .
T
ble diagnostisert som eggstokkreft
Fra ovennevnte data, beregnet vi spesifisitet, sensitivitet, positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) . ROC ble også bestemt.
Takk
Vi takker Brett Burkholder for konstruktive diskusjoner og redigering av dette dokumentet.
