Abstract
svulstens mikromiljø, inkludert stromale celler, rundt blodårer og ekstracellulære matrise komponenter, har blitt definert som en viktig faktor som påvirker spredning, resistens, invasjon og metastasering av ondartede epitelceller. Blant andre faktorer, har kommunikasjon og interaksjon mellom kreftceller og stromale celler blitt rapportert å spille sentral rolle i kreft promotering og progresjon. For å undersøke disse forhold, ble en on-chip ko-kulturmodell utviklet for å studere interaksjonen mellom celle A549-human lunge carcinoma celler og MRC-5-humane lunge epitel-celler i både normale spredning og behandlingsbetingelsene. I korte trekk, ble en ko-kulturanordning som består av 2 individuelle fluidkamre i parallell, som ble separert ved en 100 um gjerde anvendes for celle mønster. Mikroelektroder matriser ble installert i hvert kammer har elektroder med forskjellig avstand bort fra den konfrontasjon linje for den elektrokjemiske føle impedimetric vurdering av celle-til-celle innflytelse. Etter at gjerdet ble fjernet og celle-til-celle-kontakt oppstått, ved å vurdere impedans signalreaksjonene som representerer celle tilstand og oppførsel, både direkte og indirekte celle-til-celle-interaksjoner gjennom kondisjonert medium ble undersøkt. Virkningen av bestemte avstander som fører til forskjellige påvirkninger av fibroblast celler på kreftceller i co-kultur miljø ble også definert
Citation. Tran TB, Baek C, Min J (2016) Elektrisk Cell-substrat Impedance sensing (ECIS) med microelectrode Arrays for Investigation of Cancer Cell – Fibroblaster Interaksjon. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10,1371 /journal.pone.0153813
Redaktør: Jonghoon Choi, Chunag-Ang-universitetet, Republikken Korea
mottatt: 12 februar 2016; Godkjent: 04.04.2016; Publisert: 18 april 2016
Copyright: © 2016 Tran et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den BioNano Helse-Guard Research Center, finansiert av departementet for vitenskap, IKT Future Planning (MSIP) fra Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2015M3A6B2063548) og ble støttet av nanomaterialer Technology Development Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av Korea regjeringen (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er økende bevis som viser at svulsten mikromiljøet, inkludert stromale celler, betennelsesceller, ekstracellulære. matriks (ECM), cytokiner, fartøyer og vekstfaktorer spiller en viktig rolle i initiering, progresjon og invasjon av kreft [1-3]. Under tumorgenese, kreftceller kommuniserer med dynamisk omgivende stromale celler, slik som fibroblaster, adipose celler og bosatt immunceller. Blant disse fibroblaster utgjør den største gruppen av stromale celler og ser ut til å fungere fremtredende i kreft progresjon [4-5].
Først beskrevet i slutten av 19
århundre, fibroblaster er langstrakt, ikke-vaskulær , ikke-epiteliale og ikke-inflammatoriske celler av bindevev med utvidede celleprosesser som viser en fusiforme eller spindelliknende form i profil. Fibroblaster utføre mange viktige funksjoner, inkludert avsetning av ECM, regulering av epitelial differensiering, og reguleringen av inflammasjon; de er også involvert i sårheling [5]. Under normal spredning i friske organer, fibroblaster syntetisere og utskille forskjellige typer av kollagener (dvs., type I, III og V), så vel som fibronektin og proteoglykaner, som er de vesentlige bestanddeler av ECM [6]. Fibroblaster også utskille type IV kollagen og laminin, som medvirker til dannelsen av basalmembran [7]. I såret organer, fibroblaster spiller en viktig rolle i helingsprosessen ved å invadere lesjoner og generering av ECM å tjene som et stillas for andre celler [8].
i den tidlige fasen av tumorgenese, kreftceller danner en neoplastisk lesjon innenfor grensen av basalmembranen, men adskilt fra det omgivende vev [9]. De basalmembran, fibroblaster, immunceller, kapillærer og ECM rundt kreftcellene danner et område som kalles svulsten mikromiljøet. Som prinsippet kilden til ECM-komponenter, er fibroblaster definert som en viktig cellulær komponent av tumorer. I forbindelse med kreftceller, kan normale fibroblaster skaffe en stadig aktiveres fenotype ved direkte celle-celle-kommunikasjon eller ved forskjellige stimuli som oppstår når vev skade oppstår [10]. Aktiverte fibroblaster oppviser opp–forskrift av ECM-nedbrytende matrix metalloproteinases-2, 3 og 9 (MMP-2, MMP-3 og MMP-9) så vel som flere vekstfaktorer som induserer proliferative signaler til tilstøtende epitelceller [11] . Fra dette nær tilknytning, oppstår et spørsmål om heterotypic cellulære interaksjoner mellom kreftceller og fibroblaster i svulsten mikromiljøet. I det siste tiåret har en rekke forskningsstudier avklart effekten av fibroblaster på ulike aspekter ved kreft celle atferd inkludert spredning, angiogenese, invasjon, metastaser og narkotika motstand; imidlertid, kreftceller oppførsel har ennå ikke helt forklart. Fremtredende, Stoker et al. (1966), Wadlow et al. (2009) og Flaberg et al. (2011, 2012) har vist at normale fibroblaster kan hemme veksten av kreftceller
in vitro
, og de betegnes denne effekten som nabo undertrykkelse [12-15]. Flaberg et al. (2012) utviklet en ko-kultur analysen med H2A-mRFP-merkede tumorceller på et monolag av fibroblaster [15]. I løpet av 62,5 timer ble tumorceller proliferasjon og motilitet i betydelig grad hemmet av fibroblastene gjennom direkte celle-til-celle-interaksjon. For å fullt ut forstå disse effektene, antatt vi om det er en indirekte nabo samspill mellom fibroblaster og kreftceller, som vi betegnes som en avstand effekt. Den angitte hypotese er at den inhiberende effekt av fibroblaster på kreftceller er en funksjon av avstanden mellom disse 2 celletyper i en felles stromal mikromiljøet.
I denne studien vi foreslått en enkel ko-kulturmodell med innebygd høy gjennomstrømming microelectrode arrays (MEA) ved hjelp av en elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS) assay (fig 1) for å overvåke tumorcelle forholdene kontinuerlig når konfrontert med dyrkede fibroblaster. Denne elektriske registreringsmetode ble anvendt i denne studien på grunn av de fremtredende fordeler; denne metoden er ikke-invasiv, enkel å sette opp, enkel å utføre, usedvanlig følsom for cellulære forhold og i stand til sanntids overvåking [16,17]. MEA ble mønster på begge sider av celledyrkningsområder ved forskjellige avstander fra separeringslinjen. I løpet av celle-interaksjoner hver elektrode registrerer kontinuerlig en impedans-signal gjennom en high-throughput datainnsamlingssystem. Denne typen impedimetric data har blitt anerkjent for å reflektere cellulær adhesjon, spredning, spredning og levedyktighet i behandlingsforhold med miljøgifter, medikamenter og kjemikalier, samt andre stoffer
(A) microelectrode arrays (1.: arbeider elektrode, 2: felles lektroden) ble fabrikkert på eksperimentelle glassplater (76mm x 52mm) av vanlige fotolitografi prosesser. SU-8 fotoresist ble anvendt som passiveringslag for å dekke de ledende spor. (B) Et føler plattformen ble delt i 2 områder, ett for kreftceller og en for mikromiljøet midler. Flere mirco store arbeids elektroder ble installert i hvert område ved forskjellige distanser: 100, 250, 650, 1450 og 3050μm langt fra konfrontasjonslinje. (C) En enkelt elektrode var 100 um i diameter. (D) Et bilde av en virkelig brikke etter co-dyrkning av 2 forskjellige celletyper på 2 sider. (E) Den ko-kulturen mønstringsprosess ved hjelp av en dobbeltkammer mugg. (E
1) Etter behandling av overflaten for cellekultur, ble celle brikken plasseres på utformet fiksturen, og dobbeltkammer Formen ble satt til riktig sted ved hjelp av skruer. De 2 kamre ble separert hverandre ved hjelp av en 100 um tykk vegg for celle mønster. (E
2) Etter at cellene i både kammeret hadde festet til chip overflaten, ble dobbeltkammerform erstattet med et brønntypen åpent reservoar. En PDMS seng ble også installert for å hindre løsning lekker. Cellen brikken var koblet til målesystemet, og ble oppbevart i inkubatoren under målingene.
I denne studien viste vi den hemmende effekten av MRC-5 humane lungefibroblaster på normal proliferasjonen av A549 humane lungekreftceller. Impedans signal forskjeller ble bestemt på å indirekte demonstrere avstanden effekt mellom MRC-5 og A549 celler i en co-kultur miljø. Spesielt i de behandlingsforhold, vi også observert en intensiv undertrykkelse i direkte fibroblast-kreft interaksjon, som var høyere enn det som utøves av indirekte samhandling. I tillegg ble den inhiberende effekt av fibroblaster har ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) -metoden i et blandet kulturmodell. Vår studie var rettet til å etterligne en
in vivo
terapeutisk stromal effekt på tumorprogresjon med en roman deteksjon og analyse teknikk i sanntid domene.
Materialer og metoder
MEA fabrikasjon
MEA mønsteret ble fabrikkert på glass objektglass (52 mm x 76 mm) med vanlige fotolitografi prosesser ved hjelp av AZ-5214E (MicroChemicals GmbH, Tyskland) som en negativ fotoresist for en lift-off prosess. Mønstringen ble etterfulgt av avsetning av en 250 Å /500 Å Ti /Au bi-lag ved hjelp av en e-beam fordampning system, og unødvendige delene var selektivt fjernes i aceton. Etter elektrodene ble dannet, utførte vi en andre fotolitografi skritt å bruke en 2 mikrometer tykt lag av SU-8 2002 (Microchem, USA) som et isolasjonslag for gull spor, slik at bare de elektroder arrays og kontaktputer expodes.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
MRC-5 humane lungefibroblaster og A549 humane lungekreftceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og ble dyrket i RPMI medium 1640 (Gibco ) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% antibiotika /antimykotika (Gibco). Disse cellene ble holdt i tilstand av 37 ° C og 5% CO
2 og sub-dyrket under behandling med trypsin-EDTA (Gibco) løsning. Antall celler ble regnet med Cellometer (Cellometer Auto T4, USA).
Cell mønster på MEA chip
I denne studien ble cellen mønster ved hjelp av en felles fysisk barriere metode for å lage cellefrie områder for kollektiv cellevandring [18]. En fysisk barriere ble påført før såing celle for å blokkere celle blanding, og fjerning av den fysiske barriere initierer cellemigrering og konfrontasjon prosess. Akryl kamper for cellen chip og dual-kammer mold ble utformet ved hjelp av AutoCAD og ble fabrikkert ved hjelp av en CNC fresemaskin (Fig 1E). Før de ble brukt for cellekultur, ble alle enheter sterilisert i en alkohol-bad og ble tørket i en ovn med UV-lys. Etter at dobbeltkammer Formen ble festet til celle brikken i riktig stilling ved hjelp av skruer, ble hvert kammer behandlet med en kollagenoppløsning (10%) i 15 min ved romtemperatur for å fremme celleadhesjon. Deretter ble de kamre vasket med 1 x PBS, og de 2 typer av cellesuspensjon (5 x 10
5 celler /kammer) ble injisert inn i 2 separate kamre. Etter 12 timer, når begge celletyper hadde festet godt og hadde dannet et monolag på brikken overflaten, ble kamrene fra hverandre, og ble erstattet av brønntypen reservoaret. Cellen chip var koblet til ECIS systemet og holdt i inkubator under målingene.
CellTracker farging for migrasjon sjekke
MRC-5 fibroblaster ble farget med CellTracker før co-kultur for å vurdere deres migrering inn i området av A549-tumorceller. I korte trekk, MRC-5-celler ble dyrket i et cellekulturskål (SPL), og ble høstet ved bruk av trypsin-EDTA (Gibco). Cellene ble sentrifugert, supernatanten ble fjernet, og cellene ble resuspendert i 1 ml kulturmedium (RPMI-1640 med 10% FBS, 1% PS, 25 mM HEPES, Gibco). Cellen Løsningen fikk 20 pM av CellTracker
TM (Life Technologies, CellTracker
TM grønn CMFDA), og cellene ble deretter inkubert i 30 min. Deretter ble cellene sentrifugert og supernatanten ble fjernet; deretter ble cellene resuspendert i 1 ml friskt kulturmedium. De fargede cellene ble deretter klar til å bli injisert inn i ko-kulturen kammer som beskrevet i cellen mønster delen. Cellen farging ble bekreftet ved hjelp av fluorescens mikroskopi (Eclipse 80i, Nikon).
flowcytometri analyse
A549 og MRC-5 celler (5 × 10
5 celler /ml) ble dyrket i 6-brønns plater for både mono-kultur av A549 celler og ko-kultur av A549 og MRC-5-celler). Hver celletype ble behandlet med 30 pM av curcumin (Sigma-Aldrich) i 3 dager. Deretter ble cellene vasket tre ganger med kald PBS (Sigma-Aldrich) og suspendert bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2, pH 7,4, Sigma-Aldrich). Hver prøve fikk 5 uM Annexin V, konjugert Alexa Fluor® 594 (Life Technologies, eksitasjon /emisjon: 590/617 nm) og ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Cellene ble analysert ved hjelp av en Accuri C6 flowcytometer (BD Biovitenskap) og dataene ble analysert med FlowJo programvare (Treestar).
MTS analysen
Curcumin (Sigma-Aldrich) ble fremstilt i DMSO og fortynnet til ønskede konsentrasjoner i cellekulturmedier. For forsøket ble cellene dyrket ved 1 x 10
4 celler /100 ul av den opprinnelige mengde seeding i en 96-brønners cellekulturplate i 24 timer. De A549 celler og MCR-5 fibroblaster ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin (1, 10, 30, 50, 70, 100 og 500 uM) i 3 dager. Celletelling leder-8-løsning (Dojindo Inc.) ble fortynnet til 1:10 med medium og tilsatt til hver brønn i platen, og deretter cellene ble inkubert i 4 timer. Celleproliferasjon ble målt ved 450 nm ved hjelp av en Wallac 1420 VICTOR3 V -mikroplateleser.
Målesystem
En Agilent 4284A Impedans Precision Meter (Agilent CA, USA) og en designet veksling relé krets ble operert for samtidig å måle impedansen av elektroder matriser. Målebetingelsene var 10 mV og 10 kHz ved 5 minutters intervaller. LabVIEW (National Instrument, TX, USA) programmet ble brukt til å kontrollere måleren og registrere numeriske data til en PC, og deretter dataene ble automatisk plottet på en real-time chart.
Statistisk analyse
Alle data ble uttrykt som middel (± SD) av 3 repetisjoner. Statistisk analyse ble utført ved en enveis faktoriell ANOVA etterfulgt av Tukey-s ærlig signifikant forskjell (HSD) test av forskjell. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant på p-verdier mindre enn 0,05.
Resultater
MEA karakterisering via monokulturer av tumorceller og fibroblaster
I den første eksperimentelle skritt, MEA celle chips ble validert via monokulturer av A549 tumorceller og MRC-5 fibroblaster i normale proliferative tilstander. Før du bruker mobilmålesystem ble arrays justert (med LabVIEW) for å normalisere systematiske forskjeller, for eksempel ledningsnett, lodding og ledende spor. Den normaliserte cellefrie motstanden for hver elektrode ble satt til 2,6 kQ. Figur 2A viser motstands reaksjoner når enkeltelektroder ble utfordret med forskjellige konsentrasjoner av A549-celler. Data innhentet i løpet av 16 timer ble utstyrt med en høyde algoritme for en vekst /sigmoidal modell (OriginPro 9). Nedenfor 1,25 × 10
5 celler /brønn, motstanden kurvene samsvarer godt til montering kurver. Ved høyere celletettheter, først på et lag fase fra 4 timer til 8 timer, når cellene ble flytte på seg på bindingsstedet forut for dannelse av et monolag på elektrodene. For enkelt å beregne levedyktighet i denne studien, er en dimensjonsløs parameter kalt celleindeks (CI) ble definert som den relative endring i målt elektrisk motstand og kan beregnes ved hjelp av ligningen belowwhere R
i er motstanden i cellen dekket elektroder og R
cell-free er motstanden av blanke elektroder (2,6 kohm). Etter 16 timer ble en kalibreringskurve tegnet inn, som representerte korrelasjonen mellom CI verdi og celletetthet poding (Fig 2 B).
(A) Motstands responser av MEA til forskjellige konsentrasjoner av A549-tumorceller i monokultur for 16 h (på 10mV, 10kHz). (B) Denne kalibreringskurve som representerer korrelasjonen mellom A549 celletetthet og celle index verdi. (C) MTS resultater fra av monokulturer av A549 celler og MRC-5 fibroblaster etter 72 timers eksponering for curcumin. IC50-verdiene for A549 celler og MRC-5-celler ble 50 uM og 30 uM, respektivt. Dataene er vist som gjennomsnitt (± SD) av 3 repetisjoner.
I tillegg A549-tumorceller og MRC-5-fibroblaster ble separat behandlet med forskjellige doser av curcumin for å definere en passende behandling forutsetning for co-kultur studien. Curcumin har vist seg effektive i indusering av apoptose, så vel som inhibering av proliferasjon av lunge adenokarsinom-cellelinje A549 [19]. I denne studien ble curcumin valgt til å skape behandlingsmiljø for den foreslåtte ko-kulturmodell. En MTS-assay ble utført, og en celle-levedyktighet kurve ble opptegnet etter 72 timer (figur 2C). Resultatene viste at curcumin har en betydelig toksisk virkning på både tumorceller og fibroblaster ved 10 uM. IC50-verdiene for A549 celler og MRC-5-celler ble 50 uM og 30 uM, respektivt. Den behandlingsdose på 30 uM ble valgt for etterfølgende ko-kultur eksperiment, hvor tumorcellene ble samtidig utsatt for både den toksiske effekt av curcumin og den inhiberende effekt av tilstøtende fibroblaster.
Inhiberende effekt av fibroblaster på kreftcellene i blandet kultur
tumorcelleproliferasjon i denne typen ko-kulturmodell bestemmes av egenskapene til både kreftceller og fibroblaster, noe som kan utøver motstående proliferative effekter
in vitro
. For eksempel, AG09877 fibroblaster stimulerer proliferasjonen av karsinom T47D-celler, mens AG04351 fibroblaster oppviser en vekst-inhibering virkning på den samme kreftcellelinjen [13]. For å bestemme den gjensidige virkning mellom A549 og MRC-5, ble en FACS-analyse utført med en blandet kultur modell ved anvendelse av disse 2-cellelinjer. Deteksjons Ordningen var basert på forskjeller i fosfatidylserin (PS) plassering mellom friske celler og apoptotiske celler. I normale levedyktige celler, er PS plassert på den cytoplasmiske overflaten av cellemembranen. Når cellene begynner å gjennomgå apoptose, er PS translokaliseres fra innsiden til utsiden av cellemembranen og er eksponert for det ytre cellulære miljø. Ved hjelp av en spesifikk fosfolipid-bindingsprotein (Annexin V-konjugert Alexa Fluor® 594) og en flowcytometri sorteringssystem, kan de tidlig stadium apoptotiske celler skilles fra hele cellepopulasjonen.
Som vist i fig 3 , curcumin behandling i monokulturer indusert apoptose i både A549 celler og MRC-5-celler ved 9,87% og 19,05% apoptotiske celler, respektivt. Dette forholdet var av mindre betydning enn våre MTS resultater samt resultater fra andre tidligere studier [20]. Disse forskjeller ble forklares ved mangelen av døde celler, som ikke kan skjelnes ved hjelp av FACS med bare PS farging.
Forskjellige prosenter av apoptotiske celler ble oppnådd i A549-tumorceller og MRC-5 monokulturer fibroblaster og i den blandede kultur av disse 2 cellelinjer. [En farge tallet kan sees i den elektroniske utgaven].
I blandede kulturer uten en nabo effekt mellom kreftceller og fibroblaster, ble forhold til forvaltnings apoptotiske celler forventet fra 9,87% til 19,05% under de samme forsøksbetingelser. Interessant nok var forholdet av apoptotiske celler i de blandede kulturer bestemt til å være 33,71%. Dette resultatet antydet at celle-til-celle-hemmende virkning var til stede i parallell med den toksiske effekt av curcumin for begge celletyper. Imidlertid spesifikke effekter på hver cellelinje var vanskelige å bestemme ved hjelp av FACS.
Inhiberende effekt av fibroblaster på normal proliferasjon av tumorceller
For å diskriminere det bestemte bidrag fra hver cellelinje til den totale hemmende effekt, undersøkte vi cellulære forhold via impedans responser i en co-kultur modell. Rå motstand data til A549-celler ved forskjellig avstand bort fra fibroblaster (0,1, 0,25, 0,65, 1,45 og 3,05 mm) ble montert lineært og normalisert, slik som vist i figur 4A. De tilsvarende resistensdata etter 24 timer og 48 timer ble omgjort til CI verdier ved hjelp av ligningen under punkt 1 (fig 4B). I løpet av første 24 timer etter celle kontakt, avstanden effekten var utydelig, og CI verdiene viste ikke signifikante forskjeller mellom en
st elektrode array (0,1 mm) og 5
th elektrode array (3,05 mm) .
(A) Cellular motstand svar (på 10mV, 10kHz) av A549 tumorceller som en funksjon av tid og avstand fra fibroblaster i løpet av 54 timer med co-kultur i normale vekstforhold. Rådata ble lineært-utstyrt og omdannet til CI verdi med hensyn til den cellefrie elektrode respons (2,6 kohm). (B) CI verdier av tumorceller ved 5 forskjellige avstander fra de dyrkede fibroblaster. Etter 48 timer i co-kultur, CI verdiene viste at kreftceller som ble konfrontert med fibroblaster var tydelig hemmet i forhold til fjerne celler. (* P 0,02). (C) Bright-feltet bilder av konfrontasjonen mellom kreftceller og fibroblaster ved 0 t og 48 timer. Målestokk representerer 200 mikrometer.
Det ble observert en signifikant forskjell i spredning av A549 celler på 48 timer. CI verdier av A549 celler i direkte kontakt og adjacently kontakt med fibroblaster (dvs. på en
st og 2
nd elektrodegrupper) litt redusert fra 6,12 og 6,23 til 5,57 og 5,77, mens de av den videre A549 celler (dvs. ved
rd 3, 4
th og 5
th elektrodegrupper) holdt stabil impedans svar på konfluent celletetthet (fig 4C). Dette resultat viser klart at fibroblaster er i stand til å inhibere den proliferative hastighet av tumorceller i kulturer konfrontert mer effektivt enn effektene medieres gjennom media miljø
fibroblaster-tumorceller interaksjon i behandlingsbetingelsene. Innlysende nabo virkning over avstander
for å gi en full forståelse av nabo effekt mellom fibroblaster og kreftceller
in vitro
, vi konstruert en co-kultur modell med MRC-5 celler og A549 celler i terapeutiske forhold. Curcumin ble innført i konfrontert kulturer ved den tidligere definerte konsentrasjon, 30 um; impedans ble deretter overvåket for følgende 84 timer. De gjennomsnittlige responser ble normalisert og ikke-lineært monteres ved hjelp av en dose-respons-algoritmen (figur 5A). Interessant, avstanden effekt ble klart vist på tidlige tidspunkter etter legemiddeleksponering (figur 5A og 5B). Etter 24 timer, gjennomsnittlig CI verdiene oppnådd var 5,57, 5,77, 6,35, 6,34 og 6,40 for tumorceller som lå på 0,1, 0,25, 0,65, 1,45 og 3,05 mm unna fibroblast konfrontasjonslinje. Etter 48 timer og 72 timer, en signifikant reduksjon av alle CI verdier og utseendet av mellomrommene mellom gruppene klart til uttrykk den intensive kombinerte apoptotiske virkning av både anti-kreft legemiddel-aktivitet og veksthemming via fibroblast-interaksjoner. Vi utførte også en migrasjonsanalyse under konfrontert ko-kulturbetingelser for å undersøke migrasjons evne fibroblaster inn i tumorceller området og således være i stand til å skille den direkte celle-til-celle-interaksjon virkning fra den totale inhiberende effekt (figur 5C). Etter 72 timer, viste gjenværende fluorescerende intensitet effektiv apoptotiske effekt av curcumin på MRC-5-celler, men ble ikke observert noen signifikant migrering. Disse resultatene korresponderte godt med de andre studier om effekten av curcumin behandling på overførings kinematikken til dyrkede fibroblaster.
(A) Cellulære responser motstand (på 10mV, 10kHz) av A549-tumorceller som en funksjon av tiden og avstand fra fibroblaster enn 84 timer med co-kultur i curcumin behandling tilstand. Rådata ble montert og omdannet til CI-verdier med hensyn til celle-frie elektrode responser (2,6 kohm). (B) CI verdier av tumorcellene på 5 forskjellige avstander fra de dyrkede fibroblaster. Den hemmende effekten av fibroblaster på tumorceller ble mer tydelig observert i giftige omgivelser etter 24 h (* p 0,04). (C) Den migrasjonsrate av fibroblaster inn i tumorcelleområdet ble vurdert ved hjelp av en celle tracker fargingsanalyse. Ved behandlingen tilstand, ble det ikke observert noen signifikant migrering. De grå prikker angir plasseringen av elektroder arrays. Målestokk representerer 500 mikrometer.
Diskusjoner
Impedimetric cellebaserte biosensorer har blitt anerkjent som en allsidig og pålitelig karakterisering plattform for bio-analytiske studier på grunn av sine prominente fordeler, slike så høy følsomhet, høy gjennomstrømming og sanntids innspillingen evnen. Ved hjelp av forskjellige geometriske elektrode motiver har ECIS plattformer blitt omfattende benyttet i studier av cellebinding og spredning [21,22], celle motilitet [23], cellelaget barrierefunksjoner [24], så vel som for
in vitro
toksikologiske studier og narkotika screening [25,26]; disse plattformene også blitt integrert med andre bio-analytiske systemer [27]. Den enestående elektrode design er microelectrode array, som består av mange ensartede enkeltmikroelektroder på en felles plattform. Fordi de er av størrelsesorden mikron i størrelse, enkle mikroelektroder er i stand til å ta opp de heterogene egenskapene til cellene som er skjult i løpet av gjennomsnittlig cellepopulasjoner, i stedet for å tilveiebringe en samle cellulær respons overfor en gitt fysiologisk tilstand. Imidlertid har bruken av enkle mikroelektroder i mobilnettet måling for å møte den ekstraordinære følsomhet av celle atferd som mikro-bevegelser, vedlegg, spredning og spredning. Dette signalet svingninger er en utfordring for å bestemme selve mobil atferd på en elektrodeoverflate. Løsningen i denne studien var å bruke arrays for måling repetisjon, og deretter bruke riktig montering metoder til de oppnådde gjennomsnittsdata. Ved hjelp av denne metoden, kan de relative endringene i celle levedyktighet bli vist via CI nummer og kan enkelt konverteres til prosenter i forhold til første CI verdier.
Denne studien var rettet til å foreslå en enkel, men effektiv metode for å undersøke interaksjoner mellom tumorceller og fibroblaster i en ko-kulturmodell, med særlig fokus på avstanden effekt mellom disse 2-cellelinjer. De samlede inhiberende og toksiske effekter på kreftceller A549 er vist i figur 6. Det skal bemerkes at andre tidligere studier har undersøkt hemning av tumorcelle-proliferasjon og motilitet av fibroblaster [28-31]; den felles konklusjonen var at inhiberingen effekten var både kontakt- og løselig faktor-avhengige. Men den effektive avstanden mellom tumorceller og fibroblaster var ennå ikke blitt bestemt. Ved å integrere en MEA plattformen i en co-kultur modell, vi får bestemmes forskjellene på A549 tumorcelle atferd på ulike avstander fra MRC-5 fibroblaster i både normale spredning og behandlingsforhold. Våre resultater viste at de påvirkninger på tumorcellene kan bli kategorisert i 3 forskjellige soner basert på levedyktigheten av tumorcellene. Den første sone lå opp til 0,25 mm fra fibroblast konfrontasjon linje, hvor kreftcellene ble sterkt hemmet i både normale og toksiske forhold. Dette resultat kan forklares ved involvering av overflatemolekyler på fibroblaster, så vel som de oppløselige faktorer som skilles ut på grunn av den konfrontasjon mellom fibroblaster og tumorceller [31]. Den andre sonen er plassert opp til 3 mm fra den første sone, hvor effekten under normale vekstbetingelser, var utydelig men ble klart demonstrert i behandlingen tilstand. Dette resultatet kan også forklares med de oppløselige faktorer utskilt av fibroblaster fra en begrenset avstand. Den tredje sonen omfattet resterende området. I normale co-kulturer, A549 tumorceller i denne sonen opprettholdes CI verdier av 6,6 og 6,5, som indikerte en normal spredning hastighet til tross for cross-talk av fjerne celler. Ved behandlingen tilstand, ble A549 cellelevedyktigheten bestemt til å være 75,6%, som var tilnærmet den samme verdi bestemmes av den mitokondrielle basert MTS assay (72,1%). Dette likeverdighet åpenbart indikerte at kondisjonert medium ikke forårsake noen hemmende effekt når kreftcellene var mer enn 3 mm unna fibroblaster.
Responsen av ondartede humane celler til stromal mikromiljøet og terapeutiske regimer er en fundamental emne i kreftforskning, men en fullstendig forståelse er ikke oppnådd på grunn av en overreliance på endepunkts assays [32-34]. I denne studien, innførte vi et veletablert assay for en ny føle plattform for første gang for å lette den kontinuerlige overvåkning og posisjonsavhengige vurdering av hemming cellulære effekter. Våre resultater understreket at faktor på tumorstørrelse kan påvirke effektiviteten av kreft kjemoterapi og bør betraktes som en innflytelsesrik parameter i ko-kultursystemer. Videre studier som karakteriserer de molekylære elementene utskilt av celler samt signalveier som bruker vår plattform og lignende 3D co-dyrkingssystemer for hver type kreft vil være bemerkelsesverdig gunstig for kreftforskning samfunnet.
Konklusjon
Så langt vi kjenner til, er denne studien første forsøk på å ta opp faktor på avstand i differensial hemming av tumorcellevekst av humane fibroblaster. Våre impedimetric cellebaserte resultater viste at nabo undertrykkelse virkningen av normale fibroblaster er avhengig ikke bare av celletype og måte av interaksjon, men også avstanden mellom de 2 cellelinjer. A549-tumorceller ble intensivt hemmet innenfor 0,25 mm fra MRC-5 fibroblaster, mens ingen inhibering ble observert ved 3 mm og mer. Med evnen til automatiske målinger, kan det hende high-throughput-analysen lette preliminær evaluering av ønskede celle-celle interaksjoner i ulike vekst eller behandlingsbetingelsene før utnyttelse av andre biologiske analyser.
