Abstract
kinaser er nedstrøms modulatorer og effektorer av flere mobilnettet signalkaskader og spiller viktige roller i utviklingen av neoplastisk sykdom. I denne studien ønsket vi å evaluere SRC, LYN og CKB protein og mRNA uttrykk, samt deres promoter metylering i magekreft. Vi fant forhøyet uttrykk for SRC og LYN kinase mRNA og protein, men redusert nivå av CKB kinase, endringer som kan ha en rolle i invasivitet og metastasering av mage svulster. Uttrykk for de tre studerte kinaser var også assosiert med MYC onkogen uttrykk, en mulig biomarkør for magekreft. For å forstå mekanismene som regulerer ekspresjonen av disse genene, evaluerte vi den DNA-promoteren metylering av de tre kinaser. Vi fant at redusert
SRC Hotell og
LYN
metylering og økt
CKB
metylering var forbundet med magekreft. Den reduserte
SRC Hotell og
LYN
metylering var assosiert med økte nivåer av mRNA og protein uttrykk, noe som tyder på at DNA metylering er involvert i regulering av uttrykk av disse kinaser. Omvendt, redusert
CKB
metylering ble observert i prøver med redusert mRNA og protein ekspresjon, noe som tyder CKB ekspresjon ble funnet å være bare delvis regulert av DNA-metylering. I tillegg har vi funnet at forandringene i DNA-metylering mønster av de tre studerte kinaser ble også assosiert med den magekreft utbruddet, avansert magekreft, dypere tumorinvasjon og tilstedeværelse av metastasering. Derfor SRC, LYN og CKB uttrykk eller DNA metylering kan være nyttige markører for å forutsi tumorprogresjon og målretting i anti-kreft strategier
Citation. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegro RC, et al. (2015) deregulert Uttrykk for SRC, LYN og CKB kinaser av DNA Metylering og dens potensielle rolle i Gastric Cancer Invasivitet og metastasering. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492
Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA
mottatt: May 27, 2015; Godkjent: 25 september 2015; Publisert: 13 oktober 2015
Copyright: © 2015 Mello et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; tilskudd # 471072 /2012-5 og 402283 /2013-9, fellesskap til MCS og RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; gi #ICAAF 123/2014 til RRB) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; stipend # 2009 /07145-9; fellesskapet til MFL) som tilskudd og måltids utmerkelser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde hyppigste krefttypen og den nest høyeste årsaken til kreftdødelighet i verden [1]. Behandling av GC avanserte stadier fortsatt vanskelig, og prognosen er fortsatt dårlig, blant annet som følge av lokalt tilbakefall, tumorinvasjon og /eller metastasering. Den samlede relative fem års overlevelse er i dag mindre enn 20% [2]. En bedre forståelse av biologi progresjon av denne neoplasi er avgjørende for å redusere dødeligheten med utviklingen av romanen pasientbehandling og terapeutiske strategier.
Phosphotransferases, også kjent som kinaser, er nedstrøms modulatorer og effektorer av flere cellulære signalkaskader og spiller viktige roller i utviklingen av neoplastisk sykdom [3]. Hittil har flere protein kinase-samspill narkotika er registrert for kliniske studier [4]. Vi har tidligere utført screening for å identifisere kinase proteiner uttrykt i GC bruker Capture forbindelse massespektrometri [5, 6] (S1 File), og 22 kinase proteiner, inkludert SRC, LYN og CKB, ble oppdaget (S1 tabell). Disse tre kinaser ble valgt for videre undersøkelser (S1 fig).
SRC var den første proto-onkogen oppdaget, og det spiller en sentral rolle i cellulære signaloverføringsveier. Aberrant SRC-aktivitet er observert i flere humane kreftformer, inkludert GC [7-9], og det kan være viktig i tumorutvikling og progresjon [10, 11]. Den mitogene funksjon av SRC er, i det minste delvis, mediert ved induksjon av MYC, en cellesyklus regulator og transkripsjonsfaktor [12, 13]. Vår gruppe beskrevet tidligere MYC oppregulering i humant GC og i N-metyl-nitrosourinstoff-behandlede ikke-menneskelige primater [14-19]. På grunn av at aktiveringen av SRC, så vel som andre kinaser, har en mitogen virkning som er avhengig av celletype og forbindelse [20], er det likevel viktig å forstå den mulige forhold mellom kinaser og MYC uttrykk i gastrisk karsinogenese og den molekylære mekanisme involvert i reguleringen.
LYN er et annet medlem av SRC familien av kinaser, og
LYN
genet ligger på kromosom 8q13. Vår gruppe tidligere rapportert tilstedeværelse av gevinster på kromosom 8 (der
MYC
genet er også lokalisert) i GC saker fra Nord-Brasil [16, 21-23] og i alle GC cellelinjer etablert fra neoplasier i denne populasjonen [24, 25]. Derfor kan dette kromosomet inneholder viktige gener involvert i magekreftutvikling. Så vidt vi vet, har ingen tidligere studie undersøkte rollen LYN og regulering i GC. Imidlertid har LYN overekspresjon blitt rapportert i flere krefttyper [26-32]. I tillegg ble reguleringen av
LYN
av DNA metylering demonstrert i både tykk- og endetarmskreft og Ewings sarkom [33, 34], og
LYN
metylering har blitt observert i noen blodkreft og ikke-blodkreft cellelinjer [35]. DNA-metylering er en molekylær modifikasjon av DNA som er tett forbundet med genfunksjon og celletype-spesifikk genfunksjon [36]. Videre kan DNA-metylering være en robust biomarkør, som det er langt mer stabil enn RNA eller protein, og er derfor et lovende mål for utvikling av nye metoder for diagnose og prognose av kreft [36].
CKB er en av to cytosoliske isoformer av kreatin kinase og kan delta i metabolske prosesser som involverer glykolyse i ikke-muskel-celler [37]. I motsetning til normale celler, som primært genererer energi via oksidativ fosforylering, de fleste kreftceller fore aerob glykolyse, noe som er kjent som Warburg virkning [38]. Interessant, vises MYC onkogen for å aktivere flere glukosetransportører og glykolytiske enzymer, og dermed bidra til Warburg virkning [39]. Vår forrige proteomikk studie viste at flere proteiner som er involvert i energiproduksjonsprosesser ble deregulert i GC prøver og forsterket Warburg effekten i denne neoplasi [40]. Rollen CKB i GC fortsatt dårlig forstått: noen transcriptomic studiene rapporterte oppregulering av
CKB
i GC prøver [41, 42], mens en annen viste
CKB
downregulation [43]. I tillegg, som for
LYN
genet,
CKB
metylering ble tidligere beskrevet i hematologisk og solide kreftcellelinjer, inkludert GC cellelinjer [44]. Den metylering av
CKB
synes å være relatert til den reduserte nivået av ekspresjon; derimot, er videre undersøkelser fortsatt nødvendig for å forstå regulering av
CKB
av epigenetiske modifikasjoner.
Derfor må vi først forsøkte å evaluere mRNA og protein uttrykk for SRC, LYN og CKB i en stor satt av GC prøver. Deretter evalueres vi hvorvidt disse genene kan reguleres ved hjelp av DNA-metylering i gastrisk karsinogenese. I tillegg undersøkte vi en mulig sammenheng mellom kinase uttrykk eller metylering og kliniske variabler samt MYC uttrykk og metylering.
Materiale og metode
Vevsprøver
kinase uttrykk og metylering mønstre ble evaluert i 138 par av GC prøver og tilhørende ikke-neoplastiske prøver mage vev hentet fra pasienter som gjennomgikk gastrektomi i Nord-Brasil. Alle pasientene hadde negative historier av eksponering for enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen, og det var ingen co-forekomst av andre diagnostisert kreft. Denne studien ble godkjent av etisk komité av João de Barros Barreto universitetssykehus (protokoll # 316737). Skriftlig informert samtykke med godkjenning av etisk komité ble innhentet fra alle pasienter før prøvetaking.
En del av hver dissekert tumorprøve var formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE). Deler av FFPE vev ble farget med hematoksylin-eosin for histologisk evaluering eller brukes for immunhistokjemi (IHC) analyse. Ytterligere porsjoner av hver tumor og parede prøver ikke-neoplastiske vev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til protein og nukleinsyre rensing.
Alle prøvene ble klassifisert i henhold til Laurén [45 ], og svulstene ble iscenesatt i henhold til TNM staging kriterier [46]. Tilstedeværelsen av
Helicobacter pylori
, en klasse I karsinogen, i gastriske prøver ble detektert ved den hurtige urease testen, og dens virulens faktor cytotoksisitet forbundet gen A (CagA genet) ble påvise ved PCR ved bruk av DNA renses samtidig med proteiner og mRNA, som tidligere utført av vår gruppe [47]. Epstein-Barr virus (EBV) ble påvist ved RNA in situ hybridisering [47].
For 49 av disse parene av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver, vurderte vi den MYC immunreaktivitet, mRNA-ekspresjon og metylering statusdata som tidligere utgitt av vår gruppe [18].
protein, mRNA og DNA rensing
Totalt protein, mRNA og DNA ble samtidig isolert fra mage vevsprøver ved å AllPrep DNA /RNA /protein Kit ( Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinet pellet ble oppløst i en buffer inneholdende 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, USA) og 0,5% hver fosfatase Inhibitor Cocktail 1 og 2 (Sigma -Aldrich, USA), som tidligere utført av vår gruppe [48]. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved metoden til Bradford (Sigma-Aldrich, USA). RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland) og 1% agarosegel, henholdsvis. Prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Protein immunreaktivitet analyse
Tumor vevssnitt (3 eller 4 mm tykk) ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert serie av etanol. Etter varmeutløst epitop henting ble vevssnitt inkuberes med primær muse monoklonale antistoffer mot SRC (fortynning 1: 400; klone 28, Life Technologies, USA), LYN (fortynning 1: 400, klone C13F9, Life Technologies, USA) eller CKB (fortynning 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). En universell peroksydase-konjugert sekundært antistoff kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) ble anvendt for påvisning. Vi brukte 3,30-diamino-benzidin /H
2o
2 (DakoCytomation, Danmark) som kromogen og hematoxylin som counterstain. Et protein immunreaktivitet-positiv prøve ble definert som en som har 10% eller flere av neoplastiske celler som var positive for proteinet.
Proteinekspresjon analyse
Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet av vår gruppe [49]. Redusert protein (25 ug) fra hver prøve ble separert ved 12,5% homogene SDS-PAGE og elektro-blottet på en PVDF-membran (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membranen ble blokkert med fosfat-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 og 5% fettfattig melk og inkubert over natten ved 4 ° C til de tilsvarende primære antistoffer: anti-SRC (fortynning 1: 1000, klon 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (fortynning 1: 1000, klone C13F9, Life Technologies, USA), anti-ckb (fortynning 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-ACTB (fortynning 1: 250 Ac -15, Life Technologies, USA). Etter omfattende vasking ble et peroksidase-konjugert sekundært antistoff tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av western blotting Luminol reagent, og bildene ble anskaffet ved hjelp av en Imagequant 350 digitale bildesystem (GE Healthcare, Sverige). ACTB ble brukt som en laste referanse kontroll.
mRNA uttrykk analyse
Først RNA ble revers-transkribert ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies, USA) . Komplementær DNA ble så forsterket av real-time revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) med TaqMan prober kjøpes som Analyser-on-demand Produkter for Gene Expression (Life Technologies, USA) og en 7500 Fast Real-Time PCR instrument (Life Technologies , USA).
GAPDH
genet ble valgt som en intern kontroll for RNA-inngang og revers-transkripsjon effektivitet. Alle RT-qPCRs ble utført i tre eksemplarer for både målgener (
SRC
: Hs01082246_m1;
LYN
: Hs00176719_m1;
CKB
: Hs00176484_m1) og internkontroll (
GAPDH
. NM_002046.3)
Den relative kvantifisering av genuttrykk ble beregnet i henhold til Livak og Schmittgen [50]. Den tilsvarende kontrollprøve ble utpekt som en kalibrator fra hver svulst.
DNA metylering analyse
metylering mønster og frekvensen av kinase gener ble undersøkt ved metylering spesifikk PCR (MSP) [51]. EZ DNA Metylering-Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) ble brukt til å endre gDNA av bisulfit behandling, konvertering unmethylated cytosines inn uraciler og forlate denaturert cytosines uendret. Spesifikke primere for genet promotorer, er beskrevet i tabell 1.
PCR-reaksjonene ble utført ved anvendelse av 0,1 umol /L dNTP, 2 umol /l MgCl
2, 0,5 pmol primere, 1,25 U Taq DNA-polymerase, og 100 ng bisulfitt-modifiserte DNA. Etter innledende denaturering i 5 minutter ved 94 ° C, ble 40 sykluser ved 94 ° C i 45 s, glødetemperaturen (tabell 1) i 45 s, og 72 ° C i 30 sekunder utført, etterfulgt av en endelig forlengelse for 5 min ved 72 ° C. PCR-produktene ble direkte lastet på 3% agarosegel og elektroforese. Gelen ble farget med SYBR
® Sikker DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) og direkte visualisert under UV-belysning. Som en positiv kontroll for alle MSP reaksjoner, en gDNA prøven var helt denaturert ved hjelp av CpG metylase (SSSI, New England Biolabs, USA) etter produsentens anvisninger. Videre ble primere for detektering av villtype-sekvensen som brukes til å overvåke fullstendig omdannelse av DNA oppnådd i det bisulfitt reaksjons
Prøvene ble inndelt som følger: a. 1) en prøve ble definert som hypomethylated når en positiv forsterkning produktet ble detektert bare i den PCR med spesifikke primere for unmethylated sekvenser; 2) en prøve ble definert som hypermethylated da positiv amplifisering ble detektert bare i den PCR med spesifikke primere for metylert sekvenser; 3) en prøve ble definert som delvis metylert da positiv forsterkning ble detektert i PCR med begge primersettene.
Primerne «spesifisitet og MSP resultatene ble bekreftet ved hjelp av et bisulfitt-sekvense PCR (BSP) tilnærming [52] . BSP ble også brukt til å evaluere den prosentandel av metylering. Primerne og anneling temperaturer på BSP er beskrevet i tabell 1. Etter forsterkning, fragmentene ble renset ved anvendelse av NucleoSpin Gel og PCR Opprensking Kit (Macherey-Nagel, Tyskland), ligert inn i pGEM-T-lett vektor (Promega, Tyskland) og klonet inn kompetente
E
.
coli
JM109 celler. Etter inkubasjonstiden ble hvite kolonier utvalgt for PCR med M13 forover (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 «) og M13 revers (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3») primere [53]. Etter innledende denaturering i 3 minutter ved 94 ° C, PCR amplifikasjon bestod av 35 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, og 72 ° C i 90 s ble utført, etterfulgt av en endelig forlengelse for 5 min ved 72 ° C. PCR-produktene ble synliggjort på agarosegel. Seks kloner ble valgt for rensing og sekvensert i en ABI310 automatisk sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle sekvensene ble justert med BioEdit v7.0.5 [54], og metylering analysene ble utført med BIQ Analyzer [55]. Prosentandelen av metylering for hver prøve ble beregnet ved å dividere antall metylerte CPGs av det totale antall CPGs sekvensert (CPGs i alle de seks kloner).
Statistiske analyser
Dataene er vist som frekvensen, median og interkvartilt område (IQR). Shapiro-Wilk test ble anvendt for å vurdere fordelingen av alder, mRNA, protein ekspresjon og prosentandelen av metylering av data og for å bestemme den passende etterfølgende test for statistiske sammenligninger. Mann-Whitney test ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger mellom kinase mRNA eller protein uttrykk og kategoriske variabler, for eksempel immunoreaktivitets, metylering mønster og clinicopathological funksjoner. Mann-Whitney test ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger mellom andelen av metylering og immunoreaktivitets og clinicopathological funksjoner. Wilcoxon-testen ble brukt for å sammenligne prosentandelen av metylering mellom par av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver. En sammenheng mellom kategoriske variabler ble analysert ved hjelp av Chi-squared (χ
2) test. En Spearman korrelasjonstest ble anvendt for å vurdere den mulige korrelasjon mellom mRNA og protein ekspresjon, så vel som promoter metylering. En p-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Bonferroni justering av p-verdien ble brukt når flere sammenligninger ble utført, med alfa nivå blir delt på antall sammenligninger.
Resultater
Kinase uttrykk i mage svulster
ikke-atypiske mage celler ikke til stede SRC eller LYN immunoreaktivitets (fig 1A og 1C). Imidlertid SRC immunoreaktivitet ble observert i dysplastiske celler. Cellemembranen og cytoplasmatiske immunoreaktivitets for SRC og LYN ble oppdaget i neoplastiske celler (figur 1B og 1D), og LYN også presenteres nukleinsyre immunoreaktivitets. CKB immunoreaktivitet ble funnet i cytoplasma eller i cellemembranen i ikke-neoplastiske gastriske celler (figur 1E). I motsetning til GC celler gjorde ikke tilstede CKB immunoreaktivitets (Fig 1F)
A) mageslimhinnen uten SRC immunoreaktivitets.; B) diffuse-type magekreft presentere cellemembran og cytoplasmisk immunoreaktivitet av SRC; C) ikke-neoplastisk mage vev uten LYN immunoreaktivitets; D) intestinal-type magekreft presentere LYN immunoreaktivitets; E) ikke-neoplastisk mageslimhinnen som viser svak cytoplasma CKB farging i kjertelceller; F) diffuse-type magecancerceller uten CKB immunreaktivitet.
SRC, LYN og CKB immunoreaktivitet ble funnet i 72 (52,2%), 66 (47,8%) og 0 (0%) av tumoren prøver. SRC og LYN immunoreaktivitets var assosiert med høyere mRNA og proteinnivåer i GC prøver (p 0,001 for alle sammenligninger, Mann-Whitney test; figur 2A, 2C, 2E og 2G). Protein- og mRNA-nivåer av SRC ble økt til minst 1,5 ganger (minst en 50% økning i ekspresjon) i 67 (48,6%) og 80 (58%), henholdsvis, GC-prøver i forhold til deres matchet ikke-neoplastiske gastrisk prøver (figur 2B, 2D og 2K). Dessuten ble det protein og mRNA-nivåer av LYN økes minst 1,5 ganger i 36 (26,1%) og 72 (52,2%) GC prøver, henholdsvis (figur 2F, 2H og 2K). Omvendt, nedregulering av CKB-protein og mRNA (minst 50% reduksjon av ekspresjonen) ble detektert i 104 (75,4%) og 49 (35,5%) GC prøver, henholdsvis (fig 2i, 2J og 2K). En sterk og direkte sammenheng ble observert mellom mRNA og protein uttrykk for SRC (p 0,001, ρ = 0,856, Spearman korrelasjon test), LYN (p 0,001, ρ = 0,762) og CKB (p 0,001, ρ = 0,819)
A) Association mellom SRC immunoreaktivitets og dens protein uttrykk.; B) SRC protein uttrykk; C) Association mellom SRC immunoreaktivitets og dens mRNA uttrykk; D)
SRC
mRNA uttrykk. E) Association mellom LYN immunoreaktivitets og dens protein uttrykk; F) LYN protein uttrykk; G) Association mellom LYN immunoreaktivitets og dens mRNA uttrykk; H)
LYN
mRNA uttrykk; I) CKB protein uttrykk; J)
CKB
mRNA uttrykk; K) representant bilde av Western-blot, i hvert TNM for hver prøve er showet. Protein og mRNA uttrykk ble bestemt ved Western-blot og RT-qPCR analyse, henholdsvis. I alle grafer, ble uttrykket i mage svulster normalisert ved matchet ikke-neoplastisk gastrisk vev. * Signifikant forskjell mellom gruppene med Mann-Whitney (p 0,05). IHC +: tilfeller presentere protein immunoreaktivitets; IHC-: tilfeller uten protein immunoreaktivitets; . NM: normal slimhinne prøve
immunoreaktivitets av SRC var assosiert med immunreaktiviteten LYN (p 0,001, χ
2 test) med 52 (37,7%) av GC prøvene presentere immunoreaktivitets for både proteiner. I tillegg ble det observert en direkte sammenheng mellom SRC og LYN protein (p 0,001, ρ = 0,556) og mRNA (p 0,001, ρ = 0,779) ekspresjon. Nivåene av CKB protein og mRNA uttrykk ble omvendt korrelert med SRC (p 0,001, ρ = -0,734, p 0,001, ρ = -0,806, henholdsvis) og LYN (p 0,001, ρ = -0,643; p . 0,001, ρ = -0,703, henholdsvis)
Tabell 2 viser resultatene for SRC, LYN og CKB uttrykk og clinicopathological egenskaper. Svulstene av pasienter med sent oppstått GC presenteres betydelig høyere SRC og LYN protein (ved IHC og western blotting) og mRNA (ved RT-qPCR) uttrykk, samt redusert CKB protein uttrykk ved Western blotting, sammenlignet med tidlig debut CG prøvene (p 0,05, for alle sammenligninger, tabell 2). Økt protein og mRNA-ekspresjon av SRC og LYN og redusert CKB ekspresjon var assosiert med avansert stadium, dypere tumorinvasjon, og tilstedeværelsen av lymfeknute og fjerne metastaser (p 0,05, for alle sammenligninger, tabell 2)
A gradvis betydelig økning i Src-protein (ved western blotting) og mRNA-ekspresjon ble observert svarende til tumoren trinn (p 0,008, for det meste av sammenlikningene, Mann-Whitney-test, etterfulgt av Bonferroni korreksjon, fig 3A og 3B). I motsetning til dette ble en gradvis betydelig reduksjon i CKB-protein og mRNA-ekspresjon observert svarende til tumoren trinn (p 0,008, for det meste av sammenlikningene, fig 3G og 3H). Med hensyn til LYN uttrykk, kan vi ikke observere en betydelig forskjell mellom stadiene I og II eller mellom stadiene III og IV. Imidlertid trinn I og II var signifikant forskjellig fra trinn III og IV (p 0,008, for disse sammenligningene, fig 3D og 3E)
A) Src-protein ekspresjon.; B)
SRC
mRNA uttrykk; C) Prosent av
SRC
metylering; D) LYN protein uttrykk; E)
LYN
mRNA uttrykk; F) Prosent av
LYN
metylering; G) CKB protein uttrykk; H)
CKB
mRNA uttrykk; I) Andel
CKB
metylering. Protein og mRNA uttrykk ble bestemt ved Western-blot og RT-qPCR analyse, henholdsvis. I disse uttrykk analyser, ble uttrykket i gastriske tumorer normalisert med matchet ikke-neoplastisk gastrisk vev. DNA-metylering ble bestemt ved sekvensering av PCR-bisulfitt. * Signifikant forskjell mellom gruppene med Mann-Whitney test etterfulgt av Bonferroni korreksjoner for flere sammenligning analyse (p 0,008); ** Signifikant forskjell mellom gruppene med Mann-Whitney test etterfulgt av Bonferroni korreksjoner for flere sammenligning analyse (p 0,001);
+ Forskjellen mellom gruppene, men ikke statistisk signifikant etter Bonferroni justering (p 0,05).
kinasegenet metylering mønstre i mage prøver
Tabell 3 viser metylering mønster av de undersøkte proteinkinaser i neoplastiske og ikke-neoplastiske mage prøver av MSP. Omtrent 60% og 30% av GC prøvene presenteres positiv forsterkning med bare unmethylated primer sett (hypomethylated prøver) for
SRC Hotell og
LYN
gener, henholdsvis (figur 4A og 4B). Hypometylering av disse genene ble ikke observert i noen ikke-neoplastisk prøven. Derfor hyppigheten av
SRC Hotell og
LYN
hypometylering var signifikant høyere i GC enn hos ikke-neoplastiske mage prøver (p 0,001 for alle sammenligninger, χ
2 test fulgt etter Bonferroni korreksjoner)
A)
SRC
promoter metylering analyse, der prøvene 1 og 2 presenteres hypomethylated promoter, prøve 3 presenteres delvis metylering og prøve 4 presenteres hypermethylated promoter.; B)
LYN
promoter metylering analyse, der prøver en present hypomethylated promoter, prøve 2 presenteres delvis metylering og prøver 3 og 4 presenteres hypermethylated arrangøren; C)
CKB
promoter metylering analyse, der prøvene 1 og 2 presenteres hypermethylated promoter, og prøver 3 og 4 presenteres hypomethylated promoter. C-: blank; C +: positiv kontroll, gDNA prøve fullstendig metylert; U: PCR med unmethylated primer sett; M: PCR med denaturert primer sett; MW: molekylvekt markør; bp. basepar
BSP analyse bekreftet MSP analyse. Ved BSP, 82 (59,4%) av neoplastiske prøver og 0 (0%) av ikke-neoplastiske prøver presentert en klonet sekvens uten CpG metylering i
SRC
promoter. I tillegg 4 (2,89%) og 1 (0,72%) av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøvene presentert en klonet sekvens uten CpG metylering i
LYN
promoter, henholdsvis. Ved BSP, prosentandel av
SRC product: [0,135 (0,31)
versus
0,563 (0,23); p 0.001] og
LYN product: [0,238 (0,40)
versus
0,7063 (0,26); p 0.001] metylering var lavere i neoplastiske prøvene enn i ikke-neoplastiske prøver (fig 5A og 5B)
A)
SRC
metylering i mage svulster og ikke-tumorprøver.; B)
LYN
metylering i mage svulster og ikke-tumorprøver; C)
CKB
metylering i mage svulster og ikke-tumorprøver; D) korrelasjon mellom andelen av
SRC
metylering i mage svulster og sammenkoblede røyktumorprøver; E) korrelasjon mellom andelen av
LYN
metylering i mage svulster og sammenkoblede røyktumorprøver; F) korrelasjon mellom andelen av
CKB
metylering i mage svulster og sammenkoblede røyktumorprøver. * Signifikant forskjell mellom gruppene med Mann-Whitney test (p 0,05).
SRC Hotell og
LYN
metylering mønstre av neoplastiske og ikke- neoplastiske prøver mens funnet å være assosiert (p 0,001, for begge analyser; χ
2-test). Vi observerte at 70/81 (86,4%) av svulster med hypomethylated
SRC
presenteres delvis metylering av dette genet i matchet ikke-neoplastisk prøve. I tillegg fant vi at 37/41 (90,24%) av svulster med hypomethylated
LYN
presenteres delvis metylering av dette genet i matchet ikke-neoplastisk prøve.
SRC Hotell og
LYN
delvis metylering i ikke-neoplastiske prøvene ble hyppigere observert hos individer presentere tumorprøver med hypometylering av dette genet sammenlignet med svulster med delvis metylering (p 0,001 for begge analyser) eller hypermethylation (p 0,001 for begge analysene). Videre delvis metylert
LYN
i ikke-neoplastiske prøver ble også hyppigere detektert i individer som presenterer tumorprøver med delvis metylering av dette genet sammenlignet med tumorer med hypermethylation (p = 0,004). Ved BSP, vi også observert at andelen av
SRC product: (p 0,001, ρ = 0,6902; Fig 5D) og
LYN product: (p 0,001, ρ = 0,739; figur 5E ) metylering av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver ble korrelert.
CKB
delvis og hypometylering ble observert i begge neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver. Imidlertid, 48 (39%) av GC prøver presentert
CKB
hypermethylation (figur 4C), som ikke ble detektere i de ikke-neoplastiske prøver. Videre hyppigheten av
ckb
-hypermethylated prøvene var betydelig høyere i neoplastisk sammenlignet med ikke-neoplastiske mage prøver (p 0,001), og
CKB
delvis metylering var også signifikant hyppigere hos GC enn i ikke-neoplastiske prøver (p 0,001). Ved BSP, prosentandel av
CKB
metylering var høyere i neoplastiske prøvene enn i ikke-neoplastiske prøver [0,511 (0,42)
versus
0,133 (0,12); p 0,001; Fig 5C]. Klonede sekvenser uten CpG metylering ble påvist i fire (2,89%) og 0 (0%) av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver, henholdsvis.
CKB
metylering mønster av neoplastiske og ikke -neoplastic prøvene viste seg å være forbundet (p = 0,014, ved χ
2-test). En 2×2-analyse ved hjelp av χ
2 test viste at parene der tumorprøver present hypermethylated
CKB Hotell og matchet ikke-neoplastiske prøvene presenteres hypometylering av dette genet var hyppigere enn par av svulster med hypermethylation og matchet ikke-neoplastiske prøver med delvis metylering (p = 0,0381), men dette funnet var ikke statistisk signifikans hvis Bonferroni justering ble brukt (justert α = 0,05 /3 = 0,0167). Men ved BSP, observerte vi at andelen av
CKB
metylering av neoplastiske og ikke-neoplastiske prøvene ble inverst korrelert (p 0,001, ρ = -0,375; figur 5F).
En direkte korrelasjon ble observert mellom
SRC Hotell og
LYN
metylering mønstre i de ikke-neoplastiske prøver (p 0,001, ρ = 0.627). I tillegg ble en invers korrelasjon oppdaget mellom
SRC Hotell og
CKB product: (p 0,001, ρ = -0,467) og
LYN Hotell og
CKB
(p 0,001, ρ = -0,359) metylering. Men i GC prøvene ble en direkte sammenheng observert mellom metylering prosentandel av de tre studerte kinaser:
SRC Hotell og
LYN product: (p 0,001, ρ = 0,840);
SRC Hotell og
CKB product: (p 0,001, ρ = 0,684);
LYN Hotell og
CKB product: (p 0,001, ρ = 0,663).
Metylering regulering av kinaser
Å belyse epigenetisk regulering av de studerte gener, vurderte vi en mulig sammenheng mellom promotoren metylering og protein immunoreaktivitets og mRNA og protein uttrykk (med western blotting)
Vi har observert at både mRNA og protein uttrykk for SRC (p. 0,001, ρ = -0,834; p 0,001, ρ = -0,718, henholdsvis figur 6A og 6B) og LYN (p henholdsvis 0,001, ρ = -0,792, p 0,001, ρ = -0,654 fig 6D og 6E) ble inverst korrelert til prosentandelen av promoteren metylering. Videre svulster med SRC [0,062 (0,08)
versus
0,375 (0,33); p 0,001; Mann-Whitney test; 0,001; Yang et al. Li et al.
