Abstract
β-lapachone, en viktig komponent i en etanol ekstrakt av
Tabebuia avellanedae
bark, er et lovende potensial terapeutisk legemiddel for ulike tumorer, inkludert lungekreft, den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. I den første delen av denne undersøkelsen, fant vi at apoptotisk celledød indusert i lungecancerceller ved høye konsentrasjoner av β-lapachone ble mediert ved øket aktivering av pro-apoptotiske faktor JNK og redusert aktivering av cellen overlevelse /proliferering faktorer PI3K, AKT, og ERK. I tillegg ble β-lapachone toksisitet positivt korrelert med ekspresjon og aktivitet av NAD (P) H kinonoksidoreduktase 1 (NQO1) i tumorcellene. I den andre delen, fant vi at FDA-godkjente ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler sulindak og dets metabolitter, sulindak sulfid og sulindak sulfone, økt NQO1 uttrykk og aktivitet i lunge adenokarsinom cellelinjer CL1-1 og CL1-5, som har lavere NQO1 nivåer og lavere følsomhet overfor p-lapachone behandlings enn A549-cellelinjer, og at inhibering av NQO1 ved enten dikumarol behandling eller NQO1 siRNA knockdown inhiberte denne sulindac-induserte økning i β-lapachone cytotoksisitet. I konklusjonen, sulindak og dets metabolitter synergistisk øke kreft effekter av β-lapachone primært ved å øke NQO1 aktivitet og uttrykk, og disse to stoffene kan gi en ny kombinasjonsbehandling for lungekreft
Citation. Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) sulindak Forbindelser Tilrettelegge Cytotoksisitet av β-Lapachone ved oppregulering av NAD (P) H kinonoksidoreduktase i human lungekreft celler. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10,1371 /journal.pone.0088122
Redaktør: Gergely Szakács, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 05.01.2014; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Kung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd (NSC 101-2320-B-002-020-My3, NSC 98-2320-B-715-001-My3 (YPC) og NSC 101-2320-B-002-008) fra National Science Council , Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
β-Lapachone, en naturlig o-naphthoquinone opprinnelig hentet fra
Lapacho
trær i Sør-Amerika, har lovende anti-tumor aktivitet på ulike kreftceller [1] – [6] og har vært testet som en anti-tumor legemiddelkandidat i fase i /II /III kliniske studier i kombinasjon med andre cytostatika [1], [7]. Sin anti-kreft-aktivitet er antatt å være på grunn av den to-elektron-reduksjonen av β-lapachone katalysert av NAD (P) H: quinon oksidoreduktase (NQO1, DT-diaforase), ved hjelp av NAD (P) H eller NADH som elektronkilde [ ,,,0],1], [8], [9]. I nærvær av NQO1, gjennomgår β-lapachone reduksjon til en ustabil hydrokinon, som hurtig gjennomgår en to-trinns oksidasjon tilbake til stamforbindelsen, vedlikeholdende en intetsigende redoks-syklus, og som resulterer i generering av reaktive oksygenarter (ROS) som innbefatter superoksyder [ ,,,0],8], [10] – [12]. Disse reaktive arter som kan oksidere tiolgrupper av mitokondrielle potensiell overgang pore-komplekset, noe som fører til økt mitokondrie indre membran permeabilitet, redusert mitokondriemembranen depolarisering, og frigjøring av cytokrom c, som resulterer i celledød [13], [14]. Fordi NQO1 er mer høyt uttrykt i ulike solide kreftformer enn i normalt vev [15], kan β-lapachone selektivt drepe disse kreftcellene. I tillegg kan høyere NQO1 ekspresjon eller aktivitet i kreftceller gjør dem mer følsomme for p-lapachone. For å øke den kliniske effekten av β-lapachone, har mange fremgangsmåter blitt undersøkt for å øke NQO1 ekspresjon eller aktivitet i kreftceller [3], [5], [16] -. [19]
sulindac er en Food and Drug Administration (FDA) -godkjent ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) for behandling av slitasjegikt, Bekhterevs sykdom, gikt eller leddgikt [20] – [23]. Sin anti-inflammatorisk aktivitet er på grunn av sin hemming av syntesen av prostaglandiner [24], som forårsaker betennelse og smerte i kroppen. Sulindac har også blitt funnet å blokkere syklisk guanosinmonofosfat-fosfodiesterase, et enzym som hemmer normal apoptose signalveien, og denne inhiberende virkning gjør det mulig for apoptotiske signalveien for å fortsette uhindret, noe som resulterer i celledød ved apoptose og å redusere forekomsten av forskjellige tumorer, inkludert bryst, spiserør, mage, prostata, blære, eggstokk og lunge kreft [25], [26]. Hos mennesker blir sulindac redusert til det aktive anti-inflammatorisk metabolitt, gjennomgår sulindac sulfid en to-trinns reoksydasjon til sulindac sulfon [27], [28]. Alle tre forbindelser har vist seg å ha chemoprotective effekter. I tykktarmskreft, har sulindac blitt brukt for å øke anticancer effekten av visse reagenser eller påkjenninger, blant annet bortezomib [4], hydrogenperoxyd [29], og oksidativt stress [30]. Viktigere, sulindac og dets metabolitter modulerer ekspresjonen av multioxidative enzymer, inkludert glutation S-transferaser og NQO1, sistnevnte er nøkkelen regulator av β-lapachone-indusert celledød i kreftceller [28], [31], [32], og sulindak kan derfor ha en synergistisk anti-tumor effekt med β-lapachone
Lungekreft, de store kreft på verdensbasis, er nå den ledende årsak til kreft dødsfall [33] -. [35]. Ifølge en rapport fra Institutt for helse, direktør Yuan, ROC (Taiwan) publisert i 2010, dødeligheten for lungekreft er 20%, toppet listen over alle kreftrelaterte dødsfall. Kostnaden for helsetjenester for behandling av lungesykdom øker enormt hvert år, og truer med å overmanne offentlige helsetjenester [36]. For å få et bedre mål terapi, har forskere forsøkt å identifisere viktige forskjeller mellom lungekreftceller og normale lungeceller, slik som mutasjon eller overekspresjon av gener, inkludert
EGFR, ras
, og
VEGF
[37] – [39]. Dessverre, nåværende kjemoterapi for lungekreft mangler tilstrekkelig spesifisitet, effekt og behandling heterogenitet er også et stort problem [40]. Det er derfor et stort behov for nye terapeutiske legemidler eller nye kombinasjoner av medikamenter for å gi mer effektiv lungekreft behandling. Siden NQO1 overekspresjon har blitt bemerket i både ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje [41], [42], kunne β-lapachone være et potensielt terapeutisk legemiddel for lunge cancer. Men noen lungekreftceller viser lavere NQO1 ekspresjon eller aktivitet, og kan derfor være resistent overfor p-lapachone toksisitet. I denne studien vi først undersøkt forholdet mellom β-lapachone toksisitet og NQO1 nivåer i NSCLC-cellelinjer, så bestemt signalveien som er involvert i celledød som følge av høye konsentrasjoner av β-lapachone. Vi har også brukt lavere konsentrasjoner av β-lapachone for å utforske hvorvidt sulindac og dens metabolitter kan rette anticancer virkning av β-lapachone ved å øke NQO1 ekspresjon eller aktivitet hos lungecancercellelinjer med lav NQO1 nivå og kontrollert betydningen av NQO1 i denne kombinasjonsterapi . Vi har funnet at toksisiteten av β-lapachone var relatert til nivået av NQO1 ekspresjon eller aktivitet i lungekreftceller og at høye konsentrasjoner av β-lapachone døde celler ved å redusere fosforylering av PI3K, AKT, og ERK og aktivering av JNK. I tillegg ble cytotoksisiteten av lave konsentrasjoner av β-lapachone økes ved kombinasjon med sulindak og dets metabolitter, en prosess som involverer oppregulering av ekspresjon eller aktivitet av NQO1.
Materialer og metoder
Cell Culture
De humane lungekreft-cellelinjer CL1-1, CL1-5, og A549, ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, 100 enheter /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin (alt fra Gibco). Cellelinjene var gaver fra Dr. PC Yang, National Taiwan University Hospital [43], i hvis laboratorium CL1-5 celler ble valgt ut fra foreldre CL1-1 celler for større metastatisk potensial ved hjelp av et transwellsystem.
Cell Levedyktighets Analyser
CL1-1, CL1-5, eller A549-celler (1×10
4) ble sådd ut i 24 timer ved 37 ° C i en 96-brønners kulturplate, ble deretter underkastet sult etter 14 h i RPMI 1640 medium inneholdende 2% kalvefosterserum, 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Etter 6 timers forbehandling med medium eller den angitte konsentrasjon av sulindac eller dens metabolitter (alle fra Sigma) ble cellene inkubert i 12 timer med eller uten den angitte konsentrasjon av β-lapachone i den fortsatte tilstedeværelsen av sulindac eller dens metabolitter, og deretter cellelevedyktigheten ble bedømt.
to cellelevedyktighet analyser ble anvendt. I krystallfiolett farging analysen ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farget med 0,4% krystallfiolett i 15 min, og vasket med H
2o, deretter 50% syre alkohol ble anvendt for å oppløse den bundne krystall fiolett og OD ved 550 nm målt på en ELISA-leser. I MTT-analysen, ble 10 ul av MTT (0,5 mg /ml) (Sigma) tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer, deretter ble formazanprodukt ble oppløst i 100 ul DMSO ved 37 ° C i 30 min og OD ved 570 nm målt på en mikroplateleser.
Acridine Orange (AO) Farging
Cells (5×10
4) dyrket på dekkglass i 24-brønn platene ble inkubert i 14 timer i RPMI 1640 medium inneholdende 2% kalvefosterserum, preinkubert med sulindac sulfid i 6 timer, og deretter behandlet med eller uten β-lapachone i 24 timer, deretter ble umiddelbart fiksert i 4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 10 minutter ved romtemperatur (RT), og farget i 10 minutter med 0,5 ml av AO (10 mg /ml i PBS) (Sigma). Etter flere PBS vasker, ble cellene undersøkt på et Olympus BH-2 invertert mikroskop utstyrt med en fluorescens-vedlegg.
Påvisning av apoptose og måling av intracellulær kalsiumnivåer
For å oppdage apoptose, celler ( 1×10
6) ble behandlet i 3, 6 eller 9 timer med 5 uM β-lapachone, deretter ble vasket med iskald PBS, trypsinert med 0,05% trypsin-0,02% EDTA, farget i 15 minutter ved 37 ° C med Annexin V-FITC (10 mikrogram /ml) (Strong Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Taiwan), og analysert ved flowcytometri på en FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson).
For å måle intracellulære kalsiumnivåer, cellene ble inkubert i 10 minutter ved 37 ° C med 2 mM Fluo-4 /AM (Molecular Probes), vasket med PBS, trypsinert, og analysert ved hjelp av FACSan strømningscytometri ved bruk av FL1H parameteren.
Western Blot analyser
Behandlede celler ble lysert med RIPA-buffer inneholdende 10 ug /ml protease-inhibitor (Sigma), og deretter lysatet ble sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min ved 4 ° C og supernatanten oppsamlet for immunblotting. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved Bradford-analysen, og prøver inneholdende 20 ug protein ble separert ved 10 eller 12% SDS-PAGE, og deretter overført til Immobilon-P-membran i 2 timer ved 200 V (Millipore) i en Trans-Blot Elektrofore Transfer celle. Membranene ble blokkert i 1 time ved RT med 5% skummet melk i PBS-0,2% Tween 20 (PBS-T) og deretter inkubert i 2 timer ved RT med antistoffer mot NQO1 (Cell Signaling), PI3 kinase eller p-PI3 kinase (Millipore), AKT eller p-AKT (Epitomics), ERK, p-ERK, JNK, eller p-JNK (Cell Signalling), GAPDH (Genetex) eller β-aktin (Abcam) fortynnet 1:1000 i 1% BSA. Etter vasking i 30 minutter ved RT med PBST, ble membranene inkubert i 1 time ved RT med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Perkin-Elmer, Boston, MA, 1:5000 fortynning i PBST), ble deretter bundet antistoff påvises ved å bruke ECL Western blotting-reagens (Amersham), kjemiluminescens som blir detektert ved anvendelse av en Fuji medisinsk røntgenfilm (Tokyo, Japan) og kvantifisert ved gel-bildeanalyser med image Pro programvare. Intensiteten av bandet av interesse ble delt av at for β-aktin eller GAPDH (laste kontroller) og denne verdien normalisert til at sett med ingen behandling.
RNA interferens
Cellene ble transfektert med ikke-måls kontroll siRNA (siNeg) eller siRNA rettet mot NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) ved hjelp XtremeGene siRNA transfeksjon reagens (Roche), deretter nivåer av de angitte transkripsjoner og proteiner ble undersøkt ved realtime PCR (ved hjelp av primere oppført i tabell S1 ), RT-PCR, og Western blotting, og cellene ble deretter anvendt i forsøkene.
Revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert med Trizol (Invitrogen) og revers-transkribert til cDNA ved hjelp av en Super II revers transkripsjon kit (Invitrogen), deretter PCR ble utført ved hjelp av følgende primere:. NQO1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC, R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) eller GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC, R, GCCAGTGGACTCCACGAC)
NQO1 aktivitet assay
å måle endogen NQO1-aktivitet i celleekstrakter ble cellene vasket med PBS og sonikert i lyseringsbuffer (25 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT). Analysereaksjonsblandingen (endelig volum 200 ul) inneholdt 25 mM Tris pH 7,5, 0,01% Tween 20, 0,7 mg /ml BSA, 40 uM 2,6-dichloroindophenol (DCPIP, Sigma), 5 pM FAD, 200 pM NADH 50 ug av celleekstrakt, og enten 10 pM dikumarol eller medium. Nedgangen i DCPIP absorbans ved 600 nm i fravær eller nærvær av dikumarol ble målt ved 5 sek intervaller i 60 sekunder og aktiviteten uttrykt som relativ aktivitet, sammen med kontrollaktiviteten gitt en verdi på 1.
Statistical Analysis
Alle kvantitative data er presentert som gjennomsnitt ± SEM for minst tre separate forsøk. Forskjeller mellom gruppene ble undersøkt ved hjelp av enveis ANOVA med Scheffe test, med p 0,05 (* eller #), p 0,005 (**), eller p 0,001 (***) som vurderes statistisk signifikant
Resultater
NQO1 Expression og aktivitet i lungekreft celler korrelerer med β-lapachone Toxicity
å sammenligne cytotoksisitet av β-lapachone for ulike lungekreftceller, tre cellelinjer, CL1-1 , CL1-5, og A549, ble inkubert i 12 timer med β-lapachone (0 til 10 uM), deretter celle overlevelse ble målt ved krystallfiolett farging. Som vist i figur 1A, ved hjelp av 1-5 uM β-lapachone de A549-cellene viste en vesentlig lavere prosentandel overlevelse enn CL1-1 CL1-5 og celler, men det var ingen signifikant forskjell mellom de forskjellige celler ved hjelp av 10 uM β- lapachone. Siden NQO1 aktivitet har blitt positivt korrelert med β-lapachone cytotoksisitet i brystkreftcellelinjer [8], [9], [44], undersøkte vi hvorvidt følsomheten av de forskjellige lungecancer cellelinjer p-lapachone toksisitet var forbundet med intracellulære NQO1 uttrykk. Figurene 1B-D viser NQO1 aktivitet (Fig. 1B), NQO1 RNA-nivåer (fig. 1C), og NQO1 proteinnivåer (Fig. 1D) i CL1-1, CL1-5, og A549 celler og viste at under normal kulturen forhold, alle tre verdier var høyest i A549 celler og lavest i CL1-5 celler. Vi så sammenlignet sensitiviteten til A549, CL1-1, og CL1-5 celler til behandling med 0-10 uM β-lapachone for 3, 6, 12, eller 24 timer ved hjelp av krystallfiolett-farging og funnet at den prosentvise overlevelse av CL1- 5-celler var høyere enn den til CL1-1 celler ved alle 4 tidspunkter, og at A549-celler viste den laveste prosentandelen overlevelse (figur 1E). Disse resultatene korresponderte godt med de intracellulære NQO1 nivåene i de tre cellelinjer, som følsomheten p-lapachone var høyere i celler med høyere NQO1 nivåer. Disse dataene viste at NQO1 nivå eller aktivitet spiller en nøkkelrolle i β-lapachone cytotoksisitet for lungekreft cellelinjer.
(A) Prosent overlevelse av lungekreft cellelinjer CL1-1, CL1-5, og A549 . Celler ble behandlet med 0-10 uM β-lapachone i 12 timer, deretter cellelevedyktigheten ble bestemt ved krystallfiolett farging-analyse og uttrykt som en prosent av verdien for kulturer uten β-lapachone. (B-D) NQO1 aktivitetsnivå (B), NQO1 RNA uttrykk nivåer (C), og NQO1 protein uttrykk nivåer (D) i de tre lunge kreft cellelinjer dyrket under normale kultur forhold. (E) Prosent overlevelse av A549 celler (venstre panel), CL1-1 celler (center panel) og CL1-5 celler (panel høyre) inkubert med den angitte konsentrasjon av β-lapachone for 3, 6, 12 eller 24 timer undersøkt ved hjelp av krystall-fiolett farging, og uttrykt som prosentvis overlevelse sammenlignet med ubehandlede celler. Resultatene er gjennomsnitt ± SD for 3 uavhengige eksperimenter, hver i tre eksemplarer.
I påfølgende eksperimenter, siden β-lapachone alene var svært effektiv på å drepe A549 celler, og vi ønsket å undersøke om sulindak eller dens metabolitter hadde en synergistisk effekt med β-lapachone, konsentrerte vi på CL1-1 og CL1-5 celler. I tillegg, siden den største forskjell i overlevelse av CL1-1 CL1-5, og cellene ble sett ved β-lapachone konsentrasjoner på 2 til 5 uM, vi brukte 5 uM β-lapachone for å studere effekten av β-lapachone alene og 2 pM β-lapachone å studere synergieffekter av sulindak og β-lapachone.
Identifikasjon av apoptotiske signalveien utløst av β-lapachone
for å undersøke den underliggende mekanismen involvert i β-lapachone giftighet, 5 iM β-lapachone ble brukt til å utforske den apoptotiske signalveien aktiveres ved β-lapachone i CL1-1 og CL1-5 celler. Ved hjelp av Annexin V-farging, celledød i β-lapachone-behandlede CL1-1 CL1-5 og ble vist å forekomme ved apoptose (figur 2A). Cellesyklusanalyse viste også at under G0 /G1-forhold (apoptotiske celler) økte på en tidsavhengig måte (figur S1A). I studier som måler intracellulære kalsiumnivåer, ble en økning observert etter en eller to h β-lapachone behandling i både CL1-1 CL1-5 og celler (figur 2B, pil), som under aktivering av apoptotiske reaksjonsvei ved β-lapachone [6], [45]. Prosentandelen celleoverlevelse, målt ved anvendelse av MTT-analysen, ble bare delvis gjenopprettet ved tilsetning av 0-10 uM BAPTA (Molecular Probes), en intracellulær kalsium chelateringsmiddel, under inkubering i 24 timer med 5 mM β-lapachone (figur 2C), som viser at økte intracellulære kalsiumnivå var ikke den eneste faktoren i β-lapachone-indusert celledød av disse cellene. Selv om kalpain og caspase 3, komponenter av apoptotiske signalveien, ble aktivert ved behandling med 5 mM β-lapachone i 0-9 h (fig S1B), som vist i figur 2, Tilsetnings caspaser og kalpain var ikke involvert i lungekreft celledød indusert av β-lapachone, som 1 time forbehandling med pannen kaspaseinhibitor zVAD eller kalpain inhibitoren ALLM eller ALLN (alle fra Sigma) ikke hemme effekten (fig S2). I begge cellelinjer, ble mitokondriemembranpotensialet (MMP) ble redusert ved behandling av tre, seks eller ni t med β-lapachone (figur S1C), men intracellulære H
2o
2-nivåer ble ikke endret ved β -lapachone behandling for 3 eller 6 h (Figur S1D). Disse resultatene viser at β-lapachone forårsaker apoptose av både CL1-1 og CL1-5 celler ved å redusere MMP.
(A) CL1-1 celler (venstre panel) eller CL1-5 celler (panel til høyre) ble inkubert med 5 uM β-lapachone for 0, 3, 6 eller 9 timer, deretter ble kontrollert for apoptose ved hjelp av Annexin V (B) CL1-1-celler (venstre panel) eller CL1-5-celler (høyre panel) ble inkubert med 5 uM β-lapachone for den angitte tid, så intracellulære kalsiumnivåer ble målt ved anvendelse av Fluo-4-farging og flowcytometri. Intensiteten av Fluo-4-farging ble økt med β-lapachone behandling, spesielt ved 1 h (piler). (C) CL1-1 celler (venstre panel) eller CL1-5 celler (høyre panel) ble etterlatt ubehandlet eller ble inkubert i 24 timer med den angitte konsentrasjon av BAPTA-AM, en intracellulær kalsium chelateringsmiddel, og /eller 5 uM β- lapachone, deretter celle overlevelse ble målt ved MTT-analyse og uttrykt som prosent overlevelse sammenlignet med ubehandlede celler. * P 0,05, ** p. 0,01 i forhold til p-lapachone alene
For å bestemme signalveier aktivert i β-lapachone-indusert lungekreft celledød, nivåene av de fosforylerte formene for PI3K, AKT, og MAPK ERK og JNK i CL1-1 CL1-5 og celler ble undersøkt. β-lapachone behandling av 10-180 minutter øket JNK-fosforylering, men redusert fosforylering av ERK (figur 3A) og av PI3K og AKT (figur 3B). I tillegg, i konsentrasjoner på 1, 2 eller 5 uM, JNK-inhibitor SP600125 delvis reddet celler fra toksisitet indusert ved 24 timers inkubering med β-lapachone (figur 3C), som viser at JNK spiller en viktig rolle i kreftcellen lunge død indusert ved β-lapachone.
(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5-celler (høyre) ble inkubert med 5 uM β-lapachone for den angitte tid, og deretter nivåer av p-ERK, ERK , p-JNK, og JNK ble målt ved Western blotting. (B) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5-celler (høyre) ble inkubert med 5 uM β-lapachone for 0, 3, 6 eller 9 timer, deretter nivåer av p-PI3K og p-AKT ble undersøkt etter Western blotting. (C) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5-celler (høyre) ble forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av JNK-inhibitor sp600125 i 6 timer, og deretter behandlet med eller uten 5 uM β-lapachone for 24 h.Cell overlevelse ble målt ved MTT-analyse og uttrykt som prosent overlevelse sammenlignet med ubehandlede celler * p. 0,05 (D) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (høyre) forble ubehandlet eller ble preinkubert i 1 time med 10 uM dikumarol, deretter medium eller 5 uM β-lapachone ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 9 timer, og nivåer av p-PI3K og p-AKT ble målt ved Western blotting.
for å bestemme hvorvidt NQO1 var en viktig regulator i β-lapachone-mediert lungekreft celledød, cellene ble inkubert i 6 timer med 10 uM dikumarol, en spesifikk inhibitor NQO1, og dette resulterte i omtrent en 67% og 77% reduksjon i aktivitet i NQO1 CL1- 1 og CL1-5 celler, respektivt (figur S3A). Dikumarol behandling inhiberte signifikant reduksjon i fosforylering av p-PI3K og p-AKT forårsaket av 9 h av β-lapachone behandling (figur 3D), blokkerte økning i intracellulære kalsiumnivåer fremkalt av 1 time av β-lapachone behandling (figur S3b) og markert hemmet apoptotisk celledød forårsaket av 6 timers inkubering med β-lapachone, som vist ved Annexin V-farging (figur 4A) og akridin orange (AO) farging (figur 4B).
(A) CL1 -1 celler (øverst) eller CL1-5 celler (nederst) ble stående ubehandlet eller ble inkubert i 6 timer med fem mikrometer β-lapachone og /eller 10 mm dicoumarol, deretter farget med Annexin V-FITC og Annexin V fluorescens målt ved flowcytometri. (B) morfologiske endringer etter behandling. CL1-1 CL1-5 eller cellene forble ubehandlet (CTL) eller ble inkubert i 24 timer med 5 mM β-lapachone med eller uten 10 mM dikumarol, deretter farget med acridin oransje for å observere morfologi av cellekjernen. Målestokk representerer 50 mikrometer.
sulindak og dets metabolitter Øk cytotoksisk effekt av β-lapachone gjennom Aktivering av NQO1
NSAID sulindak og dets metabolitter, sulindak sulfid (redusert form) og sulindac sulfon (oksidert form), er kjent for å modulere ekspresjonen av enkelte multioxidative enzymer, inkludert NQO1 [31], [32]. Siden NQO1 nivåer og aktivitet har negativ sammenheng med cytotoksisiteten til β-lapachone, vi neste undersøkt hvorvidt sulindac og dens metabolitter kan øke cytotoksisiteten til β-lapachone for celler med lav NQO1 uttrykk og nedre β-lapachone følsomhet, slik som CL1-1 og CL1-5 celler.
for å avgjøre om sulindak og dets metabolitter kan modulere NQO1 uttrykk i lungekreft cellelinjer, ble de brukt ved konsentrasjoner på 100 og 250 mikrometer å behandle CL1-1 og CL1-5 celler for 6, 12 eller 24 timer. Som vist i figur 5A, i CL1-1 celler, begge konsentrasjoner av sulindac eller metabolitter oppregulert NQO1 proteinnivåer ved alle 3 tidspunkter, mens det i CL1-5 celler, var resultatene mer komplisert, en økning ble sett etter inkubering i 12 eller 24 timer med 100 mikrometer, men ikke 250 mikrometer, sulindak, på alle tre tidspunkter med både konsentrasjoner av sulindak sulfone eller 100 mikrometer sulindak sulfid, og med 250 mikrometer sulindak sulfid i 6 timer (12 og 24 timer ikke testet) (figur 5A). NQO1 enzymaktivitet ble også økt med alle tre kjemikalier (figur 5B). Som vist i fig S4, 100 og 250 uM, de tre stoffene hadde ingen signifikant effekt på den prosentvise overlevelse av CL1-1 CL1-5 og celler etter inkubasjon med sulindac eller sulindac sulfonet i 54 timer eller med sulindak sulfid i 12 timer. For å undersøke den synergistiske virkning av sulindac eller dens metabolitter og β-lapachone i lungekreftceller, ble CL1-1 CL1-5 og celler inkubert med 0, 50, 100, eller 250 pM sulindac eller metabolittene i 6 timer, deretter med 2 uM β-lapachone i den fortsatte tilstedeværelsen av sulindac eller metabolitt i 12 timer, og den prosentvise overlevelse ble målt ved anvendelse av krystallfiolett farging. Sammenlignet med celler behandlet med β-lapachone alene, var overlevelsen av begge cellelinjer ble redusert med 10-40% når cotreated med β-lapachone plus sulindac, 20-40% med β-lapachone plus sulindac sulfon, og 30-60% med P-lapachone pluss sulindak sulfid (Figur 6A). Den cotreatment-induserte reduksjonen var større med CL1-5 CL1-1 celler enn med celler, dvs. at den var større med cellene som uttrykker lavere nivåer NQO1 (figur 6A); i tillegg, uten ekstra effekt av kombinert behandling sammenlignet med p-lapachone alene ble sett med A549-celler (figur S5) som uttrykker de høyeste nivåene NQC1. Disse data viser at sulindac kan øke følsomheten av celler med lave nivåer NQO1 p-lapachone cytotoksisitet. Ved hjelp av AO farging og fluorescens mikroskopi, 6 h forbehandling med 100 eller 250 uM sulindac sulfid, etterfulgt av tilsetning av 2 uM β-lapachone i 12 timer resulterte i en reduksjon i CL1-1 CL1-5 og celletetthet sammenlignet med p-lapachone alene (figur 6B), og lignende resultater ble oppnådd med kombinasjonen av β-lapachone og enten sulindac eller sulindac sulfon (data ikke vist).
(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 cellene (høyre) forble ubehandlet eller ble inkubert med 100 eller 250 uM sulindac, sulindac sulfon, eller sulindac sulfid til 6, 12 eller 24 timer, deretter proteinnivåer ble målt ved Western blotting. (B-D) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5-celler (høyre) forble ubehandlet (CTL) eller ble inkubert med den angitte konsentrasjon av sulindac (B), sulindac sulfon (C), eller sulindac sulfid (D ) i den angitte tid, ble deretter NQO1 aktivitet målt. *: P 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen
(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (. høyre) forble ubehandlet eller forbehandlet i 6 timer med den angitte konsentrasjon av sulindac, sulindac sulfon, og sulindac sulfid, deretter ble 2 uM β-lapachone ble tilsatt i 12 timer, deretter celle overlevelse ble målt ved anvendelse av krystallfiolett-farging og uttrykt som prosent overlevelse sammenlignet med ubehandlede celler. *: P 0,05 sammenlignet med p-lapachone alene. (B) To sett av hver celletype ble etterlatt ubehandlet eller ble inkubert i 6 timer med 100 eller 250 uM sulindac sulfid, deretter ble 2 uM B-lapachone ble tilsatt til ett sett, og inkubasjonen ble fortsatt i 12 timer, deretter ble den morfologi undersøkt ved acridinoransje farging. Målestokk representerer 100 mikrometer.
NQO1 spiller en nøkkelrolle i sulindak-indusert økning i β-lapachone Cytotoksisitet for lungekreft celler
Selv om NQO1 uttrykk og aktivitet ble økt med sulindak og dets metabolitter, enten NQO1 var en stor bidragsyter til sulindak-indusert økning i β-lapachone cytotoksisitet fortsatt nødvendig etterforskning. To metoder ble anvendt for å hemme enzymaktiviteten eller protein ekspresjon av NQO1, en NQO1 inhibitor og NQO1 siRNA knockdown.
dikumarol har vært tidligere brukt for spesifikt å inhibere ekspresjon og aktivitet av NQO1 [44]. Som vist i figur 7, forbehandling av celler med 100 eller 250 uM sulindac (figur 7A), sulindac sulfon (figur 7B), eller sulindac sulfid (figur 7C), etterfulgt av tilsetning av 2 uM β-lapachone i 12 timer øket cytotoksisiteten av β-lapachone for både CL1-1 og CL1-5 celler og disse effektene ble betydelig redusert ved tilsetning av 10 mikrometer dicoumarol.
CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (til høyre) ble forlatt ubehandlet eller forbehandlet i 6 timer med 100 eller 250 uM sulindac (A), sulindac sulfonet (B), eller sulindac sulfid (C) med eller uten 10 mM dikumarol, deretter ble inkubert i ytterligere 12 timer med eller uten tilsetning av 2 uM β-lapachone, deretter celle overlevelse ble målt ved hjelp av krystall-fiolett farging, og uttrykt som prosentvis overlevelse sammenlignet med ubehandlede celler. *: P. 0,05
Ved hjelp av siRNA knockdown av NQO1, på dag 1 til 3 etter NQO1 siRNA transfeksjon av CL1-1 og CL1-5 celler, ingen endring i cellevekst eller celle morfologi ble notert (figur S6). Effektivitet av knockdown i CL1-1 CL1-5, og cellene ble påvist i RNA-ekspresjon ved RT-PCR (figur 8A) og sanntids-PCR (fig S7) og for protein ekspresjon ved western blotting (figur 8B og C), som viser at NQO1 siRNA betydelig nedregulert NQO1 uttrykk. Som vist på figur 8D, NQO1 siRNA transfeksjon inhiberte signifikant økning i NQO1 enzymaktivitet indusert i CL1-1 celler ved inkubasjon i 6 eller 24 timer med 100 eller 250 uM sulindac (venstre panel), sulindac sulfon (midtpartiet), eller sulindac sulfid (høyre panel). Når cellene transfektert i 24 timer med siNQO1 eller kontroll siRNA ble forbehandlet i 6 timer med sulindak eller dets metabolitter, så cotreated for 12 timer med narkotika pluss 2 mikrometer β-lapachone, de prosent celle overlevelse Resultatene viste resultatene at transfeksjon med NQO1 siRNA forårsaket en betydelig reduksjon i cytotoksisiteten av kombinasjoner av β-lapachone med sulindak (figur 9A), sulindac sulfon (figur 9B), eller sulindac sulfid (figur 9C). Disse resultatene viste at NQO1 spiller en viktig rolle i økning i β-lapachone-indusert celledød som følge av sulindac eller dets metabolitter.
(A-C) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 cellene (høyre) ble transfektert i 1 til 3 dager med kontroll siRNA (CTL) eller siRNA som målretter NQO1, ble deretter RNA-ekspresjonen målt ved hjelp av PCR (A) og protein ekspresjon ved Western blotting (B og C). (D) CL1-1 celler transfektert i 2 dager med kontroll siRNA eller NQO1 siRNA ble inkubert alene eller sammen med 100 eller 250 uM sulindac, sulindac sulfid, eller sulindac sulfonet til 6 eller 24 timer, ble deretter NQO1 aktivitet målt. *: P 0,05, ***: p 0,001 sammenlignet med identisk behandlede celler transfektert med kontroll siRNA
CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (til høyre) ble transfektert. med kontroll siRNA (-) eller NQO1 siRNA (+) i 24 timer, deretter ble etterlatt ubehandlet eller ble inkubert i 6 timer med 100 eller 250 uM sulindac (A), sulindac sulfonet (B), eller sulindac sulfid (C), og deretter
