Abstract
22Rv1 cellelinje er mye brukt for prostata kreft forskning og andre studier i hele verden. Disse cellene ble etablert fra en human prostata svulst, CWR22, som ble serielt passert i nakne mus og valgt for androgen uavhengighet. De 22Rv1 celler er kjent for å produsere høye titere av xenotropisk murine leukemivirus-relatert virus (XMRV). Nyere studier antydet at XMRV ble utilsiktet opprettet på 1990-tallet da to murine leukemi virus (MLV) genomer (pre-XMRV1 og pre-XMRV-2) saman under aging av CWR22 svulst i mus. Konklusjonen om at XMRV stammer fra mus og ikke pasienten ble delvis basert på manglende oppdage XMRV i tidlige CWR22 xenografter. Mens det fradrag er absolutt berettiget, undersøkte vi muligheten for at en nært beslektet virus kunne ha vært til stede i primær svulstvev. Her melder vi at vi har funnet den opprinnelige prostatatumorvevet utskåret fra pasient CWR22 og har analysert det tilsvarende DNA ved hjelp av PCR og seksjoner vevet ved fluorescens
in situ hybridisering
for tilstedeværelsen av XMRV eller en lignende virus. Den primære tumorvev manglet mus DNA som bestemmes av PCR for intracisternal En type partikkel DNA, og dermed unngår en av begrensningene som studerer xenografter. Vi viser at hverken XMRV eller en nært beslektet virus var til stede i grunn prostatavev fra pasient CWR22. Våre funn bekrefter og forsterker den konklusjon at XMRV er et rekombinant laboratorium generert mus virus som er svært tilpasset for menneske prostata kreft celler
Citation. Das Gupta J, Luk KC, Tang N, Gaughan C, Klein EA , Kandel ES, et al. (2012) Fravær av XMRV og nært beslektede virus i primær prostatakreft Vev for avledning av XMRV-infisert cellelinje 22Rv1. PLoS ONE 7 (5): e36072. doi: 10,1371 /journal.pone.0036072
Redaktør: Gilda Tachedjian, Burnet Institute, Australia
mottatt: 1 februar 2012; Godkjent: 25 mars 2012; Publisert: May 16, 2012 |
Copyright: © 2012 Das Gupta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse undersøkelsene ble utført med støtte fra Charlotte Geyer Foundation, maltz Family Foundation og Abbott Laboratories (til RHS og EAK), NCI tilskuddet CA137708 (til ESK), og av vev anskaffelser, Histologi og Immunohistochemistry Kjerne Facility av saken Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703). Medforfattere på Abbott var involvert i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet. De øvrige virkemiddelapparatet hadde ingen slike roller
Konkurrerende interesser:. KL, NT og JH er ansatte og aksjonærer i Abbott Laboratories. JDG, EAK, og RHS er oppfinnere om patenter er lisensiert til Abbott Laboratories som er knyttet til XMRV. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
xenotropisk murine leukemi virus-relatert virus (XMRV) er en gammaretrovirus oppdaget under studier av prostatakreftpasienter med en subtil genetisk defekt i genet for antiviral protein RNase L [1]. Mens flere påfølgende studier gitt ytterligere bevis for enten XMRV eller en nært beslektet virus i prostatakreftpasienter [2] – [6], flere studier enten ikke klarte å oppdage eventuelle bevis for XMRV i prostatakreftpasienter eller bevis ble innhentet, men var begrenset til en lite antall humane prøver [7] – [16]. Noen av de positive funn i prostata cancer, inkludert, men ikke begrenset til, integreringssete kartlegging og påvisning av PCR-produktene ble senere funnet å være et resultat av laboratorie forurensning [17], [18]. Mulige kilder til forurensning inkluderer mus DNA husing MLV provirus, XMRV plasmid eller PCR-produkter, og XMRV seg fra infiserte cellelinjer. For eksempel er DNA-mus og til stede i spormengder i enkelte Taq polymerase, PCR hoved blanding preparater og DNA-ekstraksjon kits som fører til falske positiver i PCR-analyser [19] – [22]. Falske negative kan også produseres i PCR-analyser ytterligere forvirrende påvisning av XMRV eller relaterte virus [23]. En enkelt studie viste også tilstedeværelsen av XMRV i kronisk utmattelsessyndrom pasienter [24], men nylig disse resultatene er i stor grad tilskrives laboratorium forurensning [25] – [27] og den opprinnelige rapporten var retracte [28]. Basert på en nylig storstilt studie av blodgivere i USA, er det usannsynlig at XMRV
per se
har inngått denne menneskelige befolkningen i vesentlig grad (0% prevalens 95% konfidensintervall 0% -0,017 %) [29]. Likevel, noen av de positive funnene som involverer ikke-PCR baserte metoder, for eksempel serologi, immunhistokjemi og fluorescens
in situ
hybridisering (FISH), som har tilsynelatende oppdaget XMRV eller lignende virus i prøver fra mennesker har ennå å bli fullt explaine [1], [3], [24]. Slike bevis later åpne muligheten for at enten mus DNA eller en XMRV-lignende virus er til stede i det minste noen mennesker.
På bakgrunn av dette ble opprinnelsen til XMRV nylig belyst ved å studere den menneskelige prostatakreft cellelinje, 22Rv1, og dets xenograft forløpere vokst i nude mic [30]. De 22Rv1 cellene er infisert med, og produsere høye titer av en XMRV som er nesten identisk i rekkefølge for å XMRV belastning VP62 av prostatakreft studie [1], [30], [31]. Opprinnelsen til 22Rv1 celler kan spores tilbake til et menneske prostata carcinom (Gleason grad av 9) som ble skåret ut i 1992 ved Case Western Reserve Universit [32]. Deretter svulsten, kalt CWR22, ble serie transplantert i nakne mus. I 1996, etter fire år med serie passasje i hårløse mus, ble kastrering av musene utført fører til regresjon og tilbakefall av Tumo [33]. Den resulterende androgen-uavhengig tumor, CWR22R, ble deretter serie transplantert i mus til 1999 når det ble brukt til å etablere den 22Rv1 cellen lin [34]. Høye nivåer av XMRV er tilstede i de 22Rv1 cellelinjer og i slutten av avsnitt av den CWR22 tumor, men ikke i begynnelsen av xenograft [30], [35]. Bemerkelsesverdig, vertmus inneholde to provirus, pre-XMRV1 og pre-XMRV2, med lange strekninger ( 3,2 kb), som er 99,9% identisk med XMR [30]. Det ble antatt at rekombinasjon mellom de to provirus førte til XMRV og det XMRV var fraværende fra den opprinnelige tumor. Men de opprinnelige tumorprøver ble ikke undersøkt i disse rapportene mens xenotransplantater uunngåelig inneholde lave nivåer av museceller. Tilstedeværelsen av endogene provirus mus i DNA av slike kontaminerende museceller begrenser valget av sonder og PCR-primere som kan brukes til å identifisere XMRV lignende elementer i disse prøvene. Her beskriver vi analysen av parafininnstøpte prostata blokker fra pasient CWR22 og viser at verken XMRV eller nært beslektede virus er til stede i den primære svulsten.
Materialer og metoder
Behandling av prostatavevet Blocks
Behandling av formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) blokker ble utført i Genomisk medisin institutt og Institutt for laboratoriemedisin, Cleveland Clinic. Fem prostatavevet parafinblokker fra pasient CWR22 (merket A, B, C, E og K) ble seksjonert ved en bredde av 5 μ på en mikrotom som hadde blitt brukt utelukkende for humane prøver. Snittene ble enten samlet i rør for DNA-ekstraksjon eller plasseres på objektglass for FISH analyse. Snittene ble lagret i en 4 ° C kjøleskap i Genomisk Medicine Institute biorepository (Cleveland Clinic). DNA-ekstraksjon ble utført i det samme laboratorium i hvilken hverken XMRV eller XMRV plasmid ble aldri brukt. De innsamlede opprinnelig vev hvorfra CWR22 transplantasjon ble produsert ble forkastet vev og ingen pasient samtykke var nødvendig.
Utvinning av DNA fra prostata seksjoner
DNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av følgende metode (gitt av Dr. Charis Eng, Genomisk Medicine Institute, Cleveland Clinic: https://www.lerner.ccf.org/gmi/gmb/methods.php). Deparaffinization ble utført ved å tilsette 1 ml xylen til 18 deler (5 μ bredde hver) og rystet forsiktig i 10 minutter, sentrifugering i 10 min ved 16 000 g ved romtemperatur, og forkaster supernatantene. Dette trinn ble gjentatt to ganger. Ekstraksjonen ble deretter utført med 1 ml av hver av 100% etanol (2 ganger), 80% etanol (2 ganger) og 50% etanol (2 ganger), hver gang sentrifugering i 10 min ved 16 000 g ved værelsestemperatur og kasting av supernatanten . Til pelleten 1 ml nuclease-fritt vann (USB /Affymetrix) ble tilsatt og inkubert ved 4 ° C over natten. Pelleten ble samlet opp etter sentrifugering i 10 min ved 16 000 g ved romtemperatur etter kassering av supernatanten. Nucleic Acid Lysis-buffer, 700 ul (10 mM Tris Base, 400 mM NaCl, 2 mM Na
2EDTA og 0,7% SDS) ble tilsatt til pelleten. Proteinase K, 50 ul (30 mg /ml) (Invitrogen) ble tilsatt, og fordøyelse ble utført ved 65 ° C i 24 timer. Ytterligere 50 ul av proteinase K-løsning ble tilsatt, inkubert over natten ved 65 ° C, ble 250 mL av 6 M NaCl tilsatt, blandet grundig og fikk stå ved romtemperatur i 10 min. Prøvene ble sentrifugert i 10 minutter ved 16 000 g ved romtemperatur for å pelletere DNA, og supernatantene ble forsiktig fjernet. Pelletene ble vasket med 70% etanol og lufttørket på benke-platen i noen få min. Hver pellet ble resuspendert i 40 ul TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA) (USB /Affymetrix) og lagret ved 4 ° C
enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) genotyping (Roswell Park Cancer. Institute)
SNP genotyping ble utført ved hjelp av MassARRAY Compact system (Sequenom, Inc., San Diego, CA) på et panel av 30 egendefinerte SNP analyser konstruert ved hjelp RealSNP og MassARRAY analysen Designer (Sequenom). I korthet innebærer den protokoll PCR-amplifisering av 10 ng DNA ved hjelp av SNP-spesifikke primere, etterfulgt av en base ekstensjonsreaksjon ved hjelp av iPLEX gull kjemi (Sequenom). De endelige bunnen forlengelse produkter ble behandlet og sett på en 384-pad SpectroCHIP (Sequenom) med en ChipSpotter LT nanodispenser (Samsung). En MassARRAY Analyzer Compact MALDI-TOF MS (Sequenom) ble brukt for datainnsamling fra SpectroCHIP. De resulterende genotypene ble kalt bruker MassARRAY Typer Analyzer v4.0 (Sequenom).
Kvantitativ PCR (qPCR) for XMRV (Cleveland Clinic)
DNA-prøver ble fortynnet til 100 ng /mL i TE buffer og 2 pl (200 ng) alikvoter ble anvendt i duplikat til de qPCR analyser (bortsett fra for prøve K, ble 17 ng av DNA som brukes på grunn av en mindre mengde av tilgjengelig DNA). Fast Mastermix (Applied Biosystems) ble brukt for qPCR analyser ved hjelp av en Step One Plus Real time PCR maskin følge produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). PCR-betingelsene for bruk av PCR Fast Mastermix var: 95 ° C i 20 sekunder for innledende denaturering, etterfulgt av 95 ° C i 1 sek, 60 ° C i 20 sekunder (datainnsamling trinn), gjentatt 50 ganger for. Oligonukleotidprobene inneholdt 6-carboxyfluorescein (FAM) knyttet til 5 «enden og ikke-fluorescerende Quencher-Minor Grove Binder (NFQ-MBG) knyttet til 3» enden (Applied Biosystems].
env
genet:
6124F: 5′-GGCCGAGAGAGGGCTACT-3 «
6159R: 5′-FAM-CACATCCCCATTTGCC-NFQ-MGB-3′
6197R: 5 « -TGATGATGATGGCTTCCAGTATGC-3 «
gag
genet:
625F: 5′-GTAACTACCCCTCTGAGTCTAACCT-3′
668F: 5′-FAM-TCCAGCGCATTGCATC- NFQ-MGB-3 «
708R: 5′-CTTCTTGACATCCACAGACTGGTT-3′
pol
genet:
4843F: 5′-CGGGACAGAACTATCCAGTATGTGA-3 «
4873F: 5′-FAM-ACCTGCACCGCCTGTG- NFQ-MGB-3′
4912R: 5′-TGGCTTTGCTGGCATTTACTTG -3 «
Som en intern kontroll, vi målte nivåer av RNase P-genet (et enkeltkopi-gen) som koder for RNA-delen for RNase P enzymet. VIC-merket kontroll RNase P-primer-probe kombinasjon fra Applied Biosystems, ble anvendt. en kjent kopiantallet av den fulle lengde XMRV VP62-genomet i plasmid pcDNA 3.1 [36] ble brukt som en positiv kontroll for å teste hver primer-sonde kombinasjon.
Intracisternal A-partikler (IAP) qPCR analyser (Cleveland Clinic)
qPCR for mus IAP DNA ble utført med følgende oligonukleotid primere /probe:
IAP-1414F: 5′-TGGCGAAAGTCAGCGTACTG-3 «
IAP-1435F: 5′-FAM-TCAACCTCCCGGCAGT-NFQ-MGB-3 «
IAP-1472R: 5′-CATAGGGCGGACCTTGAAAC-3′
Som en positiv kontroll for IAP, ble musehale DNA ekstrahert ved bruk av Qiagen DNA-ekstraksjon kit, dets konsentrasjon målt ved absorbans og seriefortynnet i TE-buffer for å generere standardkurven. PCR-betingelsene var de samme som brukes til å oppdage XMRV sekvenser.
Real-time RT-PCR-testing for XMRV (Abbott Molecular)
Single-round sanntid revers transkriptase polymerase chain reaction ( RT-PCR) prototype analyser ble kjørt på
m
2000
rt
TM (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) instrument. Et gjennomsnitt på 500 ng av DNA fra prostata kreft pasient CWR22 (blokker A, B, C, E og K) ble forsterket med to primersett designet for å målrette polymerase (
pol
) eller konvolutten (
env
) regioner av XMRV genom. Hver DNA-prøve fortynnet i vann for å oppnå et 25 ul volum ble kombinert med 25 ul av konsentrat-blanding som inneholdt 10 x EZ buffer, rTth enzym, dNTPs, Rox referanse fargestoff, MnCl
2, primere og prober, for å oppnå en endelig PCR-reaksjonsvolum på 50 ul. Primer /probe sekvenser, sykkelforholdene og sensitivitet /spesifisitet estimering av
pol Hotell og
env
RT-PCR-analyser har blitt beskrevet i detalj previousl [37]. En primer /probe sett for å detektere 136 baser av human
β
p-globin-genet ble brukt til å kontrollere for prøve tilstrekkelighet og ble amplifisert og detektert samtidig med XMRV (Fam signal) i den samme reaksjons med en annen fluorescens fargestoff (Cy5 signal). TE-buffer inneholdende 1,5 ug /ml poly dA: dT ble anvendt som analyse negativ kontroll (NC). XMRV VP62 DNA plasmid fortynnes i NC ble brukt som analyse positiv kontroll (PC).
Fluorescence
in situ
hybridisering (FISH) (Abbott Diagnostics)
XMRV- sÅ FISH probe ble utarbeidet av direkte merking av hele plasmid DNA (~13.6 kb) av klon VP62 /pcDNA3.1 bærer en full-lengde genomet (~8.2 kb) av XMRV VP62 (36) med SpectrumOrange fluorophore gjennom kjemiske reaksjoner som beskrevet previousl [38], [39]. Den prosentvise innlemmelse av SpectrumOrange i XMRV-SO sonde var ~8%. CEP8-SA probe avledet fra centromeric sekvens av humant kromosom 8 og direkte merket med SpectrumAqua fluorophore ble hentet fra Abbott Molecular, Inc.
For evaluering av XMRV FISH probe ytelse, XMRV infisert DU145 prostatakreft celle [36] ble anvendt som en negativ kontroll, mens 22Rv1 prostatakreftceller husing -10 integrerte kopier av XMRV per celle og å generere høy-titer XMRV virus [31] ble anvendt som en positiv kontroll. Begge cellelinjer ble dyrket i DMEM-F12 komplett medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Etter å ha nådd 60% -70% konfluens, 1 ml colcemid oppløsning (10 ug /ml; Invitrogen) ble tilsatt per 50 ml kulturmedium og celler ble dyrket ved 37 ° C i 2 timer. Cellene ble høstet etter trypsinering, vasket en gang med 40 ml 1 gang DPBS (Invitrogen), resuspendert i 40 ml av 0,075 M kaliumklorid-løsning (Invitrogen) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket med 40 ml Carnoy sin fiksativ (03:01 v /v metanol: iseddik, Fisher, Pittsburgh, PA) fire ganger, resuspendert i 5 ml Carnoy er fiksativ og lagret ved -20 ° C. Lysbilder med en blanding av DU145 og 22Rv1 ble utarbeidet ved å deponere 10 mL av hver cellesuspensjon på Superfrost Plus positivt ladet lysbilde (ThermoShandon, Pittsburgh, PA). Raset ble lufttørket over natten før FISH forbehandling og hybridisering
Cell objektglass ble forbehandlet i 2x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsitrat, pH 7,0, Invitrogen). Ved 73 ° C i 2 min deretter inkubert i 0,5 mg /ml pepsin i 10 mM HCl (USB, Cleveland, OH) ved 37 ° C i 10 min. Platene ble skylt i 1 gang DPBS (Invitrogen) i 5 minutter ved romtemperatur, fiksert i 1% nøytral bufret formalin-løsning (Fisher) i 5 minutter, og deretter nedsenket i 1x DPBS i 5 min. Glass ble dehydrert i en etanol serie på 70%, 85% og 100% for 1 min hver, og deretter lufttørket. Ti pl av hybridisering oppløsning ble fremstilt ved å blande 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonikert humant placenta-DNA, 250 ng humant Cot-1 DNA, og 7 ul LSI /WCP hybridiseringsbuffer (Abbott Molecular, Inc. ), og ble applisert på hvert objektglass. Et dekkglass (22 x 22 mm, VWR, Radnor, PA) ble plassert over sonden løsning, og forseglet til sleiden med gummisement (Staples, Framingham, MA). Prober og celle nukleinsyrer på hvert objektglass ble co-denaturert ved 73 ° C i 3 minutter og deretter hybridisert ved 37 ° C i 16-24 timer på en hybridisering plattform (ThermoBrite; Abbott Molecular, Inc.). Etter hybridisering, ble objektglass vasket i 0,4x SSC /0,3% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) i 2 min ved 73 ° C og deretter i 2 x SSC /0,1% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) for ett min ved romtemperatur. Ti mL av atom counterstain DAPI II (125 ng /ml, Abbott Molecular, Inc.) ble anvendt på hver prøve, og lysbilder ble evaluert under en fluorescens mikroskop. XMRV-SO sonden ble visualisert med en oransje filter sett, ble CEP8-SA sonde visualisert med en aqua filter sett, og DAPI atom farging ble visualisert med en DAPI filter sett.
Lysbilder montert med FFPE prostatakreft vevsdelene ble bakt ved 56 ° C i 4 timer og deretter lagret ved romtemperatur. Som forberedelse for FISH hybridisering, ble vevsprøve glass deparaffinized tre ganger i Hemo-De løsningsmiddel (Scientific Safety Løsemidler, Keller, TX) i 5 minutter hver ved romtemperatur og skylt i absolutt etanol to ganger, 1 min hver gang. Objektglass ble deretter forbehandlet i en løsning av 45% maursyre (Fisher) /0.3% hydrogenperoksyd (Calbiochem, San Diego, CA) i 15 min ved romtemperatur og skylles i H
2O i 3 min. Objektglass ble deretter inkubert i forbehandling oppløsning (Abbott Molecular, Inc.) ved 80 ° C i 35 min, vasket i H
2o ved romtemperatur i 3 min, inkuberes i en pepsin-oppløsning (1,5 mg /ml i 0,1 N HCl ) ved 37 ° C i 22 minutter, skylles i H
2o ved romtemperatur i 3 min. Objektglassene ble deretter dehydrert i 70%, 85% og 100% etanol i 1 minutt hver, og fikk tørke ved romtemperatur. Ti ul probe hybridisering blanding inneholdende 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng lydbehandlet menneskelige placenta DNA, 250 ng humant Cot-1 DNA, og 7 mL LSI /WCP hybridisering buffer ble plassert over hvert vev seksjon. En dekkglass ble anvendt og kanter ble beseglet til lysbildet med gummi sement. Prober og prøven vev nukleinsyrer på hvert objektglass ble ko-denaturert i 5 minutter ved 73 ° C og hybridisert i 16-24 timer ved 37 ° C på en ThermoBrite. Etter hybridisering, ble objektglass plassert i 2x SSC /0,1% NP-40 ved romtemperatur i 5-10 minutter, vasket i 0,4 x SSC /0,3% NP-40 ved 73 ° C i 2 minutter og i 2 x SSC /0,1% NP-40 ved romtemperatur i 1 min. Ti mL av atom counterstain DAPI I (1000 ng /ml, Abbott Molecular, Inc.) ble påført hver vev delen, og lysbilder ble evaluert under en fluorescens mikroskop
Etisk erklæringen
Disse. studier ble godkjent av Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board # 1.
Resultater
Identifisering og verifisering av CWR22 prostata vev
i 1992, prostatakreft pasient CWR22 gikk transurethral reseksjon av prostata ved case Western Reserve Universit [32]. Etter operasjonen, ble chips av prostatavevet fiksert i 10% nøytral bufret formalin og innstøpt i parafinblokker. Etter diagnostiske studier og utstedelse av en standard patologi rapport, ble blokkene holdt i lagring av Department of Pathology (Case Western Reserve University) ved konstant romtemperatur, hovedsakelig i ubelyste rom. I midten av 2011 ble vevsblokker identifisert om arkiverte papir poster som har sin opprinnelse fra pasient CWR22 og ble deretter hentet fra lagring. Universitetssykehusene (Cleveland) Institutional Review Board åpner for vedlikehold av pasient og prøve poster for fremtidige studier; med en evne til gjen sammenhengen samtidig opprettholde en brannmur for å hindre utslipp av noe offentlig helseinformasjon til etterforskerne.
prostata blokkene ble delt på en mikrotom brukes utelukkende for menneskelig vev ved Institutt for laboratoriemedisin (Cleveland Clinic ). DNA ble ekstrahert i Genomisk Medicine Institute (Cleveland Clinic) i et laboratorium hvor hverken XMRV eller XMRV nukleinsyrer ble anvendt. For å bekrefte den felles opphav av prøvene, DNA-prøvene fra fem FFPE prostata blokker fra pasient CWR22 (merket A, B, C, E 40 sykluser, som er under den pålitelige deteksjonsgrense og sannsynligvis representerer en gjenstand. Ingen mus IAP-DNA ble detektert ved PCR av DNA ekstrahert fra CWR22 prostatavevet som indikerer et fravær av forurensende mus-DNA i disse prøvene (tabell 2).
Amplifikasjon plott av sanntidsanalyse for qPCR (A) påvisning av XMRV bestemte regioner (
gag
,
pol Hotell og
env
) bruker XMRV VP62 plasmid DNA (3750 eksemplarer) og (B) i DNA ekstrahert fra ulike deler av CWR22 prostata vev (vevsblokker A, B, C E, hver analysert i duplikat). For blokk C bare en av to analysen for
env
var svakt positiv, alle andre analyser for
gag
,
pol Hotell og
env
var negative .
RNase P
prober ble brukt for å påvise tilstedeværelse av genomisk DNA i tumorvev.
Real-time RT-PCR på Abbott Molecular.
For ytterligere å avhøre prostata vevsprøver for bevis for XMRV infeksjon, to ekstra single-runde i sanntid RT-PCR-analyser rettet mot XMRV
pol Hotell og
env
ble utnyttet. Sensitivitet og spesifisitet av de to analyser for påvisning av XMRV har tidligere blitt vist; disse var basert på sammenligning til flere analyser med kodede kontrollpaneler som er opprettet av Blood XMRV Scientific Research Working Group (BSRWG) [37], [43]. Ved hjelp av fullblod og plasmaskjermer utarbeidet av BSRWG, disse analysene var lik den mest sensitive analyser teste [43]. Bruke serielle fortynninger av XMRV VP62 plasmid-kontroller, kan begge analysene pålitelig oppdage 5 kopier av DNA per reaksjon. Basert på denne analysens følsomhet, regner vi med en nedre deteksjonsgrense på ca. 1 provirale genom per 17.000 celler. Positive kontrollreaksjoner var positive og negative kontroller var negative (fig. 3A). Ingen XMRV ble oppdaget av enten
pol
eller
env
analyser i DNA hentet fra CWR22 prostata blokkene A, B, C, E og K (figur 3A;. Tabell 2). Signalforsterkning plott av
β-
globin (Cy5) forsterket i samme løp (Fig. 1B, tabell 2) viste at alle pasientprøvene var positive for
β
p-globin DNA, indikerer det var tilstrekkelig DNA til stede i prøvene for amplifisering.
Amplification plott fra sanntids-PCR-analyse av (A) XMRV (FAM) signal i DNA ekstrahert fra forskjellige deler av CWR22 prostata vev, og drives kontroll med
pol Hotell og
env
primer /probe sett; (B)
β-
globin (Cy5) signal i samme løp.
XMRV FISH analyse av CWR22 vevssnitt
En alternativ tilnærming for molekylær identifisering av virusinfeksjon er fisk. FFPE vevssnitt fra hver av de CWR22 prostata blokkene A, B, C, E og K ble undersøkt for tegn på XMRV infeksjon ved anvendelse av en direkte-merket probe (XMRV-SO). Sonden blanding inneholdt også en andre probe, CEP8-SA, som hybridiserer til den centromeric regionen av humant kromosom 8 som tjente som en intern kontroll for å overvåke integriteten av FISH hybridisering trinnet. Lysbilder inneholder en blanding av uinfiserte DU145 prostata kreft celler og XMRV-infiserte 22Rv1 prostatakreftceller (≥10 integrerte kopier /celle) ble brukt til å etablere spesifisitet og lokalisering av FISH hybridisering. Resultatene av denne analysen er vist (figur 4A (B) det samme bildet som viser CEP8-SA aqua flekker i DU145 (tre kopier /celle) og 22Rv1 (to kopier /celle); . (C – G) representative bilder som viser XMRV-SO FISH resultatene på vevssnitt fra blokkene A, B, C, E og K, henholdsvis fra CWR22
Diskusjoner
En tidligere studie foreslår at XMRV ble dannet ved rekombinasjon mellom to endogene provirus av mus, pre-XMRV1 og pre-XMRV2, under passasje av de CWR22 tumorceller in nude mic [30]. Mens XMRV oppsto i mus, er det sterkt innrettet for humane prostata epitelceller som følge av virus-vertscelleinteraksjoner in vivo. For eksempel, XMRV trafikkert til prostata epitel i løpet av 6 eller 7 dager etter eksperimentell infeksjon av rhesusape [44], men ikke i pigtailed aper ved 119 dager etter infectio [45]. Innledende infeksjoner i CWR22 celle avstamning som førte til 22Rv1 cellelinjen ble trolig tilrettelagt av medfødt immunitet mangler.
