Abstract
Som svar på ioniserende stråling og visse kjemoterapeutika, døende kreftceller lokke fram en potent kreft immunrespons. Imidlertid har den potensielle effekten av wogonin (5,7-dihydroksy-8-Methoxyflavone) på kreft immunogenisitet ikke undersøkt. Her viste vi for første gang at wogonin utløser en potent antitumorimmunitet effekt ved å indusere translokasjon av calreticulin (CRT) og Annexin A1 til celle plasmamembranen, så vel som frigjøring av høy mobilitet gruppe protein 1 (HMGB1) og ATP. Signalveier som er involvert i denne prosessen ble studert. Vi fant ut at wogonin-indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon fører til en endoplasmatiske retikulum (ER) stress respons, inkludert fosforylering av PERK (PKR-lignende endoplasmatiske retikulum kinase) /PKR (protein kinase R) og eIF2α (eukaryote initiering faktor 2α ), som tjente som oppstrøms signal for aktivering av fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /AKT induserer calreticulin (CRT) /Annexin A1 cellemembrantranslokasjon. P22 /CHP, en Ca
2 + -binding protein, var assosiert med CRT og var nødvendig for CRT trans til cellemembranen. Utslipp av HMGB1 og ATP fra wogonin behandlet MFC celler, alene eller sammen med andre mulige faktorer, aktiverte dendrittiske celler og indusert cytokin utgivelser. In vivo studie bekreftet at immunisering med wogonin-forbehandlet tumorceller vaksinering betydelig hemmet homoplastic podet gastrisk tumorvekst hos mus og en mulig betennelsesreaksjon var involvert. I konklusjonen, aktivering av PI3K veien fremkalt ved ER stress indusert CRT /Annexin A1 trans ( «spise meg» signal) og HMGB1 utgivelsen, formidling wogonin-indusert immunitet av tumorceller vaksine. Dette indikerte at wogonin er en ny effektiv kandidat av immunterapi mot gastrisk tumor
relasjon:. Yang Y, Li X-J, Chen Z Zhu X-X, Wang J, Zhang L-b, et al. (2012) Wogonin Induced Calreticulin /Annexin A1 Eksponering dikterer Immunogenisitet av kreftceller i et PERK /AKT avhengig måte. PLoS ONE 7 (12): e50811. doi: 10,1371 /journal.pone.0050811
Redaktør: Marc Tjwa, Universitetet i Frankfurt – universitetssykehus Frankfurt, Tyskland
mottatt: 20 januar 2011; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr. 91129731 og 81072661), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Pharmaceutical University (No. JKGZ201102) det nye århundret gode talenter Program for Dr. Yong Yang støttes av Ministry of Education of China (NCET-09-0771), de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (No. JKZ2009006), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (No. BK2012025 og BK2011632) den, og «Major Drug Discovery» vitenskap og teknologi store prosjekter i Kina (nr 2011ZX09102-001-20). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tradisjonell kreftbehandling metoder omfatter kirurgi, strålebehandling, kjemoterapi, og for noen krefttyper, hormonbehandling. Selv om fordelene oppnås ved mange pasienter, er de sjelden kurativ for de få gjenværende disseminerte tumorceller, den primære årsaken til død hos kreftpasienter. En viktig grunn til at tumorene ikke er kontrollert av immunsystemet er at det lave immunogenisitet. Bruken av kreftvaksiner for å fremkalle en terapeutisk antitumorimmunrespons mot skjønnsomt utvalgt tumor antigener uttrykt på tumorcellene kan oppsøke og drepe disseminert tumorceller. En mulig strategi for å få dette til er immunisering med tumorceller som har blitt behandlet med en spesiell klasse kjemoterapeutiske medikamenter.
Akkumulerende bevis indikerer at flere kjemoterapeutiske midler (inkludert antracykliner og oksaliplatin), og ioniserende bestråling (for eksempel γ -rays og ultrafiolett C (UVC) lys) indusere immunogene cancercelledød [1], [2]. Det ble foreslått at de har kapasitet til å drive calreticulin (CRT) translokasjon til tumorcelleoverflaten, noe som fungerer som en «eat me» signal, er identifisert av dendrittiske celler (DCS), som resulterer i antitumor T-cellerespons [3]. Elementene i veien formidling pre-apoptotiske CRT eksponering bære en pool av CRT som pass Golgi-apparatet og skilles ut av SNARE-avhengig eksocytose [4].
HMGB1 (høy mobilitet gruppe protein 1), en kjernefysisk protein som frigjøres fra å dø celle, er liganden av Toll-like receptor 4 (TLR4) [1]. Uttømming av HMGB1 fra døende tumorceller opphever TLR4-avhengige, DC-mediert presentasjon av antigener fra døende tumorceller in vitro og in vivo [1]. I så fall er HMGB1 frigivelse kreves for immunogenisiteten av celledød gjennom sin virkning på TLR4. Imidlertid kan hverken HMGB1 eller CRT (eller en kombinasjon av begge) fremme fullstendig DC modning, indikerer at letingen etter immun-stimulatoriske molekyler som produseres av døende celler må videreføres [5].
Wogonin (5,7- dihydroksy-8-Methoxyflavone), en aktiv komponent isolert fra
Scutellaria baicalensis
radix, ble rapportert å ha hatt kreft aktiviteter ved å indusere celledifferensiering, apoptose og cellesyklus arrest [6] – [8]. I denne studien vi testet om wogonin, som noen kjemoterapeutiske medikamenter som er nevnt ovenfor, er i stand til å indusere immunogene cancercelledød, og i så fall, ble de mulige signalveier som er involvert i denne prosessen evaluert. Vi har funnet for første gang at wogonin utløser en potent antitumorimmunitet effekt ved å indusere translokasjon av CRT og Annexin A1 til celle plasmamembranen, så vel som frigjøring av HMGB1 og ATP. Vi fant ut at endoplasmatiske retikulum (ER) stress respons, inkludert PERK (PKR-lignende endoplasmatiske retikulum kinase) /PKR (protein kinase R) og eIF2α (eukaryote initiering faktor 2α subenhet) fosforylering og den påfølgende aktivering av PI3K /AKT signalveien er bære i denne prosessen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle dyr ble opprettholdt i patogenfrie forhold, og alle forsøk ble utført i henhold til Federation of European Forsøksdyr Science Association retningslinjer. Den etiske komiteen i Kina Pharmaceutical University godkjent alle dyreforsøk (Permit tall: SYXK2007-0025).
Kjemikalier og reagenser
Wogonin ble brukt i DMSO til 10 mM og lagret ved -20 ° C. Doxorubicin, Rapamycin, LY294002, AKT inhibitor X (Akti) ble kjøpt fra CalbioChem (San Diego, California). EGFR, ERK1 /2, akt1 /2, Ku 80, geite-anti-kanin-IgG-HRP og geite-anti-muse-IgG-HRP-antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). N-acetyl-cystein (NAC) og monoklonal mus anti-β-actin ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). p-PERK (Thr980), ekstra fordel, p-eIF2-α (Ser51), eIF2-α, p-PKR (Thr446 /451), PKR, p-AKT (Ser 473), p-AKT (Thr 308), Annexin A1, p-S6K (Thr389), p-4E-BP1 (Ser 65), S6K, 4E-BP1, p-GSK3p (Ser 9), p-S6 (S235 /236), p-ERK (Thr202 /Tyr204) , p-JNK (Thr183 /Tyr185) og p-p38 (THR 180 /Tyr182) antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (bevery, MA).
Cells kultur
Primær kultivert mus monocytter avledede dendrittceller (MoDCs) var fra B6-mus benmarg, opprettholdes i et MEM-medium (Sigma, St. Louis, MO) supplert med 10% FBS, pluss GM-CSF (50 ng /ml). For Western blot-analyse ble celler sådd på nytt i 6-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
5 celler /ml med friskt komplett kulturmedium. Den menneskelige magekarsinom MKN-45 celler, mus magekreft MFC-celler avledet fra 615 mus (Military Medical Sciences, Beijing), WT og akt1 /2 Double Knockout MEFs (kjøpt fra Shanghai cellen bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) ble opprettholdt i et DMEM-medium (Sigma, St. Louis, MO) supplert med et 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA), penicillin /streptomycin (1:100, Sigma, St. Louis, MO) og 4 mM L-glutamin (Sigma, St. Louis, MO) i en CO
2 inkubator ved 37 ° C.
To-dimensjonal gelelektroforese og protein identifikasjon ved massespektrometri
metodene ble referert til tidligere studie [9]. I korthet, isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført på en Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience) med 24 cm immobiliserte pH gradient strimler (pH 3-10; Amersham Bioscience). Gel (tre repetisjoner av hver) var sølv-farget i henhold til publiserte prosedyrer og skannet med en Atrix scan 1010 plus (Microtek, Taiwan, Kina), og resulterende bildene ble analysert ved hjelp av ImageMaster 2D Platinum programvare (Amersham Bioscience) for spot deteksjon, kvantifisering og komparative og statistiske analyser. Oppdages flekker og fire kontroll flekker i nonstained gel områder ble skåret ut (ca 1 mm
3 kuber) fra gels farget med Coomassie Brilliant Blue. Prøvepreparering for matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight (MALDI-TOF).
dobbel eller trippel-etikett immunfluorescens Konfokalmikroskopi
MFC cellene fiksert med 4% paraformaldehyde og behandlet for immunfluorescens, som beskrevet tidligere [10], med unntak av at Cy5-, fluorescein isothiocyanate- og /eller tetramethylrhodamine B isotiocyanatgrupper merkede sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) ble anvendt. Deretter ble cellene vasket en kort stund i PBS og montert på objektglass ved hjelp av forlenge antifade kit monterings reagens (Molecular Probes). Celler ble visualisert med en Axiovert S100 invertert mikroskop (Carl Zeiss) som er koplet til en utsk konfokal enhet (Atto Bioscience, Rockville, MD) og Hg damp lyskilde. Bilder ble samlet inn ved hjelp Openlab programvareversjon 3.0.9 (Impro, Lexington, MA) med en ORCA-ER digitalkamera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu by, Japan) og filtersett for fluoresceinisotiocyanat (484 nm), tetramethylrhodamine B isothiocyanate (555 nm ), og Cy5 (650). Bildeanalyse av confocal bilder ble utført ved hjelp av Adobe Photoshop 5.5. Å tillate intensitet sammenligninger, vi brukte lignende forhold til å samle inn og manipulere bilder i hvert forsøk.
Western blot
Som nevnt før [11], 30 mikrogram av protein fra hver indikert behandlinger ble atskilt av 10% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Etter blokkering med 10% melk i 30 min, ble membranene inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Antistoff binding ble påvist med den forbedrede chemiluminescence (ECL) detection system. Western blot resultatene ble kvantifisert ved Bilde J programvare.
Biotinylation av MFC-celleoverflateproteiner
Biotinylation og utvinning av celleoverflateproteiner ble utført med en fremgangsmåte tilpasset fra referanse [1]. I korthet, 15 x 10
6 MFC-celler ble plassert på is og vasket tre ganger med iskald PBS-Ca
2 + Mg
2+ (PBS med 0,1 mM CaCl
2 og 1 mM MgCl
2). Membranproteiner ble deretter biotinylert av en 30-minutters inkubering ved 4 ° C med NHS-SS-Biotin 1,5 mg /ml (Pierce) friskt fortynnet til biotinylering buffer (10 mM trietanolamin, 2 mM CaCl
2, 150 mM NaCl, pH 7,5) med forsiktig omrøring. MFC-celler ble skylt med PBS-Ca
2 + Mg
2+ + glycin (100 mM) og vaskes i denne bufferen i 20 minutter ved 4 ° C for å undertrykke uomsatt biotin. Cellene ble deretter skylt to ganger med PBS-Ca
2 + Mg
2+, skrapet i kald PBS og pelletert ved 3000 rpm ved 4 ° C. Pelletene ble oppløst i 45 min i 600 ul lyseringsbuffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,5) inneholdende proteaseinhibitorer. Lysatene ble klaret ved sentrifugering ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble inkubert over natten med pakket streptavidin-agarose perler for å gjenvinne biotinylerte proteiner. Kulene ble deretter pelletert ved sentrifugering, og alikvoter av supernatanter ble tatt for å representere det ubundne, intracellulære lageret av proteiner. Biotinylerte proteiner ble eluert fra kulene ved oppvarming til 100 ° C i 5 minutter i SDS-PAGE prøvebuffer før lasting på en 10% SDS-PAGE-gel. For å sikre fravær av lekkasje av biotin inn i cellene, vi systematisk bekreftet fraværet av det intracellulære protein aktin i biotinylerte ekstrakter.
Immunoutfelling (IP)
Som nevnt tidligere [11], celler behandlet med de passende stimuli ble lysert med lyseringsbuffer, 200 mM NaCl (pH 7,4), 1% Triton X-100, 10% glyserol, 0,3 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, og protease-inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Aliquoter av 600 ug av proteiner fra hver prøve ble forbehandlet ved inkubering med 20 pl protein A /G-sefarose (perler) (Amersham, IL) i 1 time ved 4 ° C. Preklarede prøver ble inkubert med anti-Calreticulin (CRT) Antistoff (CS-2891, Cell Signaling Tech), eller anti-DNA-PKCS (sc-9051, Santa Cruz antistoffer) i lyseringsbuffer over natten ved 4 ° C. 30 ul protein A /G-perler ble tilsatt, og prøvene ble inkubert i 2 timer ved 4 ° C. Kulene ble vasket fem ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og en gang med lyseringsbuffer, kokt, separert ved 10% SDS-PAGE, og overført til en PVDF-membran, etterfulgt av Western blotting-analyse som beskrevet ovenfor.
CRT-Confocal immun-fluorescens
kreftceller med den angitte behandling ble fiksert og blokkert med 10% BSA i PBS i 30 min ved romtemperatur og deretter inkubert med kanin-anti-1:100 calreticulin (CRT) anti~~POS=TRUNC ( CS-2891, Cell Signaling Tech) i 1 time (prøving CRT trans) fulgt av FITC-anti-kanin-sekundært antistoff (Cell Signaling Tech, MA) ved 1:100 i 30 minutter og CRT immun-fluorescens ble observert i en konfokal mikroskopi (Leica TCS SMD FCS, Leica, Tyskland), Hoechst 33342 ble brukt til å farge atom.
Små interfering RNA (siRNA) knockdown studier
Som beskrevet før [11], siRNA for PERK (sc-36214), DNA-PKCS (sc-35200) eller p22 (sc-142330) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Kreftceller ble dyrket i komplett medium som ikke inneholdt antibiotika i 4 dager. Celler ble sådd ut i en 6-brønns plate 1 dag før transfeksjon og dyrket til 60% konfluens på følgende dag. For RNAi eksperimenter, 6,25 mL av Lipofectamine ™ LTX sammen 2,5 mL PLUS ™ Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California) ble fortynnet i 90 mL av DMEM i 5 minutter i romtemperatur. Deretter ble 10 ul siRNA (20 uM) blandet med DMEM inneholdende Lipofectamine sammen med PLUS-reagens og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i kompleksdannelse. Til slutt ble komplekset tilsatt til brønnene inneholdende 2 ml medium med 100 nM sluttkonsentrasjon siRNA. P22 (ab56953, Abcam) eller PERK (sc-13073, Santa Cruz) protein ble bestemt ved Western blot 48 timer etter transfeksjon.
reaktive oksygen arter (ROS) deteksjon
Som beskrevet før [11], kreft celler ble forhåndslastet med 1 uM av fluorescerende fargestoff dihydrorhodamine (DHR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) to timer før angitte behandlinger, som reagerer med ROS i celler og resulterer i en forandring av fluorescens. Etter å ha blitt behandlet med angitte behandlinger, ble kreftcellene trypsinert, suspendert i iskald PBS og fiksert i 70% etylalkohol i -20 ° C. Endringer i fluorescens i medikament-behandlede celler ble kvantifisert ved FACS-analyse. Induksjon av ROS generasjon ble uttrykt i vilkårlige enheter. ROS produksjonen ble også påvist ved å visualisere dihydrorhodamine (DHR) fluorescens etter konfokal immun-fluorescens mikroskopi.
Måling av ekstracellulære ATP nivåer
ATP syntese ble målt i MFC celler under ulike behandling av wogonin. I sextuplicates, 5 x 10
3-celler ble dyrket i hver brønn av en 96-brønns plate. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer, ble mengden av ATP i supernatanten målt ved bruk av Molecular Probes «ATP Bestemmelse Kit (Kaiji, Nanjing) i henhold til produsentens anvisninger. Dette settet er basert på Bioluminescens påvisning av ATP, ved anvendelse av rekombinant ildflue luciferase og dets substrat, luciferin. Total kjemiluminescens ble oppsamlet ved et luminometer. Mengden av ATP fra en testløsning ble kvantifisert ved sammenligning med en kalibreringskurve ved hjelp av ATP som standard
Cytokine Kvantifisering
MFC-kreftceller ble behandlet med angitte behandlinger for 36 timer.; supernatant prøver ble samlet og vurdert for HMGB1 hjelp ELISA kits (Shino-Test Corporation, ST51011) i henhold til sin protokoll. For cytokinfrigjøring, ble MoDCs behandlet med supernatant av MFC-celler i 24 timer ble supernatanten av MoDCs samlet og testet for IL-6 (mus IL-6 ELISA Kit, BD OptEIA, 550 950) og TNF-α (mus TNF-a ELISA Kit, BD OptEIA, 560 478) i henhold til deres protokoller.
in vivo anti-tumorcellevaksinasjon eksperiment
3 x 10
6 MFC-celler, suspendert i 200 ml PBS, enten mot venstre ubehandlet eller behandlet med wogonin (100 uM) i 4 timer. Wogonin behandlede MFC-celler ble inokulert subkutant i den nedre flanke av 6-ukers-gamle hunn 615-mus (Military Medical Sciences, Beijing), mens 5 x 10
5 ubehandlede celler ble inokulert i det kontralaterale flanke 7 dager senere som beskrevet i tidligere studie [1].
fagocytose analysen
fagocytose analysen ble utført som tidligere beskrevet [12]. MoDCs ble justert til 2,5 x 10
4cells /ml i DMEM-medium og dyrket i 24-brønners plater ved 37 ° C og 5% CO2. De fikk lov til å følge i 24 timer, og da cellene ble merket med 4 mikrometer PKH26. Vi har fremstilt MFC-celler som enten var ubehandlet eller behandlet for forskjellige konsentrasjoner av wogonin (50, 100 og 200 uM) i 2 timer. Etter MoDCs vasket med kald PBS tre ganger, ble MFC-celler merket med 0,5 uM CFSE tilsatt til 24-brønners plater for fagocytose analyser. Etter 15 min ved 37 ° C, ble det observert fagocytose av Leica DFC 450C programvare, ved hjelp av ImageJ1.38 bildebehandling og analyseprogramvare beregne prosentandelen av MoDCs som omsluttet i det minste en tumorcelle i minst 100 celler.
Statistisk analyse
verdiene i figurene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Tallene i denne studien var representanter for mer enn 3 forskjellige eksperimenter. Statistisk analyse av data mellom kontroll og behandlede grupper ble utført av en student t-test. Verdier av p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Wogonin indusert calreticulin (CRT) trans til celleoverflaten membran er avhengig av PERK og PI3K /AKT
tidligere studier har vist at en ekstern tilførsel av signaler som induserer calreticulin (CRT) plasmamembranen eksponering, som virker som en «spise me» signalering, som gir immunogenisitet til ellers ikke-immunogene celledød, slik at for en optimal anticancer kjemoterapi [1]. Neste vi testet om wogonin kan også oppføre seg på samme måte i MFC-kreftceller. Som du kan se i fig. 1A, wogonin (100 um) induserte sterk CRT celleoverflate translokasjon i MFC kreftceller hos som påvist ved Western blot testcelleoverflate CRT. Blant de signalveier som regulerer CRT-translokasjon og tilsvarende immunogene celledød /apoptose, er det nå vel etablert at pre-apoptotiske ER stress og fosforyleringen av eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 2α (eIF2α) og oppstrøms signal kinase proteinkinase R lignende endoplasmatiske retikulum kinase (PERK) er de viktigste [13]. Fosforyleringen av eIF2α ved ekstra fordel antero transport av CRT fra ER til Golgi-apparatet og exocytose av CRT-holdige vesikler, til slutt resulterer i CRT trans på plasmamembranen overflate, som tjener som nøkkel «spise-me» signal [1 ], [4], [14] – [17]. Her fant vi at knockdown PERK av målet siRNA i stor grad hemmet CRT trans av wogonin (Fig. 1A), noe som indikerer mulig involvering av PERK og ER stress i denne prosessen. Overraskende, PI3K /AKT inhibering av enten farmakologisk inhibitor (LY 294002 og AKT-inhibitor X) eller genetisk knockdown (ved bruk av akt1 /2 dobbelt knockout MEFs) også i stor grad inhibert CRT trans (Fig. 1B-D), effekten av AKT inhibering på wogonin -indusert translokasjon CRT ble også bekreftet av immun-fluorescens konfokal assay, som vist i fig. 1C. Til sammen fant vi at wogonin induserer CRT trans til celle plasma overflaten, kan PERK og PI3K /AKT være involvert i denne prosessen.
Gastric karsinom cellelinje MFC-celler ble transfektert med krafse siRNA (Ctrl, 200 nM) eller PERK siRNA (200 nM), etter 48 timer, uttrykk nivå over Perk ble oppdaget av Western blot for å verifisere PERK nivå etter siRNA behandling. Vellykket Perk knockdown celler og deres kontrollceller (Ctrl siRNA behandlede celler) ble behandlet med wogonin (100 mm) for 2 og 4 timer. Celleoverflateproteiner i den plasmamembranfraksjonen ble så biotinylert og testet for CRT, EGFR og aktin. Totalt cellelysat ble også oppnådd for å teste CRT, PERK og aktin (A). MFC-celler ble forbehandlet med AKT spesifikk inhibitor X (Akti 100 nM) eller PI3K /AKT-inhibitor LY294002 (100 nM) i 2 timer, etterfulgt av wogonin (100 pM) ble behandlet i 2 og 4 timer, CRT, EGFR og aktin i plasmaet membranproteinfraksjon ble påvist ved Western blot. CRT, p-AKT (ser 473), akt1 /2 og aktin totalt cellelysat ble også oppdaget av Western blot (B) .crt trans til celleoverflaten etter wogonin behandling ble også bekreftet av konfokal immun-fluorescens mikroskopi, trans var inhibert av Akt-inhibitor X (Akti 100 nM), doksorubicin (Dox, 1 uM, 2 timer behandling) ble her brukt som positive kontroller. (C). WT og akt1 /2 doble knockout MEFs ble behandlet med wogonin (100 mm) i 4 timer; CRT, EGFR og aktin i plasmamembranproteinfraksjon ble påvist ved Western blot. P-S6 (S235 /236), p-AKT (S473), akt1 /2, CRT og aktin i hele cellelysatet ble påvist ved Western blot (D). Forsøk i denne figur ble gjentatt minst 3 ganger, og lignende resultater ble oppnådd. Bar = 10 mikrometer.
Wogonin induserer ROS avhengig ER stressrespons, severing som oppstrøms signal for aktivering av PI3K /AKT sti
Som vi snakket om ovenfor, våre nåværende data tyder på at at wogonin indusert CRT trans, og PERK og PI3K /AKT veien kan være involvert i denne prosessen. Neste vi prøvde å dissekere denne signalveien. Som vist på fig. 2A, wogonin (100 mm) induserte en åpenbar PI3K /AKT-aktivering i MFC celler på kort tid (inntil 2 timer); interessant AKT aktivering ble nedregulert etter langvarig eksponering av wogonin (Fig. 2A og B). Samtidig, eksponering av wogonin også indusert en åpenbar ER svar som gjenspeiles av den sterke fosforylering av ER stressproteiner (ekstra fordel, PKR og eIF2α) i wogonin behandlet MFC celler (Fig. 2C). PERK siRNA knockdown, som har vist seg å hemme CRT trans (fig. 1A), i stor grad hemmet wogonin indusert fosforylering av eIF2α og PI3K /AKT aktivering i MFC-celler (fig. 2D og E), som indikerer at PERK tjener som den oppstrøms signal for wogonin indusert PI3K /AKT signalering. Ved å prøve å identifisere oppstrøms signal for wogonin indusert ER stress og PERK fosforylering, fant vi at betydelige ROS produksjon (Fig. 2F og G), PERK /PKR fosforylering og PI3K /AKT /mTORC1 aktivering utløst av wogonin ble i stor grad hemmet av anti- oksidant N-acetyl-cystein (NAC) (fig. 2G-H). På bakgrunn av dette foreslår vi at ROS endrer ER proteiner og framprovosere ER stressrespons, noe som resulterer i PERK /PKR formidling eIF2α fosforylering og påfølgende PI3K /AKT aktivering, som dirigerer CRT trans og en mulig «spise-me» signal.
Gastric karsinom cellelinje MFC-celler ble behandlet med wogonin (100 mm) for angitte tidspunkter, ble AKT og nedstrøms mTORC1 aktivering oppdaget av vestlige blotter ved hjelp av angitte antistoffer, akt1 /2, S6K, S6 og β-aktin ble også testet som likeverdige belastninger (A). AKT fosforylering ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare etter normalisert til akt1 /2 (B). Merk at Wogonin indusert en tidlig aktivering men senere hemming av AKT. MFC-celler ble behandlet med wogonin (100 uM) for angitte tidspunkter, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p-PKR (Thr446 /451), deres tilsvarende ikke-fosfo-proteiner og akt1 /2 ble påvist ved Western blot (C). MFC-celler ble transfektert med PERK siRNA i 48 timer, ble med hell transfekterte celler (bekreftet ved western blot) ble behandlet med wogonin (100 pM) i 1 time, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p- AKT (Ser 473), p-4E-BP1 (Ser 65), ekstra fordel, deres tilsvarende ikke-fosfo proteiner og β-actin ble påvist ved Western blot (D), AKT-fosforylering ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare etter normalisert til akt1 /2 (E). MFC Celler ble forbehandlet med anti-oksidant N-acetyl-cystein (NAC, 400 uM) i 2 timer, etterfulgt av wogonin (100 uM) behandling i 30 minutter, ble ROS produksjon påvist ved både fluorescens (F) og FACS ( G) analyse henholdsvis som beskrevet ovenfor. MFC Celler ble forbehandlet med anti-oksidant N-acetyl-cystein (NAC, 400 uM) i 2 timer, etterfulgt av wogonin (100 uM) i 30 og 60 minutter, p-PERK (Thr980), p-PKR (Thr446 /451), p-4E-BP1 (Ser 65), p-AKT (Ser 473) og deres tilsvarende ikke-fosfo-proteiner ble påvist ved Western blot (H). Forsøk i denne figur ble gjentatt minst 3 ganger, og lignende resultater ble oppnådd.
#
P
0,05 vs. kontroll siRNA gruppe. *
P
0,05 vs. gruppe uten NAC forbehandling. Bar = 10 mikrometer.
DNA-PKCS, danner et kompleks med ekstra fordel, formidler AKT aktivering av Wogonin
Vi neste prøvde å identifisere den middels spiller av AKT aktivering av PERK av fokus på DNA-PKCS, en nylig oppdaget PI3K medlem som kan aktivere AKT [18] – [20]. DNA-PK er sammensatt av et 470-kDa katalytisk subenhet (DNA-PKCS) og Ku antigen-komplekset (Ku80 /Ku70) og er involvert i V (D) J rekombinasjon, reparasjon av DNA-dobbeltstrengbrudd etter nonhomologous ende sammenføyning, apoptose, og transkripsjon regulering [21] .Significantly, nå er det vel etablert at DNA-PKCS, som et medlem av PI3K familien, regulerer også AKT fosforylering [22]. I tillegg er det etablert en rolle for DNA-PK i aktivering av AKT av CpG-DNA ved bruk av benmarg-avledede makrofager [23]. Videre Bozulic et al. indikerte at DNA-PK phosphorylates AKT ved induksjon av DNA-dobbelttrådbrudd [19]. I tillegg til kravet om DNA-PK fosforylerer AKT som respons på ioniserende stråling er også etablert in vivo [19]. Så neste, testet vi den mulige involvering av DNA-PKCS i wogonin indusert AKT fosforylering. En liten molekylær hemmer av DNA-PKCS, Nu7062, ble spesielt brukt her for å hemme DNA-PKCS aktivitet. I celler forbehandlet med Nu7026 ble wogonin-indusert AKT fosforylering nesten helt avskaffet (Fig. 3A). Disse resultatene støtter vår hypotese om at DNA-PKCS kan være de viktigste inter-medierer for wogonin indusert AKT aktivering. For å teste dette videre, bestemte siRNA mot DNA-PKCS ble brukt her for å knockdown DNA-PKCS. I full støtte fra våre data fra NU7026 studiene ble AKT fosforylering på både Ser473 og Thr308 stor grad svekket i wogonin behandlede celler utarmet av DNA-PKCS (Fig. 3B). Viktigere, fant vi at DNA-PKCS, AKT og PERK danne et kompleks i Wogonin behandlede celler, som reverseres ved forbehandling med DNA-PKCS inhibitor Nu 7062 (fig. 3C), basert på denne informasjonen, foreslår vi at DNA- PKCS, danner et kompleks med ekstra fordel, formidler AKT aktivering av wogonin. Imidlertid, den detaljerte mekanisme ved hvilken DNA-PKCS fosforylerer AKT i wogonin behandlede celler behov for ytterligere undersøkelser.
Gastrisk carcinom cellelinje MFC Celler ble forbehandlet med en DNA-PKCS inhibitor (Nu 7062, 10 pM) for 2 timer, etterfulgt av wogonin (100 uM) for behandling 1 og 2 timer, ble AKT-fosforylering påvist ved Western blot og DNA-PKCS og akt1 /2 ble påvist som likeverdige belastninger (A). MCF-7 celle ble transfektert med krafse (ctrl, 200 nM) eller DNA-PKCS (200 nM) i 48 timer ved hjelp av transfeksjonsmetoder vinket ovenfor, ble vellykkede transfekterte celler brukt for å teste AKT signalisering i wogonin behandlede MFC-celler (B). MFC Celler ble forbehandlet med en DNA-PKCS inhibitor (Nu 7062, 10 pM) i 2 timer, etterfulgt av wogonin (100 uM) behandling i 1 time, ble preklarede 600-ig alikvoter av cellelysatene inkubert med anti-DNA -PKcs, etterfulgt av Western blotting-analyse med henholdsvis anti-DNA-PKCS, AKT, ekstra fordel, Ku80, IgG og β-aktin (C). Forsøk i denne figur ble gjentatt minst 3 ganger, og lignende resultater ble oppnådd.
* P 0,05 vs. gruppe uten Nu7062,
* P. 0,05 vs. gruppen uten DNA-PKCS knockdown
indentify Annexin A1 og p22 som mulige mål av wogonin
for ytterligere å identifisere mulige mål av wogonin, ble en to-dimensjonale (2D) gel elektroforese pluss massespektrometri protein analyse anvendt her. Vi har fremstilt fullcelle proteiner fra Gastrisk carcinom cellelinje MKN-45-celler som enten var ubehandlet eller behandlet for forskjellige konsentrasjoner av wogonin (50, 100 og 200 uM) i 24 timer. Sammenligning av to-dimensjonale (2D) electrophoreses, etterfulgt av massespektroskopiske analyser, førte til identifisering av HMGB1 (høy mobilitet gruppe protein 1), P22 og Annexin A1 som proteiner som var sterkt indusert av wogonin behandling på en doseavhengig måte ( fig. 4A og B). Annexin-A1 er det første karakterisert medlem av annexin-familien av proteiner i stand til å binde (dvs. til vedlegg) til cellulære membraner i en kalsiumavhengig måte. Opprinnelig beskrevet som en fosfolipase A2 (PLA2) inhibitorisk protein, kan Annexin A1 påvirke mange komponenter av inflammatorisk reaksjon i tillegg til metabolismen av arakidonsyre [24], [25]. Interessant nok har Annexin A1 nylig blitt implisert i den apoptotiske cellen «spise me» signal og påfølgende fagocytose, og bevis akkumuleres for å støtte en rolle i oppløsningsfasen av betennelse. En artikkel av Arur et al. elegant demonstrert at Annexin A1 kan tjene som en endogen fosfatidylserin (PS) ligand [26], formidling engulfment av apoptotiske celler. Annexin A1 er rekruttert til PS rike regionen i celleoverflaten og medierer «spiser-meg» -signal og slipp cellular kalsium [26]. Som vist på fig.
