Abstract
Immunterapi basert på natural killer (NK) celle infusjoner er en potensiell adjuvant behandling for mange kreftformer. En slik terapeutisk anvendelse i mennesker krever et stort antall funksjonelle NK-celler som har blitt valgt og utvides ved hjelp av klasse protokoller kliniske. Vi etablerte en ekstremt effektiv cytokin-baserte kultur system for
ex vivo
utvidelse av NK-celler fra blodkreft stamceller og stamceller fra navlestrengsblod (UCB). Systematisk forbedring av denne to-trinns system som bruker en ny klasse klinisk medium resulterte i en terapeutisk anvendbar cellekultur-protokollen. CD56
+ CD3
– NK celleprodukter kan bli rutinemessig generert fra ferske valgt CD34
+ UCB celler med en gjennomsnittlig utvidelse av 15 000 ganger og en nesten 100% renhet. Dessuten har vår protokoll kapasitet til å produsere mer enn 3-log NK-celle utvidelse fra frosset CD34
+ UCB celler. Disse
ex vivo
dannede celleprodukter inneholder NK celle undergrupper forskjellig uttrykker NKG2A og spekk immunoglobulin-lignende reseptorer. Videre UCB-avledede CD56
+ NK-celler generert ved vår protokoll jevnt uttrykker høye nivåer av aktivering av NKG2D og naturlig cytotoksisitets-reseptorer. Funksjonell analyse viste at disse
ex vivo
dannede NK-celler effektivt målrette myelogen leukemi og melanoma tumorcellelinjer, og formidle cytolyse av primære leukemiceller ved lave NK-målet forholdstall. Vår kultur system eksemplifiserer et stort gjennombrudd i å produsere rene NK celleprodukter fra et begrenset antall CD34
+ celler for kreft immunterapi
Citation. Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, Preijers F, van der Meer A, Joosten I, et al. (2010) High Logg stilt utbygging av funksjonelle menneskelige naturlige drepeceller fra navlestrengsblod CD34-positive celler for adoptivbarn Cancer Immunterapi. PLoS ONE 5 (2): e9221. doi: 10,1371 /journal.pone.0009221
Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg
mottatt: 16 oktober 2009; Godkjent: 21 januar 2010; Publisert: 15 februar 2010
Copyright: © 2010 Spanholtz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Radboud University Nijmegen Medical Centre og Glycostem Therapeutics. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Arbeidet er knyttet til GBGM® medium for ex-vivo generasjon av NK-celler, som er et kommersielt tilgjengelig cellekulturmedium som tidligere er utviklet av Glycostem Therapeutics. Kjøp og /eller bruk av GBGM® medium er ikke begrenset av patentrettigheter. Glycostem Therapeutics har fungert som sponsor i en del av denne forskningen. Forfattere Spanholtz og Tordoir er ansatte i Glycostem, vitenskapelig regissert av Dolstra. Kompensasjon for Dolstra engasjement i dette prosjektet er betalt av Glycostem til den samlede forskningsbudsjett på RUNMC. RUNMC og Glycostem samarbeide på grunnlag av en avtale om forskningssamarbeid som regulerer de ovennevnte interesser. Verken Dolstra eller RUNMC har en økonomisk interesse i Glycostem. Alle forfatterne bekrefte at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfattere. Forfatterne er enige om å gjøre fritt tilgjengelig materiale og informasjon knyttet til deres publikasjon som med rimelighet kreves av andre i den hensikt faglige, ikke-kommersiell forskning.
Innledning
Natural Killer (NK) celler er CD56
+ CD3
– store granulære lymfocytter som utøver medfødt immunitet mot virusinfeksjoner og kreft [1]. NK-celler gjenkjenner og deretter reagere på virus-infiserte og transformerte celler uten forutgående immunisering, i hovedsak gjennom resten av signaler fra inhibitoriske og aktiverende reseptorer [2]. Derfor har NK-celler er tidligere beskrevet som lovende effektorer for adoptiv immunterapi mot kreft [3]. Anti-tumor potensialet til NK-celler er blitt best til uttrykk ved behandling av leukemi pasienter med allogen stamcelletransplantasjon (SCT). Ruggeri et al. viste at NK-celle alloreactivity kan kontrollere tilbakefall av akutt myelogen leukemi (AML) uten å forårsake graft-versus-host disease (GVHD) i innstillingen av HLA-særpregede haploidentical allogen SCT [4]. I tillegg har haploidentical NK-celle infusjoner sammen med IL-2 i en ikke-transplantasjon omgivelser blitt assosiert med fullstendig hematologisk remisjon i dårlig prognose pasienter med AML [5]. Disse oppmuntrende resultater påpeke at allogen NK cellebasert immunterapi kan være et lovende terapeutisk strategi for AML i både ikke-transplantasjon og etter transplantasjon innstillingen [5], [6].
Til dags dato, de fleste kliniske studier som utnytter allogene NK-celler for adoptiv immunterapi er blitt utført med NK-celler valgt fra leukaferese produkter av immunomagnetiske kuler utvelgelsesprotokoller [7] – [12]. For å omgå begrensningene i celle tall, renhet og aktiveringstilstand av slike blodavledede NK-celler,
ex vivo
utvidelse av NK-celler med høyere renhet vil lette tilførsel av et større antall av aktiverte NK-celler in pasienter med en forholdsvis stor tumorbyrde eller tillater at flere NK-celle infusjoner [8], [13], [14]. Derfor, utvikling av innovative strategier som muliggjør generering av klinisk relevante NK celle produkter med høy celletall, høy renhet og funksjonalitet lover et stort gjennombrudd i NK cellebasert immunterapi.
I denne studien har vi utviklet en cytokine- basert metode for storskala utbygging av funksjonell CD56
+ NK-celler fra blodkreft stamceller og stamceller. Lignende studier har blitt utført tidligere fokus på enten CD34
+ hematopoetiske stamceller (HPC) fra benmarg (BM) eller navlestrengsblod (UCB) [15] – [17]. Men de fleste av disse kultursystemer er uegnet for klinisk anvendelse på grunn av bruken av animalske sera, animalske proteiner og støttemater-cellelinjer. Videre, de fleste av disse metodene ga bare begrenset NK celle tall for vellykket adoptiv immunterapi hos kreftpasienter. For å overvinne disse svakhetene, vi etablert en to-trinns kultur ordning der vi brukte en roman klinisk karakter medium for å generere mer enn 3-4-log fold-utvidet funksjonell CD56
+ NK-celler fra fersk valgt eller cryopreserved CD34
+ UCB celler, henholdsvis. CD56
+ NK-celleprodukter som genereres ved denne fremgangsmåte har en meget høy renhet, inneholde forskjellige NKG2A og spekk immunoglobulin-lignende reseptor (KIR) som uttrykker modne undergrupper og effektivt lyse AML og solide tumorceller. Disse funnene er eksempler på at denne kulturen systemet kunne holde store løftet for
ex vivo
generasjon av klinisk karakter NK celle produkter for celle immunterapi mot kreft.
Resultater
ex vivo
stamcelleekspansjon og NK celledifferensiering
Formålet med denne studien var å utvikle en effektiv cytokin-baserte
ex vivo
kultur system for utvidelse av CD34
+ -celler etterfulgt av den påfølgende log-skala produksjon av CD56
+ CD3
– NK-celler. For å identifisere et egnet medium for klinisk relevant ekspansjon og differensiering av NK-celler, vi testet forskjellige basale medier med en to-trinns
in vitro
differensiering ordning (figur 1). I utgangspunktet sammenlignet vi medie H3000, Stemline jeg og Stemline II seeding 1 × 10
4 CD34
+ celler ved hjelp av metode I. Vi oppdaget en sterk økning i CD34
+ celletall i alle tre medier, noe som resulterer i et midlere ekspansjonsrate for alle eksperimenter (n = 15) av 48 ± 7 fold og 78 ± 27 ganger etter 1 og 2 ukers kultur, henholdsvis. Det totale celle Utvidelsen ble forbundet med en gradvis nedgang i hyppigheten av CD34
+ -celler fra 84% ± 16% ved dag 0 til 47% ± 14% ved uke 1 og 17% ± 9% ved uke 2 (figur S1A og S1b).
i Metode i-III forskjellige kombinasjoner av cytokiner ble testet som beskrevet i detalj i materialer og metoder som starter med forskjellige antall opprinnelig sådd CD34
+ -celler. I fremgangsmåte I og II, ble NK-celler generert fra ferskt utvalgte UCB donorer og kulturen varighet var 5 uker. I Metode III, CD34
+ celler ble brukt fra cryopreserved UCB givere og kulturen perioden var 6 uker. Endelig viser diagrammet som NK produkter ble brukt og vist som resulterer i tall og supplerende materiale.
Deretter undersøkte vi om det utvidede UCB-avledet CD34
+ celler var i stand til å differensiere i CD56
+ NK-celler. Differensieringen trinn ble fulgt ved analyse av celleoverflatemolekylene CD34, CD117, CD56, CD94 og CD161, som er blitt beskrevet å være uttrykt på forskjellige humane NK-celleutviklingsstadier
in vivo product: [18]. Vi har observert etter 3 uker totale kultur varighet at prosentandelen av CD34
+ -celler lenger falt, mens CD56
+ CD161
+ CD94
+ NK-cellepopulasjonen økte til 10-18% (for eksempel figur 2a). Deretter befolkningen i CD56
+ CD161
+ CD94
+ celler raskt økt til 60-77% etter 4 uker og 80-96% etter 5 uker med kultur (f.eks figur 2a).
CD34-anrikede UCB celler ble ekspandert i to uker ved å bruke tre forskjellige medier (H3000, Stemline i og Stemline II) og deretter differensiert til NK-celler for ytterligere tre uker i samme basalmedium ved bruk av Metode i (se figur 1). Cellekulturer ble ukentlig analysert for celle tall og fenotype ved hjelp av FCM. (A) representativt eksempel på antigen ekspresjon i løpet av to-trinns dyrkningsperioden ved hjelp av H3000 medium. En uke etter utbruddet av NK-celledifferensiering trinn 2 (dvs. etter 3 uker totale kultur varighet) til CD56
+ CD161
+ CD94
+ NK-celle befolkningen øker og når en høy renhet etter 3 uker med differensiering (dvs. uke 5). (B) Gjennomsnittlig CD56
+ celle frekvens i løpet av 5 ukers dyrkningsperioden for tre forskjellige medier, som er testet i parallelle eksperimenter med 3-6 UCB givere. (C) Mean total CD56
+ NK celle tall etter første såing av 1 x 10
4 CD34
+ UCB celler i løpet av 5 uker med kultur som bruker Metode I. Data representerer en teoretisk beregning basert på den faktiske utvidelse forekomst av CD56
+ celler. Totalt utbytte av CD56
+ -celler ved hver uke ble beregnet ved å multiplisere ekspansjonsrate per uke med antallet av dyrkede celler. (D) Mean fold utvidelse av totale celler etter første såing av 1 x 10
4 CD34
+ UCB celler under 5 uker kultur ved hjelp av metode I. Data representerer en teoretisk beregning basert på de faktiske utvidelses priser av totale celler .
Selv om vi ikke kunne påvise signifikante forskjeller mellom de ulike basal media, renheten av CD56
+ celle produktet dukket opp litt høyere med H3000 medium (77% ± 24%, n = 3 ) og Stemline i-medium (75% ± 21%, n = 6) sammenlignet med Stemline II medium (66% ± 17%, n = 6) (figur 2b). Videre ble en trend observert mot høyere CD56
+ celle tall med Stemline Jeg medium (område 4 × 10
6 til 1,1 × 10
8 CD56
+ celler, n = 6) etterfulgt av H3000 (5,2 × 10
6-5.4 × 10
7 CD56
+ celler, n = 3) og Stemline II medium (område 1 × 10
6-2 × 10
7 CD56
+ celler; n = 6) (figur 2c). Gjennomsnittlig total celle ekspansjon etter 5 uker med kultur med Stemline jeg medium var ~4,400 ganger og med H3000 medium ~3,200 ganger, men bare ~850-fold utvidelse med Stemline II (figur 2d). Disse resultatene indikerer at dyrkningsforholdene støtte en effektiv utvekst av CD56
+ NK-celler med en høy renhet av det endelige produkt NK-celle etter en dyrkningsperiode på 5 uker ved hjelp av ulike basalmedier.
Superior Utvidelse av ekstremt Pure NK celle produkter ble oppnådd ved hjelp av en Novel Clinical Grade Medium
Selv om høye ekspansjons priser og renhet kan oppnås med dagens kommersielt tilgjengelig basal media, vi ikke var fornøyd med renheten av CD56
+ NK celle produkt etter 5 ukers kultur ved bruk av Metode i (figur 1). For ytterligere å øke effektiviteten av vår dyrkningsmetode, testet vi en nylig formulert serumfritt medium, betegnet Glycostem Basal vekstmedium (GBGM®), som er fremstilt under GMP-betingelser og egnet for kliniske anvendelser. I tillegg har vi noe justert cytokin forholdene under ekspansjonstrinnet, siden vi observert at utvidelsen av CD34
+ celler samt celler totalt var mest fremtredende i løpet av den første uken av kultur (figur S1 A og S1c). Videre, for å øke balansen mot utvidelse av NK celle progenitors vi lagt IL-15 i stedet for TPO til utvidelse medium fra dag 9 av kultur, og utelatt Flt3L i differensiering medium (figur 1). Ved hjelp av denne modifiserte metode II, kultur i GBGM® resulterte i det høyeste totale celle ekspansjon i løpet av den første uken og påfølgende differensiering til CD56
+ NK-celler (Figur 3 og Figur S1E). Det totale celleekspansjonstakt i GBGM® øket til 15 000 ganger (range 16,991-73,666; n = 3) (figur 3a). Enda viktigere,
ex vivo
generering av CD56
+ NK-celler i GBGM® ga en signifikant høyere renhet på 99% ± 1% (n = 3) i forhold til H3000 med 88% ± 3% (n = 3; p 0,05) og Stemline I med 63% ± 24% (n = 3; p 0,05), henholdsvis (figur 3b). Disse dataene viser at oppfinnelses endret kulturen systemet med de nylig formulerte GBGM® middels resultater i mer enn fire-log utvidelse av rene menneskelige NK-celler fra ferske valgt CD34
+ UCB celler.
Den nye GBGM® medium ble sammenlignet med to tidligere testede medier i NK-cellegenereringssystemet i henhold til metode II (se figur 1). Cellekulturer ble ukentlig analysert for celle tall og fenotype ved hjelp av FCM. (A) Brett utvidelse av totale celler etter første såing av 1 x 10
4 CD34
+ UCB celler ble bestemt i løpet av 5 uker med kultur. Data representerer beregningen basert på de faktiske utvidelses priser av totale celler og vises som gjennomsnitt ± SD av tre ulike eksperimenter. (B) CD56
+ celle frekvens i løpet av den differensieringstrinnet for tre forskjellige medier, som er testet i parallelle forsøk ved hjelp av tre UCB givere. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD. * Representerer en p-verdi på 0,05
Fenotypisk Profilen til CD56
+ NK celler avledet fra Utvidede CD34
+ Cells
flowcytometrisk analyse viste at.
ex vivo
dannede NK-celler etter 5 ukers kultur inneholdt en homogen cellepopulasjon som viser høy ekspresjon av CD56 i fravær av CD3 (figur 4a). vises NK cellepopulasjon uttrykk for CD94, mens bare en begrenset gruppe var positive for CD16 – En høy frekvens av denne CD56
+ CD3
. Videre NK celle produkter vises homogen og relativt høy uttrykk for NKG2D og de naturlige cytotoksiske reseptorer (NCR) NKp30, NKp44 og NKp46, mens NKG2A ble mer forskjellig uttrykt (figur 4b og figur S2A). I tillegg til disse funnene vi har oppdaget høy uttrykk for 2B4 (CD244) og NKR-P1 (CD161) som typiske NK celle reseptorer, mens NKG2C og NKp80 var fraværende eller uttrykt ved relativt lave nivåer. I tillegg observerte vi høy ekspresjon av MHC klasse I (HLA-ABC) og cytokin-reseptor-kjeder for IL-2 og IL-15 (CD122, IL-2 /IL-15Rβ) og SCF (CD117, c-kit-R) , som er viktig for NK celledifferensiering, utvidelse og aktivisering.
(a) Flowcytometrisk analyse av en representant NK celle produkt generert fra CD34
+ UCB stamceller. Cellene ved 5 ukers kultur ble analysert for ekspresjon av CD56, CD3, CD94 og CD16. (B) Uttrykk for et repertoar av reseptorer som er viktige for å regulere NK celle aktivitet, inkludert C-type lectin reseptorer, naturlig cytotoksisitetstester reseptorer og cytokin reseptorer. Histogrammene viser ekspresjon av antigenet av interesse (sort histogram) sammenlignet med den spesifikke isotypekontroll (grå histogram). (C) Kjøp av KIR
+ NK celle undergrupper under
ex vivo
NK celle generasjon fra utvidet CD34
+ UCB celler. KIR ble bestemt i uke 4 og 5 i løpet av differensiering steg for FCM.
KIR repertoar analyse viste betydelige individuelle forskjeller i hyppigheten av KIR-uttrykke NK celle undergrupper mellom ulike UCB givere. KIR
+ NK celle undergrupper kan allerede bli oppdaget i uke 4 av kultur og holdt seg relativt stabil fram til slutten av kulturen periode i uke 5 (Figur 4c og Figur S2B). Mens noen CD56
+ NK celle produkter inneholdt positive celler for alle fire KIR fenotyper analysert (figur 4C), andre spesifikt manglet KIR2DL1 /DS1
+ undergruppe (figur S2B). Generelt er KIR2DL2 /DL3 /DS2
+ undergruppe var til stede i en høyere andel i alle NK celleprodukter analysert så langt, noe som er i samsvar med tidligere observasjoner at utvinning av KIR2DL2 /DL3 /DS2
+ NK-celler er raskere sammenlignet med KIR2DL1 /DS1
+ undergruppe følgende HSCT [19].
samlet utgjør disse resultatene viser at UCB-avledet NK-celler generert med vår optimalisert kultur system inneholde utviklingshemmede modne NK cellepopulasjon som uttrykker NKG2A , KIR og ulike aktiverende reseptorer.
Ex vivo
dannede CD56
+ KIR
+ og CD56
+ NKG2A
+ NK-celler er funksjonelt regulert av MHC klasse i Expression
Fenotypisk analyse viste at vår
ex vivo
dannede NK celle produkter inneholdt opp til 10% CD56
+ KIR
+ celler og en høy andel (40 -60%) CD56
+ NKG2A
+ celler. For å bestemme cytolytisk aktivitet av disse undergrupper og undersøke om denne aktivitet er regulert av de uttrykte inhibitoriske reseptorer, utførte vi CD107a-baserte degranulering analyser ved anvendelse av HLA-negative K562-celler og celler som uttrykker KG1a forholdsvis høye nivåer av HLA-ABC og -E (se tabell 1). For disse eksperimentene, brukte vi to
ex vivo
dannede NK celle produkter som inneholdt ca 15-30% CD56
+ CD107a
+ celler ved co-kultur med K562 (Figur 5 og Figur S3 ). I kontrast, celler KG1a neppe stimulert degranulering av disse NK-celleprodukter, noe som indikerer at cytolytisk aktivitet hemmes av HLA uttrykk. Tilsvarende rundt 35% av CD56
+ KIR2DL2 /DL3
+ undergruppe degranulated ved utløsning av K562, mens bare en liten prosentandel (mindre enn 5%) uttrykte CD107a følgende co-kulturen med KG1a (figur 5a og figur S3). Etter avtale med disse resultatene, degranulation ved CD56
+ KIR2DL2 /DL3
+ undergruppe kan være spesielt hemmet av K562 celler transfektert med HLA-C gruppe 1 allelet HLA-CW3, mens transfeksjon av HLA-C-gruppen 2 allelet HLA-Cw4 allele hadde ikke effekt (figur S4). Til slutt, observerte vi at også den dominerende CD56
+ NKG2A
+ undergruppe var i stand til å effektivt degranulate svar på K562 (28% CD107a
+ celler), mens degranulation mot KG1a var lav sannsynligvis på grunn av relativt høy ekspresjon av HLA-E-molekyler (figur 5B og tabell 1). Disse data viser at KIR
+ og NKG2A
+ undergrupper innenfor UCB-avledet NK celle produkter er fullt responsive formidling sterk degranulating aktivitet, som er regulert av uttrykk av MHC klasse I molekyler på de engasjert målcellene.
Ex vivo
dannede NK-celler ved hjelp av Metode II med GBGM ble inkubert alene, eller 18 timer med MHC klasse i-negative K562 eller MHC klasse i-uttrykke KG1a celler på en E:T forhold på 01:01. Cellene ble så farget for CD56, CD3, KIR eller NKG2A, og degranulering antigen CD107a. (A) degranulering av total CD56
+ CD3
– NK-celler og KIR2DL2 /DL3
+ NK celle undergruppe utvidet i 5 uker fra CD34
+ UCB celler. Tetthet tomter er inngjerdet på CD56
+ CD3
– NK-celler og histogram tomter vise CD107a degranulation av KIR2DL2 /DL3
+ NK-celler. (B) degranulering av total CD56
+ CD3
– NK-celler og NKG2A
+ NK celle undergruppe utvidet til 6 uker fra CD34
+ UCB celler. Tetthet tomter er inngjerdet på CD56
+ CD3
-. NK-celler og histogram tomter vise CD107a degranulation av NKG2A
+ NK-celler
ex vivo
dannede NK-celler effektivt Target leukemi og Solid tumorceller
for å bestemme den cytotoksiske potensialet i
ex vivo
dannede NK celle produkter, utførte vi flowcytometri-baserte cytotoksisitet analyser ved hjelp av ulike myelogen leukemi cellelinjer (K562, Lama, Kasumi og KG1a), primær AML celler og to melanom cellelinjer (BLM og FM3).
Ex vivo
dannede NK-celler i GBGM® medierte effektiv lyse av K562 celler (~40% og ~90% etter 4 og 24 timer, henholdsvis) til en svært lav E:T forhold på 02:01 ( Figur 6a). Videre kan lysis dyp observeres mot MHC klasse I-uttrykkende celler KG1a (~ 20% og ~40% etter 4 og 24 timer, henholdsvis). Det er interessant NK-celler dyrket i GBGM® viste høyere cytotoksisk og degranulating aktivitet sammenlignet med NK-celler dyrket i medium H3000 fra den samme donor UCB (figur S5a-c). Videre fant vi at GBGM-avledet NK-celler viste høyere uttrykk av de aktiverende reseptorer NKG2D, NKp30, NKp44 og NKp46 (figur S5d).
(a) Spesifikk cytotoksisitet av en CD56
+ NK celle produkt (98% renhet) mot myelogen leukemi cellelinjer K562 og KG1a. Spesifikk lysis ble bestemt etter 4 og 24 timer etter ko-kultur i et FCM-baserte assay cytotoksisitet mot en E:T forhold på 02:01. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner. (B) degranulering av CD56
+ NK-celler ble bestemt ved FCM som prosentandelen av CD107a
+ -celler. Resultatene er angitt som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner. (C) IFNy-produksjon ble bestemt ved hjelp av ELISA og er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate målinger. (D) Spesifikk cytotoksisitet av en annen CD56
+ NK celle produkt (95% renhet) mot myelogen leukemi cellelinjer K562, Lama, Kasumi og KG1a, og melanom cellelinjer BLM og FM3. Spesifikk lysis ble bestemt etter 18 timer med ko-kultur i et FCM-baserte assay cytotoksisitet mot en E:T forhold på 01:01. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver. (E) degranulering av CD56
+ NK-celler ble bestemt ved FCM som prosentandelen av CD107a
+ celler etter stimulering over natten med forskjellige mål. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver. (F) IFNy-produksjon ble bestemt ved hjelp av ELISA og er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate målinger. (G) Spesifikk cytotoksisitet av en tredje CD56
+ NK-celle produkt (97% renhet) mot primær AML-celler fra 5 forskjellige pasienter. Spesifikk lysis ble bestemt etter 24, 48 og 72 timer etter ko-kultur i et FCM-baserte assay cytotoksisitet mot en E:T forhold på 03:01. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver.
I tillegg til effektiv lysering av K562, også leukemicellelinjer Lamas og Kasumi samt BLM og FM3 melanom-celler ble lysert effektivt ved NK-celler (figur 6d). Interessant, et monolag av FM3 melanomceller ble fullstendig ødelagt i løpet av en time av co-kultur med NK-celler (Movie S1). Høy NK-celle-mediert cytolytisk aktivitet mot leukemi og melanoma cellelinjer var assosiert med en høy andel av CD107a
+ NK-celler (Figur 6b og 6e) og betydelig produksjon av IFNy (figur 6c og 6f).
til slutt undersøkte vi om primærleukemicellene er utsatt for drap av
ex vivo
dannede NK-celler. Derfor utførte vi cytotoksisitetsassayer med AML celler fra fem forskjellige pasienter. Primære AML celler fra tre pasienter (Pt 2, 4 og 5) ble vesentlig drept innen 3 dager etter co-kultur på en lav E:T forhold på 03:01 riktignok mindre potent enn K562 celler (figur 6 g). Disse resultatene indikerer at UCB-avledet NK-celler generert ved vår effektive dyrkningsmetode som har evnen til å drepe myeloid leukemi og faste tumorceller.
Ex vivo
Generation of NK-celleprodukter fra frosne CD34
+ UCB Cells
for å undersøke om vår NK celle ekspansjon protokollen kan tilpasses en klinisk relevant prosedyre, har vi utført eksperimenter med GBGM® medium der vi utelatt LIF og MIP-1α i lav- dose cytokin blanding fordi disse cytokinene er ikke tilgjengelige kliniske klasse. Videre har vi utført disse eksperimenter med CD34
+ celler valgt fra tint UCB henhold til metode III avbildet i figur 1. Tining og CD34
+ celle utvalg resulterte i å skaffe 1.30 ± 0.61 × 10
6 (range 0,84 -2,50 × 10
6) CD34
+ UCB celler fra seks givere (tabell 2).
Ex vivo
generering ved bruk av Metode III resulterte i en beregnet NK-celle utbytte på 4,6 ± 2,4 x 10
9 (område 1,9 til 7,8 x 10
9) NK-celler med en renhet på mer enn 95 % etter 6 uker med kultur (tabell 2). Utvidelsen hastigheten varierte mellom 1500 og 6500 ganger starter med CD34
+ celler fra cryopreserved UCB. Disse data viser at overføringen av våre beskrevet prosedyre for klinisk relevante forhold er gjennomførbart, og genererer rene NK celle produkter med mer enn 3-log utvidelsespotensial.
Diskusjoner
Her rapporterer vi en ny og svært potent to-trinns dyrkingsmetoden for
ex vivo
generasjon av funksjonelle NK-celler for klinisk anvendelse i behandling av pasienter med AML og andre kreftformer. Vi gjennomførte en ny klinisk klasse basal medium, betegnet GBGM®, noe som letter effektive
ex vivo
HPC og NK celle utvidelser. Vår metode muliggjør generering av funksjonelle humane NK-celler flere enn 4-logger fra CD34
+ celler beriket fra ferskt innsamlede UCB enheter og mer enn tre-log fra fryst UCB. Så langt vi kjenner til, er dette den første demonstrasjonen at menneskelig CD56
+ NK-celler kan effektivt generert
ex vivo
så høy log-skala magnitude.
Lignende studier har blitt rapportert tidligere å bruke forskjellige kombinasjoner av cytokiner med eller uten matecellelinjer og bruk av animalske og humane sera [15] – [17], [20] – [24]. For eksempel, en fersk studie av Kao et al. viste at serum-frie ekspanderte CD34
+ celler kan bli differensiert i et NK-celle produkt med en gjennomsnittlig renhet på 40% -60% etter 5-7 uker med kultur. De nådde en beregnet midlere ekspansjonsrate av 300-fold, men brukte føtalt bovint serum i løpet av NK-cellegenerering fase [16]. Sammenlignet med disse nylig publiserte data, har vår nye kultursystem store løftet, noe som resulterer i mer enn tre-log-skala
ex vivo
generasjon av NK celle produkter med nesten 100% renhet ved hjelp av klinisk karakter medium, human serum, og cytokiner. De eneste cytokiner som i dag eller i nær fremtid ikke er tilgjengelig som kliniske karakteren reagenser er LIF og MIP-1α, som er en del av lavdose støtte cytokin cocktail. Imidlertid eksperimenter med CD34
+ utvalgte celler fra kryopreservert UCB avslørte at disse to faktorene kan kastes uten tap av NK-celledifferensiering potensialet i vår raffinert protokoll (tabell 2). Tar høy utvidelsespotensial, tillater systemet generering av et gjennomsnittlig antall på 4,6 × 10
9 høyrene NK-celler fra frossen CD34
+ UCB celler (tabell 2). Videre preliminære oppskalerings eksperimenter i cellekultur poser viste at den etablerte kulturen prosedyre genererer opp til 2 x 10
9 NK-celler med den samme fenotype og funksjon som vist for NK-cellepopulasjoner som genereres i vevskulturplater (data ikke vist) . Disse funnene tyder på at vår raffinert
ex vivo
utvidelse protokollen har potensial til å produsere flere NK-celler (dvs. 2 × 10
9 med en renhet mellom 95-99%) i forhold til rensing av moden NK-celler fra en 15 liters lymphapheresis fremgangsmåte, noe som gir 0,25 x 10
9 ± 0,14 x 10
9 (range 0,01 til 0,47 x 10
9) NK-celler i henhold til de publiserte data for McKenna et al. i 2007 [7] – [12]
NK celle produkt generert av vår metode vises reproduserbart en aktivert fenotype med et høyt uttrykk av CD56 og ulike aktiverende reseptorer, som NKG2D, NKp30, NKp44 og NKp46.. I samsvar med tidligere observasjoner, vår
ex vivo
dannede NK-celler dyrket i nærvær av IL-2 og IL-15 viste et CD56
lyse fenotype hvorav bare en undergruppe uttrykte CD16 [20], [21], [25], [26]. De resulterende NK-celleprodukter inneholdt 40-60% CD56
+ NKG2A
+ NK-celler og opp til 10% av CD56
+ populasjonen uttrykt forskjellige kirs, men det var betydelige forskjeller i frekvens av KIR
+ NK-celleundergrupper mellom de forskjellige UCB givere. Ifølge NK celledifferensiering modell av Freud og Caligiuri, vår
ex vivo
dannede NK celle produkter hovedsakelig inneholde utviklingshemmede modne NK-celler uttrykker høy CD94 /NKG2A, CD117 og /eller KIR formidler potent cytolytisk aktivitet mot K562 celler [27]. Et mindretall av CD56
+ NK-celler i våre produkter er fenotypisk umoden mangler NKG2A og KIR. Men disse umodne NK-celler har potensial til å maturate
in vivo
etter adoptiv overføring. Interessant, Cooley et al. har vist at CD56
+ NKG2A
-KIR
– NK-celler er i stand til å modne
in vitro
på kultur med IL-15 og en stromal mater cellelinje [28]. Fenotypeanalyser har avdekket at UCB-avledet NK-celler generert med vår protokoll visning uttrykk for cytokinreseptorer inkludert IL-2 /IL-15Rβ (CD122), som kan fremme
in vivo
overlevelse, vekst og modning ved overføring følgende immunsuppressiv behandling.
den sterke cytotoksiske aktivitet av de UCB-avledet NK-celler, mot forskjellige tumorcellelinjer, så vel som den cytolyse av primære AML-celler ble vist av spesifikk lysis, CD107a-formidlet degranulering og produksjon av IFNy. De fleste forsøk ble utført med AML-cellelinjer og primære AML-celler, som har vist seg å være et attraktivt mål for NK-celle-mediert immunterapi [5], [6]. Interessant, vi også observert effektiv lyse av melanomcellelinjer, noe som styrker det terapeutiske potensialet i vår NK-celler produktet også mot ikke-hematologisk kreft. I det siste har flere studier vist at NK-celle-mediert cytotoksisitet, og bruk av NK-celle-basert immunterapi kan være en effektiv metode for behandling av melanom, som også ble vist i et fase I forsøk ved bruk av cellelinjen NK-92 [ ,,,0],29] – [31]
i konklusjonen, den metoden som presenteres her gir et viktig fremskritt for å generere klinisk relevante NK celleprodukter fra blodkreft stamceller og stamceller med høy celletall, høy renhet og funksjonalitet for bruk i NK. celle-baserte immunterapi.
