Abstract
De LNCaP og C4-2B cellelinjer danner et utmerket preklinisk modell for å studere utviklingen av metastatisk kastrering-resistente prostatakreft, ettersom C4-2B celler ble avledet fra en benmetastase som vokste i nakne mus etter inokulering med LNCaP-avledede, kastrerings-resistente c4-2-celler. Exome sekvense detektert 2188 og 3840 mutasjoner i LNCaP og C4-2B celler, henholdsvis, hvorav 1784 ble funnet i begge cellelinjer. Overraskende, foreldre LNCaP cellene har over 400 mutasjoner som ikke ble funnet i C4-2B genomet. Mer enn halvparten av mutasjonene funnet i exomes ble bekreftet ved å analysere RNA-seq data, og vi har observert at de uttrykte gener er mer utsatt for mutasjoner enn ikke-uttrykte gener. De transcriptomes også avdekket at 457 gener viser økt uttrykk og 246 gener viser redusert uttrykk i C4-2B forhold til LNCaP celler. Ved å kombinere listen over C4-2B spesifikke mutasjoner med listen over differensielt uttrykte gener, vi har oppdaget viktige endringer i det sentrale vedheft og ECM-reseptor interaksjon trasé. Integrasjon av disse banene konvergerer på myosin lettkjede-kinase-genet (MLCK) som kan bidra til den metastatisk potensial på C4-2B celler. I konklusjonen, gir vi omfattende databaser for muterte gener og differensielt uttrykte gener i LNCaP og C4-2B prostatakreftcellelinjer. Disse kan være nyttig for andre forskere som bruker disse cellemodeller
Citation. Spenner L, Helsen C, Clinckemalie L, Van den Broeck T, Prekovic S, Joniau S, et al. (2014) Comparative Genomisk og Transcriptomic Analyser av LNCaP og C4-2B prostatakreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10,1371 /journal.pone.0090002
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 9. desember 2013, Godkjent: 24 januar 2014; Publisert: 28 februar 2014
Copyright: © 2014 spenn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet var mulig takket være forskningsmidler fra FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), fra den belgiske føderale regjeringen (Nasjonal kreftplan KPC_29_023) og fra KU Leuven (OT /11/081). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert kreft og tredje største dødsårsaken blant menn i Europa [1]. Til tross for sin utbredelse, er et flertall av menn diagnostisert med lokaliserte, lav-risiko PCa og aldri ville dø på grunn av deres kreft når venstre ubehandlet [2]. Men pasienter med høy risiko og spesielt metastatisk sykdom har en mye høyere risiko for å dø av PCa med rapporterte PCa spesifikk dødelighet opp til 28,8% for høy risiko sykdom og 66,1% for metastatisk sykdom ved 10-års oppfølging [ ,,,0],3]. Nyere epidemiologiske data har vist at nesten 10% av alle PCA pasienter er metastatisk ved diagnosetidspunktet, noe som understreker den kliniske betydningen av å utvikle en bedre innsikt i de underliggende mekanismene for metastatisk PCa [4]. De genomiske og transcriptomic endringene som følger transformasjon av lokalisert sykdom til metastatisk kastrering-resistente PCa blir oppdaget, men blir hindret av vanskeligheter med å skaffe biopsier fra de ulike stadier av sykdommen [5], [6].
som et alternativ cellelinjer kan anvendes som modeller for å studere overgangen til metastatisk kastrering-resistente PCa [7]. En av de best undersøkte PCA cellelinjer uten tvil er den LNCaP-cellelinjen. Denne cellelinjen var avledet fra en nål biopsi tatt fra venstre supraclavicularis lymfeknute fra en 50 år gammel kaukasisk mann [8]. Denne pasienten led av en raskt fremover PCa med minimal og kortfattet svar på hormonbehandling og ingen respons på kjemoterapi. Deretter ble c4-2 sublinje avledet fra en tumor som utviklet seg hos kastrerte nakne mus injisert med LNCaP-celler. Til slutt ble C4-2B cellelinje avledet fra en benmetastase etter ortotopisk transplantasjon av c4-2-celler i nakne mus [9], [10]. Med andre ord, er C4-2B en metastatisk derivat av LNCaP-celler. Den LNCaP og C4-2B progresjon modellligner derfor sykdomsfremmarsj fra dårlig tumorigent, androgen-sensitive og ikke-metastatisk i LNCaP, til metastatisk og androgen-insensitive (eller kastrering-resistent) i C4-2B.
for disse to cellelinjene, endringer i Karyotype og genomisk kopiantall, enkelte punktmutasjoner, insersjoner og delesjoner er blitt beskrevet, men sammenligning av exome sekvenser er ikke blitt rapportert ennå [9], [11]. Det første målet med denne studien var derfor å skaffe omfattende exome data for LNCaP og C4-2B celler. Selvfølgelig, en sammenligning av disse mutasjons landskapene gir bare mening i nærvær av informasjon om aktiviteten til de berørte gener. Sistnevnte ble hentet fra transkriptomet analyser.
Et første skritt for å katalogisere punktmutasjoner, innsettinger og slettinger i LNCaP cellene ble rapportert i spenn
et al.
[12]. Her rapporterer vi på en komparativ hel exome og transkriptom sekvense studie av både LNCaP og C4-2B cellelinjer. Så vidt vi vet, er dette den første direkte og grundig sammenligning av denne typen. Videre kan disse databasene være veldig lærerikt for prekliniske studier der både LNCaP og C4-2B celler blir brukt. De kan også brukes til å generere hypoteser om den metastatiske prosess, som er eksemplifisert for MLCK veien.
Materialer og metoder
DNA
LNCaP-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection, mens C4-2B cellene var en slags gave fra Dr. M. Stallcup (Norris Comprehensive Cancer Center, University of Southern California, USA) [9]. Begge cellelinjer ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI, Gibco, Invitrogen), som inneholdt 2 g /l glukose supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS). Passasjen antallet av LNCaP og C4-2B celler var henholdsvis 48 og 42. Med høy molekylvekt-DNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp av GenElute pattedyr Genomisk DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich). Etter rensing ved hjelp av etanol utfelling med ammonium acetat, ble konsentrasjonen kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific) og BioAnalyzer (Agilent).
Hele exome sekvense
Hel-exome fangst av LNCaP celler ble utført ved hjelp av atVelg Menneskelig All Exon System (Agilent) i henhold til produsentens instruksjoner. Sammenkoblet utgang var 100 bp lang sekvense leser generert ved hjelp av GAIIx sequencer (Illumina). Den exome fangst av C4-2B celler ble utført ved hjelp av SeqCap EZ Exome versjon 2 kit (Roche NimbleGen) og parvise end 100 bp lang leser ble generert ved hjelp av HiSeq2000 (Illumina).
Kvalitetskontroll ble utført bruker FastQC programvare (versjon 0.10.1) (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) og Picard (versjon 1.22) (https://picard.sourceforge.net/). Sekvense leser ble justert til den menneskelige referansen genom (hg19, NCBI Bygg 37) ved hjelp av BWA, der leser ble trimmet når kvaliteten var under 15 (versjon 0.5.9) [13]. Justering filene ble behandlet videre med Genome Analysis Toolkit (GATK) før variant kall og inkludert duplikat fjerning, lokale omstilling rundt kjente indels og basen kvalitet rekalibrering (versjon 1.0.5777) [14]. Prøvene ble påført enkeltvis i GATK UnifiedGenotyper programvare. Punktmutasjoner og uttrykk data ble plottet med Circos programvaren (versjon 0.52) [15]. Sammenligning av punktmutasjoner ble utført ved hjelp Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).
RNA isolasjon
LNCaP og C4-2B celler , med passasje antall 30 og 43 henholdsvis, ble sådd ut i 6-brønns plater (1,75 millioner celler /brønn) og behandlet over natten (18 timer) med 1 nM R1881 (Perkin Eimer). Cellene ble samlet opp og vasket med PBS. Cellepelleten ble brukt til å ekstrahere total-RNA ved bruk av RNeasy Mini Kit fra Qiagen. Kvaliteten og renhet av RNA ble undersøkt på et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. Integriteten til RNA ble bekreftet på BioAnalyzer på Genomics kjernen av UZ Leuven.
RNA sekvense
Etter valget av poly A + RNA, ble RNA omdannet til cDNA bibliotek ved hjelp av TruSeq RNA Sample forberedelse kit (Illumina). Etter sekvense parvise end kort leser på 100 bp med HiSeq2000 (Illumina), ble normalisert genet teller (Fragments Per kilobase per Millioner av kartlagt leser, FPKM) beregnet via Tuxedo rørledning (Tophat – Mansjettknapper – cummerbund) [16]. Kort sagt, ble RNA-seq data justert til referansegenom ved hjelp Hat (versjon 2.0.6) som benytter Bowtie som algoritmisk kjernen. Den Mansjettknapper pakken (versjon 2.0.2) montert utskrifter og oppdaget forskjellig uttrykt gener og transkripsjoner. Cummerbund (versjon 2.0.0) ble anvendt for å visualisere genuttrykk data. Variant ringer via RNA-seq data ble utført med GATK (versjon 2.2), etter justering med Tophat [14]. RNA-seq for begge cellelinjer ble utført i tre eksemplarer, slik at identifisering av differensielt uttrykte gener. For variant ringer ble triplicates samlet for å oppnå høyere dekning. Pathway-Express ble benyttet for å bestemme, fra en liste av gener, enten i en bestemt bane flere gener som er involvert enn det som forventes ved en tilfeldighet [17].
Kvantitativ RT-PCR
cDNA ble generert fra RNA (1 mikrogram) med Random heksamerprimere og RevertAid revers transkriptase (Thermo Scientific). Kvantitativ Real Time PCR ble utført ved hjelp av Platinum SYBR Grønn QPCR Supermix-UDG (Invitrogen). Resultatene ble normalisert til husholdningsgenet β-aktin, og hver prøve ble analysert i triplikat. Sekvensen av primerne som brukes er: β-aktin fremover 5′-ACCCAAGGCCAACCG-3 «og 5′-revers TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3′, 5»-TMPRSS2 fremover CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 «og 5′-revers AGGCGAACACACCGATTCTC-3′, IGF1 fremover 5»-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 «og 5′-revers TCATCCACGATGCCTGTCT-3′, 5»-IGF1R fremover GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 «og 5′-revers TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3».
deponeringsnummer
binær sekvens justering /kart (BAM) filer fra hele exome sekvense data samt RNA-seq data ble avsatt i databasen til den europeiske nukleotid Arkiv med tiltredelse antall PRJEB4877 og er tilgjengelig via https://www.ebi.ac.uk /ENA /data /view /PRJEB4877. Prøvedeponeringsnummer er ERS363578 og ERS363580 for hele exome sekvense data av LNCaP og C4-2B hhv. For RNA-sekvensering, prøvedeponeringsnummer er ERS363579 og ERS363581 for LNCaP og C4-2B cellene hhv.
Bekreftelse av ikke-synonyme varianter
Varianter av interesse ble bekreftet av Sanger-sekvensering av forsterkede PCR-produkter. Primere som er spesifikke for den regionen som inneholder den varianten som skulle testes, ble utformet ved bruk av NCBI Primer-Blast (https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) og erholdt fra integrerte DNA-teknologi. Polymerase kjedereaksjoner ble utført ved å følge standard fremgangsmåter ved bruk av Taq-DNA-polymerase (Thermo Scientific). Amplifikasjon av spesifikke PCR-fragmenter ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Sanger-sekvensering ble utført på LGC Genomics. Sequence sporingsfilene ble analysert ved hjelp av Chromas Lite.
Resultater
Oppdager punktmutasjoner med hele exome sekvense
Vi utførte en hel-exome re-sekvense studie for både LNCaP og C4 -2b celler ved hjelp av 100 basepar, parvise end leser på Illumina plattform. Dette genererte 49 og 80 millioner leser for LNCaP og C4-2B (Tabell S1); for LNCaP-celler, ble 74% av den exome dekket i det minste 20x, sammenlignet med 88% for C4-2B celler. Sekvense egenskaper og kvalitetskontroll data er lik for begge datasett (Tabell S1 og figur S1)
De punktmutasjoner i exomes ble oppdaget ved hjelp av GATK rørledning som ekstra filtrering ble brukt. Bare mutasjoner som hadde minst 12 × dekning og en mutasjon frekvens over 30% ble tatt hensyn til. Data ble også filtrert for fravær av basepar-endring i dbSNP130. Videre ble tråden forspenningen fjernes manuelt (tabell S2). Dette resulterte i lister over 2188 og 3840 ikke-synonyme punktmutasjoner i LNCaP og C4-2B celler henholdsvis (Tabell S3-4). Bare 1784 mutasjoner var vanlig mellom begge cellelinjer, klart indikerer akkumulering av mer enn 2000 flere mutasjoner i C4-2B genomet. Denne store forskjell i mutasjonsbelastnings kan ikke forklares ved den noe lavere dekning av LNCaP exome. Mest sannsynlig har disse ekstra C4-2B mutasjoner oppstått under tumorprogresjon og bein metastasering.
Oppdager punktmutasjoner i transkriptomet sekvense
transkriptomet sekvensering ble utført i første omgang å finne ut differensial genuttrykk. RNA ble isolert fra LNCaP og C4-2B celler som hadde blitt behandlet i 18 timer med syntetisk androgen methyltrienolone. Vi fikk 157 og 131 millioner 100 basepar, leser sammen-end for LNCaP og C4-2B celler. I disse leser, prosentandelen av ribosomale, intronic og intergeniske baser var meget lav (1,6% totalt), noe som resulterer i en høy dekning av mRNA-baser (Tabell S1). Som et mål for kvaliteten av de transkriptom data, blir variasjonen i deknings langs hver transkript vist i figur S2. Dette viser ingen 5 «eller 3» skjevhet selv om det er en noe lavere dekning nær endene av transkripsjoner.
Arbeidsflyten for påvisning og påfølgende filtrering av punktmutasjoner var lik den som brukes for exome sekvense beskrevet høyere. Vi fant 1505 og 1882 mutasjoner i LNCaP og C4-2B celler henholdsvis, hvorav 1054 ble påvist i begge cellelinjer (tabell S5); 451 var spesifikke for LNCaP og 828 for C4-2B.
Sammenligning exome med transkriptomet sekvense data
En sammenligning av allel-spesifikke lese tellinger fra genom og transkriptom sekvense data av alle oppdagede punktmutasjoner kan brukes som et mål på kvalitet sekvensering. Flertallet av mutasjoner har en lignende allel frekvens i både DNA og RNA-sekvensering (figur 1 A-B). Selv de få homozygote mutasjoner med allel frekvens nær 1 i exome data, har en lignende allelfrekvenser i RNA sekvense data.
A-B. Sammenligning av varianten alleliske hyppigheten av mutasjoner som detekteres ved hjelp av hel exome og transkriptom sekvensering. Svarte prikker er mutasjoner som har blitt funnet av både exome sekvensering og transkriptom sekvensering; røde prikker ble bare oppdaget av exome sekvensering og grønne prikker bare av RNA sekvensering. For variant ringer, ble en cut-off på 30% variant allel frekvens brukt. Ved siden av grafen en figur viser antall mutasjoner fra exome sekvensering, transkriptom sekvensering og antall funnet ved begge metodene. Grafer er vist for LNCaP (A) og C4-2B-celler (B) respektivt. C. Overlapping av alle mutasjoner observert av exome og transkriptom sekvensering i LNCaP og C4-2B celler.
Kombinasjonen av både exome og transkriptom sekvense resulterte i totalt 2244 mutasjoner felles for begge cellelinjer (figur 1C). Dessuten er antallet LNCaP-spesifikke mutasjoner (546) mye lavere enn for C4-2B-spesifikke forandringer (2129), igjen indikerer at mutasjoner er akkumulert i løpet av progresjon til C4-2B. RNA-sekvensering bekreftet bare 41 og 35% av exonic variantene identifisert av hele exome sekvensering av LNCaP og C4-2B. Dette tallet steg til 52% når vi bare tok uttrykte gener i betraktning (FPKM 1). Omvendt, 60 og 71% av LNCaP og C4-2B varianter identifisert av transkriptomet sekvensehenholdsvis ble bekreftet av exome sekvensering.
nukleotidsubstitusjoner
De ulike typer av overganger og transversions i exomes og transcriptomes av LNCaP og C4-2B cellelinjer kan gi innsikt i mutasjonsprosesser som fant sted under utviklingen av disse cellene. Det ble observert at de dominerende mutasjoner (40-42%) i begge cellelinjene var G-til-A og C-i-T-overganger (figur 2).
Prosentvise mutasjoner i hver av de seks mulige mutasjon klasser er representert for exome sekvense og transkriptom sekvense data fra begge LNCaP og C4-2B celler.
den mest utbredte typen RNA redigering i høyere eukaryoter er konvertering av adenosin til inosin. Som inosine leses som en guanin etter sekvensering, manifesterer denne redigerings typen seg i RNA-sekvensering som en A-til-G substitusjon [18]. Men i våre datasett, antall A-til-G overganger i exome og transkriptomet sekvenseringsdataene sammenlignes argumenterer mot en viktig rolle for RNA-redigering (figur 2).
Validering av punktmutasjoner
i alt 80 mutasjoner i exome data fra LNCaP (47) og C4-2B (33) ble validert ved manuell Sanger re-sekvensering (figur 3). Genene som ble valgt for validering ble rangert høyt i en funksjonell prioritering av alle muterte gener i C4-2B cellelinje (beregnet som i [12]). Ni av disse mutasjoner (i PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 og KLK3) ble oppdaget av DNA og RNA sekvensering i begge cellelinjer, og disse ble bekreftet med Sanger-sekvensering på genomisk og komplementær DNA av LNCaP og C4-2B. Når vi testet sju av de C4-2B exome mutasjoner (PIAS1 P216S og K380M, MKNK2 L229M og T244N, STAT5A I85N og MYO18A A1571T og Q646 *), ble de ikke oppdaget av LNCaP exome sekvensering, men deres tilstedeværelse i LNCaP genomet var tydelig i RNA-sekvensering av data og også bekreftet av Sanger-sekvensering på genomisk og komplementær DNA.
Valideringen ble utført ved anvendelse av PCR på både genomisk DNA og kopiere-DNA, etterfulgt av konvensjonell Sanger-sekvensering. Den første og andre kolonne representerer navn av genet og aminosyre substitusjon respektivt. Den tredje, fjerde, sjuende og åttende kolonne representerer neste generasjons sekvense resultater for hele exome og transkriptom sekvensering, som deretter validert med Sanger-sekvensering i den femte, sjette, niende og tiende kolonne. A + betyr at mutasjonen ble oppdaget, en – angir at mutasjonen ikke ble oppdaget, mens 0 betyr at ingen PCR-produktet kan bli forsterket og /at denne posisjonen ikke var dekket med neste generasjons sekvense
.
Vi har også oppdaget og bekreftet C4-2B spesifikke mutasjoner i CASP9, FLNB, POLR2A og STAT5A i genomisk DNA og cDNA av C4-2B celler, men ikke i LNCaP-celler. Endelig mutasjoner i gener som ikke er uttrykt i LNCaP eller C4-2B (KIT og GRAP) kunne bare bli bekreftet på genomisk DNA.
I konklusjonen, GATK UnifiedGenotyper for variant ringer som vi kombinert med vår omfattende filtrering generert noen falske positiver. Lignende resultater ble vist nylig av Liu
et al.
Ved å sammenligne GATK med SAMtools, Atlas 2 og glftools [19]. Videre bør det bemerkes at våre valideringer indikerte at exome analyser ikke avdekke alle mutasjoner, men variasjonene som ble oppdaget mest sannsynlig er ekte mutasjoner.
Differensial genuttrykk mellom LNCaP og C4-2B celler
siden ønsket å søke etter differensielt uttrykte gener mellom de to cellelinjene, siden disse kan gi ledetråder til mekanismene bak utviklingen av LNCaP celler i C4-2B celler. Differensial uttrykk ble kalt av Tuxedo algoritme basert på RNA-seq data for tre paralleller for hver cellelinje, med ekstra filtrering av log2 ganger endring 2 og q-verdi 0,001. Alle replikater var svært like, som det kan ses i figur S3. Dessuten er den kvadrerte variasjonskoeffisient, som er et mål på normalisert kryss replikere variabilitet, under 0,05 for uttrykte gener.
Vår analyse resulterte i identifisering av 703 differensielt uttrykte gener (tabell S6), hvorav 457 gener er høyere uttrykt i C4-2B og 246 er høyere uttrykt i LNCaP celler (Figur S2). En oversikt over plasseringen av differensielt uttrykte gener over hele genomet kan bli funnet i figur 4, sammen med frekvensen for punktmutasjoner detekteres i begge cellelinjene, i C4-2B celler bare, eller i LNCaP-celler kun. Kvantitativ RT-PCR på fem forskjellig uttrykt gener bekreftet RNA-seq data (data ikke vist).
Kromosom ideograms blir vist rundt den ytre ringen og orientert Pter-qter i klokkens retning med sentromerer angitt i rødt. Den ytre ringen representerer forskjellig uttrykt gener: 457 gener med høyere uttrykk i C4-2B (røde prikker) og 246 gener med høyere uttrykk i LNCaP (blå prikker). Andre spor inneholde (fra utsiden til innsiden): 2244 mutasjoner i felles mellom LNCaP og C4-2B celler, 2129 mutasjoner spesifikke for C4-2B celler og 546 mutasjoner spesifikke for LNCaP celler vist ved tetthet per 10 megabases
.
Fu
et al.
allerede beskrevet enkelte differensielt uttrykte gener mellom LNCaP og C4-2B, men ingen av de genene de detekterte er differensielt uttrykt i våre data [20]. Vi foreslår at dyrkningsforhold og forskjeller mellom gjenkjenning plattformer mest sannsynlig forklare dette avviket. På den annen side, det er betydelig overlapping av våre datasett med andre studier som sammenlignet LNCaP og c4-2 transcriptomes [21] – [25].
Pathway analyse av genomisk og transcriptomic datasett
LnCap og C4-2B celler fortsetter å bli brukt i grunnleggende og preklinisk forskning. Vi foreslår våre databaser av mutasjoner og differensielt uttrykte gener som viktige inspirasjonskilder for ytterligere forskningsprosjekter. I tillegg kan disse databasene nå sjekkes for spesifikke mutasjoner før man begynner å bruke disse cellene til å studere noen bestemt PCa relaterte veien.
Dette avsnittet gir et eksempel på en hypotese basert på
i silico
analyse av våre data. Pathway-Express analyse av C4-2B spesifikke mutasjoner kombinert med 703 genene forskjellig uttrykt mellom LNCaP og C4-2B celler indikerte at de viktigste endringene ble funnet i ECM-reseptor interaksjon sti og i fokal heft. Begge baner konvergerer i oppregulert ekspresjon av myosin lettkjede-kinase (MLCK) genet (figur 5).
skreddere er definert som å ha en økt (rød) eller redusert (blå) ekspresjon i C4-2B sammenlignet LNCaP eller ved somatiske mutasjoner i C4-2B celler bare (fet svart linjer). Overekspresjon av myosin lett kjede kinase i C4-2B celler kan skille dem fra LNCaP celler i cellemigrasjon og fokale vedheft egenskaper.
Diskusjoner
En høy mutasjonsraten i LNCaP og C4 2B celler
C4-2B celler er hentet fra en beinmetastaser i nakne mus inokulert med celler som stammer fra de LNCaP-avledet, kastreringsresistent xenografter kalt c4-2. De er regnet som en nyttig preklinisk modell for metastatisk, kastrering-resistent og androgen reseptor positiv PCa. Her gir vi for første gang sammen kart over de punktmutasjoner oppdaget i LNCaP og C4-2B celler. I tillegg, selv transkriptomet analyser av LNCaP og c4-2 har blitt rapportert til vår kunnskap, er dette den første transkriptomet analyse av C4-2B celler.
C4-2B celler samt LNCaP celler har en overraskende høyt antall punktmutasjoner: 4373 og 2790 mutasjoner hhv. Som i primær PCa og kastreringsbestandig PCA prøver, er det mutasjons spektrum dominert av G-til-A og C-i-T-overganger [26] – [28]. Det er kjent at mismatch repair feil føre til overgang mutasjoner, særlig G-til-A og C-i-T-substitusjoner [29]. Således kan de fleste mutasjoner være forårsaket av det defekte misparringssystemet i LNCaP-celler, på grunn av den homozygote delesjon av 3′-enden av den MSH2-genet [30]. Chen
et al.
Allerede beskrevet en korrelere høy ustabilitet av satellitt DNA i LNCaP celler [31].
Antall punktmutasjoner i våre cellelinjer er mye høyere enn den gjennomsnittlige 16-33 mutasjoner påvist i hele exomes av PCA prøver [26], [32] – [34]. Disse cellelinjer er derfor atypisk, men kan anses som en modell for tilfeller av PCa hvori mismatch reparasjon er defekt som beskrevet for eksempel ved Barbieri
et al.
, Hvor en enkelt PCa svulst næret en rammeskift-mutasjon av MSH6 genet blant andre mutasjoner 996 [32]. Selvfølgelig, slike høyere mutasjon priser ville forklare enda høyere antall mutasjoner vi fant i C4-2B forhold til LNCaP. Dessverre, vil dette også tilsløre de driver mutasjoner som kan ha tillagt en overlevelsesfordel under metastatisk prosess.
Link mellom mutasjon priser og uttrykk
For både LNCaP og C4-2B cellelinje, ser vi at svært uttrykte gener oftere inneholde punktmutasjoner enn ikke-transkribert gener (p 0,0001, Chi Square test, for den høyeste versus laveste uttrykt tertile). Dette motsier den generelle koblingen mellom heterochromatin organisasjon og høyere regionale mutasjon priser i humane kreftceller [35]. Muligens, i disse cellelinjene, den åpne kromatin og koblet transkripsjon induserer flere mistilpasninger som normalt er effektivt rettet, men ikke i tilfelle av en mangelfull mismatch reparasjon.
Sammenligning av LNCaP og C4-2B mutasjoner
Vi oppdaget 1784 delte mutasjoner i exomes av LNCaP og C4-2B, og 2056 C4-2B-spesifikke endringer, noe som gir mening siden C4-2B cellene er avledet fra LNCaP cellene. Men vi har også oppdaget 404 LNCaP-spesifikke endringer, hvorav mange ble bekreftet av våre transkriptom sekvenser. Tydeligvis har de LNCaP cellene vi analysert avvek fra de LNCaP cellene som ble brukt opprinnelig å utvikle C4-2B celler [9]. Faktisk har vi vist tidligere at selv LNCaP-celler fra forskjellige laboratorier er genetisk forskjellige og mens cellene ble oppnådd fra ATCC (passasje 48), ble det C4-2B mest sannsynlig avledet fra en mye tidligere passasje av LNCaP-celler i 1994 [9] [12].
Forslag til en rolle MLCK i metastatisk prosess
Våre data kan tydelig føre til hypotesen om metastatisk prosess som fant sted under konvertering av LNCaP til C4 2B celler. Dette er eksemplifisert ved konvergens av en rekke berørte veier til en oppregulering av MLCK. Faktisk er det flere som er publisert koblinger mellom MLCK og metastatisk prosess. Diskriminant analyse av mikromatriser identifisert MLCK genet som den mest informative genet for PCA genesis prosessen [36], og hemming av MLCK i rotte PCA cellene resulterer i reduksjon av invasivitet, som var hovedsakelig på grunn av nedsatt cellular motilitet [37]. Hemme MLCK i fibrosarkom, bukspyttkjertelkreft og brystkreft celler fører også til redusert vedheft, migrasjon og invasjon og økt apoptose [38] – [41]. Omvendt fører aktivering MLCK til en økning i invasjon i brystkreftceller og en øket metastatiske potensiale i ikke-småcellet lungekreft [42], [43]. Differensial uttrykk for MLCK genet i de to cellelinjene undersøkt her kan derfor korrelerer med høyere metastatisk kapasitet C4-2B cellene.
Konklusjon
I konklusjonen, våre data viser tydelig at det er store forskjeller i antall og fordeling av mutasjoner og genuttrykk mellom LNCaP og C4-2B celler. Siden disse cellelinjene er universelt brukt for å studere utviklingen fra ikke-metastatisk til metastatisk PCa Disse data er avgjørende for forskere å tolke resultatene ved bruk av disse cellelinjene. Videre vil våre databaser være svært nyttig i å utvikle nye investigational ideer.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
FastQC kvalitetskontroll resultatene av per base kvaliteter. Output resultatene av FastQC kvalitetskontroll (versjon 0.10.1) Her vises for exome og transkriptom sekvensering av LNCaP og C4-2B celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Normalisert dekning av posisjon. Den gjennomsnittlige relative dekningen er vist ved hver relative posisjon langs transkripsjon lengde. LNCaP er vist i grønt, mens C4-2B er vist i rødt. X-aksen representerer den genet lengde normalisert til 100%, hvor 0 er den 5 «ende av hvert transkript og 100 er den 3» ende
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s002 plakater (TIF )
Figur S3.
Heatmap av 703 differensielt uttrykte gener. Heatmap viser de tre replikater av hver cellelinje, som er svært like. Alle differensielt uttrykte gener ble påvist ved hjelp av Tuxedo algoritmen, med q 0,001 og log2 ganger endring 2 som cut-offs. Det er klart at flertallet av gener er oppregulert i C4-2B forhold til LNCaP, mens en mindre gruppe av gener er nedregulert i C4-2B
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s003 plakater (TIF )
Tabell S1. .
Sekvense egenskaper
doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s004 plakater (XLSX)
Tabell S2. .
Filter brukes til å identifisere punktmutasjoner i exomes av LNCaP og C4-2B celler
doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s005 plakater (XLSX)
tabell S3.
Liste over punktmutasjoner identifisert i exome av LNCaP celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s006 plakater (XLSX)
Tabell S4.
Liste over punktmutasjoner identifisert i exome av C4-2B celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s007 plakater (XLSX)
Tabell S5. .
Filter brukes til å identifisere punktmutasjoner i transcriptomes av LNCaP og C4-2B celler
doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s008 plakater (XLSX)
Tabell S6.
Liste over 703 gener som er forskjellig uttrykt mellom LNCaP og C4-2B celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090002.s009 plakater (XLSX)
Takk
Vi er svært takknemlig for å Rita Bollen og Hilde De Bruyn for deres utmerkede teknisk assistanse. Vi takker våre kolleger i Molecular Endocrinology Laboratorium for nyttige diskusjoner.
