Abstract
Selv om gemcitabin er svært aktiv i flere krefttyper, egenverdi og ervervet resistens er fortsatt en stor utfordring. Overekspresjon av Bcl-2 er blitt assosiert med gemcitabin motstand. Hensikten med denne studien er å bestemme hvorvidt gossypol kan overvinne gemcitabin motstanden i cellelinjer med høy grad av Bcl-2-ekspresjon i kombinasjon medikamentterapi. Vår undersøkelse viste at i 10 cellelinjer avledet fra forskjellige kreftformer, ble høy Bcl-2 baseline ekspresjon observert i cellelinjer som var resistente mot gemcitabin (GEM-R). Videre ble synergistiske virkning av en kombinasjonsbehandling er observert i gemcitabin-resistente (GEM-R) cellelinjer med høy Bcl-2-ekspresjon, men ikke i en gemcitabin-sensitive (GEM-S) cellelinjer uavhengig av Bcl-2-ekspresjon. Gossypol behandling resulterte i reduksjon av anti-apoptotiske gener slik som Bcl-2 og Bcl-xl og en oppregulering av de pro-apoptotiske genet, Noxa. Videre er tilsetningen av gossypol til gemcitabin resulterte i lavere uttrykk for anti-apoptotiske gener i forhold til gemcitabin alene. Genuttrykk profilering i GEM-R og GEM-S cellelinjer tyder på at anti-apoptotiske gener som Pakt og PI3KR2 kan spille viktig rolle i gemcitabin motstand, mens pro-apoptotiske Bcl-2 relaterte gener (Bad, caspase-6 og Calpain- 1) kan regulere synergistisk interaksjon i kombinasjonsbehandling
Citation. Wong FY, Liem N, Xie C, Yan FL, Wong WC, Wang L, et al. (2012) kombinasjonsbehandling med Gossypol avslører Synergi mot gemcitabin Resistance i kreftceller med høy BCL-2 Expression. PLoS ONE 7 (12): e50786. doi: 10,1371 /journal.pone.0050786
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 6 juli 2012; Godkjent: 24 oktober 2012; Publisert: 04.12.2012
Copyright: © 2012 Wong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av tilskuddet NMRC /TCR /001-NUH /2007 fra National Medical Research Council, Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
gemcitabin (2 «, 2»-difluorodeoxycytidine, dFdC) er en pyrimidin nukleosid analog deoxycytidine vanligvis brukes i bryst [1], ikke-småcellet lungekreft [2], bukspyttkjertel [3] og eggstokkreft [ ,,,0],4]. Gemcitabin kommer inn i cellen via spesifikke nukleosid transportør og gjennomgår intracellulær phospharylation til å konvertere til aktive legemiddel metabolitter. Inne i cellen, er gemcitabin fosforylert av deoksycytidin kinase som deretter innlemme i DNA for å hemme syntese og celle-proliferasjon, mens fremme apoptose i kreftceller [5]. Overekspresjon av anti-apoptotiske gener, slik som Bcl-2-familien spiller en kritisk rolle i utviser resistens mot konvensjonelle anticancer terapi [6], [7], [8]. For eksempel
Yu et al
demonstrerte en invers korrelasjon mellom BCL-2 uttrykk og kjemosensitivitet til flere legemidler inkludert adriamycin og 5-Fluorouracil i brystkreftceller. [9].
In vitro
dyrkede cellelinjer avledet fra primære HCC tumorer som uttrykker høye nivåer av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-xl ble også funnet å være resistente mot paclitaxel [10]. Oppregulering av BCL-2-familien har vært innblandet i indre gemcitabin motstand i bukspyttkjertel og lunge kreft [11], [12]. Kreft i bukspyttkjertelen celler som ervervet narkotika motstand mot gemcitabin etter kontinuerlig utsatt for gemcitabin hadde oppregulering av anti-apoptotiske gener som BCL-XL og Mcl-1 [13]. Disse funnene tyder på at forhøyet nivå av Bcl-2 familien kan spille en viktig rolle i utviklingen av gemcitabin motstand under kjemoterapi.
Gossypol er en polyfenolforbindelsen isolert fra bomullsplanten (
Gossypium Malvaceae
). Opprinnelig brukt som en mannlig fertilitetskontroll middel, ble det nylig oppdaget å ha anti-virusets tumorgene styrke egenskaper i en rekke kreftformer [14]. Gossypol eksisterer i to enantiomere former, (+) og (-), og naturlig forekommende gossypol eksisterer som en racemisk blanding av (+) og (-) enantiomerer. Det (-) enantiomeren av gossypol har blitt funnet å ha mer potent cytotoksisk effekt enn (+) enantiomer eller racemisk gossypol. Gossypol er en BH3 etterligning som hemmer funksjonen av anti-apoptotiske Bcl-2 proteiner gjennom samhandling med BH3-bindende lommer av Bcl-2 og Bcl-xl proteiner [15]. Flere in vitro-studier har rapportert at gossypol kunne hemme cellevekst i et bredt spekter av cancere inkludert tykktarmen [16], prostata [17], lunge [18] og bryst-tumorer [19]. I PC-3 prostatakreftceller, gossypol indusert apoptose ved å hemme heterodimerisering av BCL-2 /BCL-XL kompleks [17]. Induksjon av apoptose via gossypol ble også observert ved nedregulering av anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner i HT-29 colon cancer og kronisk lymfatisk leukemi [16], [20]. I tillegg har gossypol evnen til å overvinne resistens til andre konvensjonelle kjemoterapeutiske medikamenter. Gossypol har blitt vist å effektivt indusere celledød i kjemoresistent leukemicellelinjer som overuttrykker Bcl-2 og Bcl-xl [21]. Det hadde blitt rapportert at gossypol kan induserer apoptose med høy effektivitet i cisplatin fast hode og nakke kreft cellelinjer som uttrykker høye nivåer av BCL-XL. [22]. Cengiz E et al. observerte at den kombinerte behandlingen av gossypol og docetaxel kan synergi indusert apoptose i PC-tre prostatakreft cellelinje [23]. Disse studiene antydet at kombinasjonen av gossypol med andre legemidler kan effektivisere indusere apoptose i kreftterapi.
Formålet med denne studien var å (1) korrelerer BCL-2 protein uttrykk med gemcitabin motstand (PERLE R) i mage, nasofaryngeale og brystcancercellelinjer, (2) å vurdere kombinasjonen av gemcitabin og gossypol på GEM-R cancercellelinjer med høy grad av Bcl-2-ekspresjon og (3) bestemme de mekanismene som er involvert i å reversere gemcitabin motstand etter gossypol.
Materialer og metoder
cellelinjer og reagenser
nasopharyngeal kreft cellelinjer CNE1, CNE2, HONE1 ble alle hentet fra udifferensierte kinesiske NPC svulster, mens Ht1 var fra en godt differensiert Chinese NPC [24], [25]; brystkreft cellelinjer SKBR3, T47D, MCF-7 og mage kreft cellelinjer AGS ble SNU1 kjøpt fra ATCC, USA; mens YCC16 ble oppnådd fra DUKE NUS, Singapore, ble Alle cellelinjer dyrket ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 og holdt i RPMI 1640-medium (Gibco, Grand Island, NY) inneholdende 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gibco; Grand Island, NY) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco, Grand Island, NY). Mycoplasma status av celler ble rutinemessig undersøkt ved hjelp av MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, ME, USA). Mycoplasma status for alle cellelinjene ble gjennomført i denne studien var negative. Gossypol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) og gemcitabin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ble oppløst i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mM og lagret ved -20 ° C. AT-101 ble levert av Ascenta Therapeutics og forberedt som 10 mM lager med DMSO. Primære antistoffer som består av anti-caspase-6, anti-BCL-XL, anti-Bad, anti-Bak, anti-Bax, anti-Pakt, anti-PIK3R2, anti-kalpain-en og anti-Actin ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Cell Signaling, MA, USA). Primær anti-Noxa ble kjøpt fra Calbiochem (Merck, Tyskland); og anti-Bcl-2 og anti-Mcl-1 ble levert fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, California, USA). Sekundære antistoffer (anti-kanin IgG, HRP-Linked og anti-mus IgG, HRP-Linked) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Cell Signaling, MA, USA)
Cell Livskraftig og sprednings Analyser
.
for å vurdere kjemosensitivitet av tumorceller, ble celleviabilitet målt ved MTS (Colorimetric CellTiter 96 AQ
ueous en løsning Cell Proliferation Assay) (Promega, WI, USA). Cellesuspensjonen ble dyrket i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater i en konsentrasjon på 2 x 10
3 celler /per brønn og inkubert over natten. Medikamentbehandlinger ble utført som følger: gossypol (0,1 um -100 um), gemcitabin (0,001 uM-100 uM) eller en kombinasjon av begge legemidler i forskjellig konsentrasjoner. Hvert medikament ble testet i triplikat. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 i 72 timer. Mikrotiterbrønner inneholdende tumorceller med ingen medikamentell behandling ble anvendt som kontroller, og brønner inneholdende bare fullstendig medium ble anvendt som kontroller for tomme ikke-spesifikk reduksjon fargestoff. Celler ble inkubert i 72 timer før tilsetningen av MTS-løsning (1 mg /ml per brønn) og absorbansen ble avlest ved 490 nm ved anvendelse av en spektrofotometrisk mikroplateleser (Bio-Rad, CA, USA). Den prosentvise cellelevedyktigheten til forskjellige medikamentkonsentrasjoner ble beregnet som inhiberingen hastigheten (gjennomsnittlig absorbans av behandlede brønner /betyr absorbansen til kontrollbrønner) x 100%. IC
50 ble beregnet ved GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, Inc, CA, USA).
Kombinasjons Index Analyse
Samspillet mellom gemcitabin og gossypol ble analysert med Calcusyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK) som tidligere rapportert [26]. Kort fortalt ble konstant konsentrasjon forholdet mellom gemcitabin og gossypol på 0,25x, 0.5x, 1x, 2x og 4x brukes til å vurdere synergi av kombinasjonsbehandling. CI verdier ble beregnet i henhold til nivåene av veksthemming (fraksjon berørte) etter hver agent individuelt og kombinasjon av gemcitabin med gossypol. Kombinasjon indeksen ble beregnet å illustrere synergisme (CI 0,9), antagonisme (CI 1,1). Og additivt (CI = 0,9-1,1)
Statistikk MTS analyse Analyse
trinn Doserings var log-transformerte, slik at lik horisontal avstand fra datapunkter på doseresponskurven. Sporkurve ble plottet fra fit spline /LOWESS analyse av GraphPad Prism v4.0, og konsentrasjonen resulterte i 50% celledød ble bestemt fra kurven som genereres. IC
50 ble beregnet ved å antilog verdien oppnådd. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE) fra minst to uavhengige eksperimenter.
Western Blot analyse og Protein
Celler ble behandlet med legemiddel ble vasket med iskald PBS og resuspendert i lyserings buffer (CelLytic; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i nærvær av en protease-inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Lysater ble sonikert, inkubert på is i 20 min og sentrifugert ved 14000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av Bradford-analyse (Bio-Rad, CA, USA). 20 ug av proteinprøver ble elektroforetisk separert på 12% SDS-PAGE og elektrooverført til en PVDF-membran (Immun-Blot PVDF; Bio-Rad, CA, USA). Membranene ble blokkert i en time ved værelsestemperatur i 5% fettfri tørrmelk (Bio-Rad, CA, USA) og deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. De respektive primære antistoffer ble brukt som følger: anti-BCL-XL (Cell Signaling, MA, USA) ved 1:1000 fortynning, anti-Bad (Cell Signaling, MA, USA) ved 1, 1000 fortynning, anti-Bak (Cell signalering, MA, USA) 1:1000 fortynning, anti-Bax (Cell Signaling, MA, USA) 1:3000 fortynning, anti-caspase-6 (Cell Signaling, MA, USA) 1:1000 fortynning, anti-P1K3R2 (Cell signalering, MA, USA) 1:1000 fortynning, anti-Pakt (Cell Signaling, MA, USA) ved 1:1000 fortynning, anti-kalpain-en (Cell Signaling, MA, USA) ved 1:1000 fortynning, anti-Actin (lasting kontroll, Cell Signaling, MA, USA) ved 1:3000 fortynning, anti-BCL-2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 1:3000 fortynning, og anti-Mcl-en (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA ) ved 1:3000 fortynning, og anti-Noxa (Calbiochem, Merck, Tyskland) 1:1000 fortynning. Etter tre vaskinger med Tween 20 i PBS, ble membranene inkubert i 1 time ved romtemperatur med motsvarende pepperrot peroksidase konjugert anti-kanin og anti-muse sekundære antistoffer. Membranene ble vasket fire ganger med PBS /Tween 20, og de signaler som ble visualisert ved ECL-reagens (AmershamTM ECL Plus Western blotting deteksjonssystem, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), etterfulgt av eksponering for kjemiluminescens film (Amersham HyperfilmTM ECL; GE Healthcare ; Buckinghamshire, UK). Immunoblotanalyse analyser ble gjentatt minst to ganger for hvert protein testet.
Gene Expression Arrays
Hel-genom uttrykk profilering av 2 kreftcellelinjer (CNE2 og SNU1) ble utført ved hjelp av HumanHT-12 v4 hel-genom genekspresjon direkte hybridisering analysen (Illumina, San Diego, USA). Total RNA fra celler behandlet med stoffet ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA prøver ble kvantifisert ved hjelp av et ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, USA) og vurderes for nedbrytning ved hjelp av BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA) før genuttrykk rekke analyse. Total RNA (500 ng) ble omdannet til cDNA, etterfulgt av en
in vitro
transkripsjon til syntese biotin-merket cRNA bruker IIumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Illumina, San Diego, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. -Merket cRNA ble resuspendert med hybridiserings- reagenser og hybridisert til HumanHT-12 v4 BeadChips i 18 timer i 58 ° C ovn hybridisering. De BeadChips ble vasket, blokkerte og farget for å forberede for skanning. Fluorescens intensitet på hver sonde ble skannet ved hjelp av Illumina BeadArray Reader. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver prøve.
Statistisk Selection of Post-behandling differensielt uttrykte gener
Forskjellig som uttrykker gener mellom behandlingsgrupper (gemcitabin og kombinasjon av gemcitabin og gossypol) i de to -cellelinjer (henholdsvis CNE2 og SNU1) var fastslå basert på metoden beskrevet i Wong et.al [27]. For hvert gen er en-veis ANOVA først anvendt for å teste for eventuelle forskjeller mellom hjelp av de to behandlingsgruppene ved et signifikansnivå på 0,05. Dersom nullhypotesen forkastes, ble Dunnetts posthoc test utført til fastsatt forskjellene mellom to sammenligninger på familiemessig feilrate på 0,05. Sammenligningene er (i) kontroll (ingen behandling) versus gemcitabin behandling og (ii) kontroll versus kombinasjonsbehandling. Et gen er merket uttrykt forskjellig (opp- eller ned-regulert) hvis minst en sammenligning blir detektert av den posthoc prosedyre. Listene av differensial-gener fra hver cellelinje ble overlappet og kartlagt til KEGG veier som tidligere beskrevet i DAVID database [28]. ENKEL verdi på 0,1 ble satt til å bestemme betydningen av genet sikt berikelse i DAVID merknad system. Et gen liste over 14065 og 11342 differensielt uttrykte gener fra begge cellelinjer ble valgt for videre evaluering.
Resultater
Følsomhet for kreft cellelinjer til gemcitabin i forhold med BCL-2 Expression
Fire nasofaryngeale cancercellelinjer (NPC) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin (0,001 til 100 uM) for å evaluere kjemosensitivitet av gemcitabin. Det var et bredt spekter i IC
50 av gemcitabin følsomhet hvorved CNE2 ble funnet å være motstandsdyktige mot gemcitabin, med IC
50 over 100 pM (figur 1A) og Ht1 ble funnet å være den mest følsomme for gemcitabin. For å undersøke hvorvidt gemcitabin motstand er relatert til høy ekspresjon av Bcl-2, undersøkte vi grunnlinjen ekspresjon av Bcl-2 i alle NPC cellelinjer. Det ble observert at cellelinje som hadde høy Bcl-2 ekspresjon (CNE2, figur 1B) var resistent mot gemcitabin. Sammenhengen mellom gemcitabin motstand og BCL-2 uttrykk ble videre undersøkt i 3 brystkreftcellelinjer og tre magekreft celle konsekvent, MCF-7 brystkreft cellelinje og YCC16 magekreft cellelinje som hadde høy BCL-2 uttrykk var resistente mot gemcitabin (Figur 2 og 3). Med unntak av SNU1, lavt nivå eller ingen ekspresjon av Bcl-2 ble funnet i cellelinjer som var følsomme for gemcitabin.
(A) IC
50 av gemcitabin til nasofaryngeale cancercellelinjer. Bety IC
50 ± Standardfeil (SE) på minst to uavhengige eksperimenter ble utført i tre paralleller. Celler ble behandlet med gemcitabin i 72 timer og celleformering ble bestemt ved bruk av MTS-måling. (B) Immun av BCL-2 baseline uttrykk i nasofaryngeale kreftcellelinjer.
(A) IC
50 av gemcitabin til brystkreftcellelinjer. Bety IC
50 ± Standardfeil (SE) på minst to uavhengige eksperimenter ble utført i tre paralleller. Celler ble behandlet med gemcitabin i 72 timer og celleformering ble bestemt ved bruk av MTS-måling. (B) Immun av BCL-2 baseline uttrykk i brystkreftcellelinjer.
(A) IC
50 av gemcitabin til mage kreft cellelinjer. Bety IC
50 på ± standard feil (SE) på minst to uavhengige eksperimenter ble utført in triplo. Celler ble behandlet med gemcitabin i 72 timer og celleformering ble bestemt ved bruk av MTS-måling. (B) Immun av BCL-2 baseline uttrykk i mage kreft cellelinjer.
I likhet Drug Response til kreftcellelinjer mellom Gossypol og AT101
Tre mage kreft cellelinjer (AGS, YCC16 og SNU1) ble behandlet med gossypol og AT101 å bestemme deres IC
50, henholdsvis. Som forventet, (-) – gossypol var mer potent enn racemisk gossypol, men det var generelt mindre enn 10fold forskjeller i IC
50 mellom begge legemidler i gastriske cellelinjer. All etterfølgende in vitro-studier ble utført ved anvendelse av den racemiske gossypol (tabell 1) som det var liten forskjell i cellulær cytotoksisitet ved hjelp av enten stoffet. Gossypol ble funnet å ha moderat aktivitet i alle de ti cellelinjer (figur 4). I motsetning til gemcitabin, var det ingen klar sammenheng mellom graden av Bcl-2-ekspresjon i cellelinjene til IC
50 av medikamentet.
Nasofaryngeal (n = 4), bryst (n = 3) og gastrisk (n = 3) cancercellelinjer ble testet for deres følsomhet for gossypol. Bety IC
50 på ± standard feil (SE) på minst to uavhengige eksperimenter ble utført in triplo. Cellene ble behandlet med gossypol for 72 timer og celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av MTS analysen.
Synergistic legemiddelinteraksjon mellom Gossypol og gemcitabin i Gemcitabine-resistens (GEM-R) cellelinje med høy BCL-2 Expression
For å bestemme mulig synergi samspillet mellom gossypol og gemcitabin, kombinasjonen medikamentell behandling ble gjennomført i alle 10 kreftcellelinjer. Med unntak av SNU1, ble synergisme observert i de cellelinjer som hadde høy Bcl-2-ekspresjon, men ikke i cellelinjer som uttrykte lave Bcl-2 (tabell 2, figur S1). Sammen er disse observasjonene tyder på at det er en trend der gemcitabin resistente cellelinjer som uttrykte høyt nivå av BCL-2 er synergistisk til kombinasjonsmedikamentelle behandlinger med gemcitabin og gossypol.
Tilbakeføring av gemcitabin Motstand ved Gossypol ble assosiert med oppregulering av Noxa og nedregulering av Bcl-2 og Bcl-xl
for å undersøke de underliggende molekylære mekanismene for synergistisk interaksjon mellom gossypol og gemcitabin, vi undersøkte endringer av pro-apoptotiske og anti- apoptotiske proteiner i høye BCL-2 uttrykk GEM-R cellelinjer (YCC16, CNE2 og MCF7). Som vist i figur 5, anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og /eller Bcl-xl) ble oppregulert på alle Bcl-2 overekspresjon GEM-R-cellelinjer etter gemcitabin behandling. I motsetning til dette, behandling med gossypol førte til nedregulering av anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og /eller Bcl-xl) og oppregulering av pro-apoptotiske protein, (Noxa og Mcl-1
s) ( Figur 5). En generell nedgang i Bcl-2-ekspresjon ble også observert i alle GEM-R-cellelinjer som ble behandlet med gossypol eller kombinert behandling. Imidlertid, nedregulering av Bcl-xl ble også observert i MCF-7 når cellene ble behandlet med enten gossypol eller kombinert behandling. En økning i spalting av pro-apoptotiske Mcl-1
S-ekspresjon i alle bcl-2 overekspresjon GEM-R-cellelinjer ble observert etter kombinert behandling. Men uttrykk for Bax og Bak forble uendret etter behandling. Sammen er disse observasjoner antydet at gossypol reversering av gemcitabin motstand involverer nedregulering av anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og /eller Bcl-xl) og opp-regulering av pro-apoptotiske proteiner (Noxa og Mcl-1
S).
immunoblot av apoptotiske protein uttrykk i gemcitabin resistente cellelinjer (GEM-R) når behandlet med kombinasjonen av gossypol og gemcitabin i 48 timer. Resultatene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
vesentlige endringer i apoptotiske Pathway Bidratt til differensial Response til gemcitabin og Gossypol
Hele genomet uttrykk profilering ble gjennomført i SNU1 (PERLE S) og CNE2 (GEM-R) for å vurdere alternative mekanismer for deres forskjeller i legemiddelrespons til gemcitabin alene og gemcitabin /gossypol kombinasjon (figur 6). Totalt 2702 gener ble uttrykt forskjellig i pre- og postbehandlingsprøver og ble kartlagt til 61 beriket biologiske prosesser ved hjelp KEGG pathway analyse. De vesentligste biologiske prosesser som reguleres av disse genene har spliceosome, cellesyklus, pyrimidin metabolisme, p53 signal og apoptotiske baner (se saksdokumenter, Tabell S1). Behandling med gemcitabin overveiende førte til oppregulering av disse behandling responsgener i CNE2 (GEM-R), men en ned-regulering i SNU1 (GEM-S) (figur 6), noe som tyder på at den opp-regulering av disse genene som involverer i p53 og apoptotiske trasé kan bidra til gemcitabin motstand. I tillegg nesten halvparten av disse behandlingsrespons genene ble nedregulert i CNE2 (GEM-R) etter behandling med gossypol og gemcitabin med minimale endringer observert i SNU1 (GEM-S).
Heatmap av 2702 vesentlig forskjellig uttrykte gener i gemcitabin resistente, GEM-R og gemcitabin sensitive, GEM-S behandlet med gemcitabin alene (Gem) eller i kombinasjon med gossypol (Gem + GOS) i forhold til ubehandlede passet kontrollcellelinjer. Uttrykket nivåer av hvert gen er høyere og lavere enn kontroll er avbildet i rødt og grønt, henholdsvis.
Redusert Anti- og Pro-apoptotiske genekspresjon i GEM-R og GEM-S cellelinjer når gossypol ble kombinert med gemcitabin behandling
for å ytterligere evaluere gener som kan være ansvarlig for gemcitabin følsomhet og synergi til kombinert behandling med gemcitabin og gossypol, bestemte vi oss for å fokusere bare på apoptose relaterte gener i KEGG bane som var forskjellig modulert etter behandling av gemcitabin alene og etter en kombinert behandling. Vi identifiserte 65 gener (31 anti-apoptose og 34 pro-apoptose) i apoptotiske sti som ble betydelig regulert i CNE2 (GEM-R), og 49 gener (23 anti-apoptose og 26 pro-apoptose) som ble betydelig regulert i SNU1 (GEM-S) (se Hjelpemiddel Informasjon; Tabell S2).
i CNE2 (GEM-R), fant vi at de fleste av anti-apoptotiske gener var signifikant oppregulert når cellene ble behandlet med gemcitabin (figur 7A). Omvendt, de fleste av disse anti-apoptotiske gener ble nedregulert ved SNU1 (GEM-S) ble behandlet med gemcitabin alene (figur 7B). Det ble også observert at genekspresjon av de fleste av disse anti-apoptotiske gener ble signifikant redusert når gossypol ble tilsatt til gemcitabin i CNE2 (GEM-R) (figur 7A). Tilsvarende anti-apoptotiske gener som ble nedregulert i SNU1 (GEM-S) etter gemcitabin behandling, ble også funnet å være videre nedregulert når cellene ble behandlet med kombinasjonsterapi (figur 7B). Men det var også mer anti-apoptoptic gener, i første omgang oppregulert av gemcitabin, men ble nedregulert i CNE2 (GEM-R) (11 gener) etter kombinasjon av gossypol og gemcitabin, sammenlignet med SNU1 (4 gener) (Figur 7A og B ).
relative log
2 ganger endring for anti-apoptotiske-genklusteret (A-B) og pro-apoptotiske-genklusteret (C-D), behandlet med gemcitabin alene (Gem) og i kombinasjon med gossypol (Gem + GOS). Bare gener som var signifikant forskjellig uttrykt fra kontroll ubehandlet gruppe er representert i diagrammet. Alle verdier på y-aksen ble sammenlignet med ubehandlede kontroller av de respektive cellelinjer. Verdier over null indikerte gener som ble oppregulert i sitt uttrykk. Verdier under null indikert gener som ble nedregulert i sitt uttrykk og verdier på null indikerte ingen endring i genuttrykk. Loggen
2 nivåer forbundet gener ble normalisert til den ubehandlede prøven.
I likhet trenden med redusert pro-apoptotiske gener uttrykk ble observert i begge cellelinjene som ble behandlet med kombinasjonen medikamentell behandling i forhold til cellelinjer behandlet med gemcitabin alene (figur 7C og D). Men til tross for redusert i pro-apoptotiske genekspresjon, var det mer pro-apoptotiske gener i CNE2 (GEM-R) (15/29 gener) som forble oppregulert etter kombinert behandling (figur 7C), sammenlignet med SNU1 (GEM -S) (4/12 gener) i den samme behandling (figur 7D). Det bør bemerkes at bare de genekspresjon av NFKBIA ble funnet å være opp-reglated i SNU1 (GEM-S) etter kombinasjonsterapi sammenlignet med dens genekspresjon i løpet av gemcitabin-behandlingen (figur 7D).
Validering av anti-apoptotisk Gene Cluster i GEM-R og Pro-apoptotiske Gene Cluster i GEM-S
for å validere klyngen av anti- og pro-apoptotiske gener i CNE2 (GEM-R) og SNU1 (GEM-S ) cellelinjer er vist i figur 7, undersøkte vi 5 utvalgte gener i KEGG apoptose bane som kan ha viktig rolle i apoptose i respons til gemcitabin og gossypol behandling (figur 8). I likhet med genekspresjon assay, ble anti-apoptotiske PIK3R2 og pakt proteinekspresjon funnet å være oppregulert ved CNE2 (GEM-R)-cellelinjen ble behandlet med gemcitabin, med en reduksjon i proteinnivå kun observert i pakt når cellene ble behandlet med kombinasjonsbehandling (figur 9). Gemcitabin behandlet SNU1 (GEM-S) cellelinje viste minimale endringer i PIK3R2 og pakt protein ekspresjon sammenlignet med ubehandlede celler, men kombinasjonsbehandling med SNU1 (GEM-S) cellelinje resulterte i signifikant reduksjon av PIK3R2 og pakt proteinekspresjon (figur 9 ).
Vi observerte at det var en mindre økning i protein uttrykk for pro-apoptotiske gener, BAD, CASP6 og CAPN1 etter gemcitabin behandling i både CNE2 (GEM-R) og SNU1 (PERLE S) cellelinje (figur 9). BAD, CASP6 og CAPN1 ble funnet å bli nedregulert ved kombinasjonsbehandling på GEM-S-cellelinje, men ikke GEM-R-cellelinjen (figur 9). Disse observasjonene er sammenfallende med funn i figur 5, og foreslår at alternative BCL-2 veier som er involvert AKT, PI3K, BAD, CASP6 og CAPN1 kan bidra til å forklare differensial respons til gemcitabin og synergis interaksjoner i kombinasjonsbehandling av gemcitabin og gossypol.
Immun av anti-apoptotisk (Pakt og PI3KR2) og pro-apoptotisk (BAD, CASP6 og CAPN1) gener i GEM-R cellelinje og GEM-S cellelinjer. Celler ble behandlet med gemcitabin og kombinasjon med gossypol i 48 timer. Resultatene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Høy BCL-2 uttrykket har blitt korrelert med dårlig klinisk prognose hos kreftpasienter [29] samt motstand mot konvensjonell cellegifter [30]. Han et al rapporterte som har vist at overekspresjon av Bcl-2 til å være assosiert med signifikant redusert følsomhet for gemcitabin behandling, og at dets ekspresjon kan benyttes som en prediktor faktor for effektiviteten av gemcitabin behandling av cancerpasienter [12]. In vitro studier har også vist en direkte korrelasjon med høy Bcl-2 cellulært innhold og motstand mot gemcitabin i pankreas karsinom-cellelinjer [11]. Det var imidlertid motstridende rapport observere ingen sammenheng mellom Bcl-2 og gemcitabin følsomhet i bukspyttkjertelen, prostata, lunge og brystkreft [31].
I vår studie fant vi at nasopharyngeal, bryst og mage kreft cellelinjer motstandsdyktig mot gemcitabin hadde høyere Bcl-2-ekspresjon, og behandling med gemcitabin resulterte i en opp-regulering av anti-apoptotiske Bcl-2 eller Bcl-xl. Disse observasjoner antydet at nivået av genuttrykk av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-xl var viktig i gemcitabin motstand. Til støtte for dette funnet, Schniewind et al fant en signifikant invers korrelasjon mellom BCL-XL uttrykk og gemcitabin indusert apoptose [32], og at økt BCL-xl uttrykk hemmer celle apoptose i cellegifter [33].
flere rapporter har vist effektiviteten av gossypol i målretting kreftceller med høy grad av Bcl-2 og dets familiemedlemmer, ved å øke cellulær apoptose ved anvendelse som et enkelt middel [19] eller i kombinasjon med gemcitabin [34]. Macoska et al viste synergistisk interaksjon i blærecancercellelinjer behandlet med gossypol i kombinasjon med gemcitabin eller carboplatin, noe som resulterer i en økning i apoptose via den reduserte ekspresjon av pro-overlevelse Bcl-xl og Mcl-1 og økt ekspresjon av pro-apoptotiske gener [34]. Imidlertid bør man være oppmerksom på at ikke alle BCL-2 overekspresjon cellelinjer kan ha nytte av å kombinere gossypol med gemcitabin. I vår studie ble potensiell antagonistiske effekt av gossylpol og gemcitabin observert i SNU1, en cellelinje som hadde høy grad av Bcl-2, men var følsom for gemcitabin, noe som antyder en alternativ Bcl-2 pathway in gemcitabin reaksjon [35], [36] .
Vi observerte at GEM-R-cellelinjer med høy Bcl-2 hadde opp-regulert pro-apoptotiske Noxa og nedregulert Bcl-2 eller Bcl-xl uttrykk når de ble behandlet med enten gossypol eller i kombinasjon med gemcitabin (Figur 5). Det har blitt foreslått at gossypol mål Bcl-xl ved inhibering av anti-apoptotisk aktivitet, som direkte resulterer i opp-regulering av pro-apoptotiske Noxa og Puma uttrykk [37]. Aktiveringen av Noxa også kunne føre til BH3-motivet avhengig lokalisering til mitokondriene og interaksjon med anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, noe som resulterer i aktivering av apoptose [38]. Videre studier har vist at oppregulert pro-apoptotiske gener, så vel redusert ekspresjon av anti-apoptotiske gener var i stand til å øke gossypol indusert apoptose i flere typer kreftceller [39], [40]. Vi viste også at Mcl-en
S ble økt i en GEM-R cellelinje behandlet med gossypol eller kombinert behandling (figur 5). Denne observasjonen kan støttes av Meng et al.
