Abstract
Prodigiosins (PGS) er en familie av naturlige røde pigmenter med anticancer aktivitet, og ett medlem av familien har inngått kliniske fase II-studier. Men kreft mekanismer for PGS fortsatt i stor grad uklart. Denne studien var designet for å undersøke den molekylære grunnlaget for anticancer aktivitet av UP, et derivat av PGS, i P388 celler. Ved å introdusere farmakologiske inhibitorer og anvendelse av en rekke forskjellige analytiske metoder, inkludert western blotting, flowcytometri og konfokal lasermikroskopi, har vi funnet at UP inhiberte proliferasjon av P388 via stoppe celler i G2 /M fase og induserende celler apoptose, som var knyttet til aktivering av P38, JNK snarere enn ERK1 /2 signalering. ROS regenerering og forsuring i cellene vises ikke involvert i UP indusert apoptose. Videre bruk av massespektrometri, sukrosetetthets gradient fraksjonering og immunfluorescens farging, oppdaget vi at UP var tilsynelatende plassert på ribosom. Disse resultatene sammen indikerer at ribosomet kan være potensielt mål av UP i kreftceller, som åpnet en ny vei for å kartlegge anticancer mekanisme av PG
Citation. Liu P, Wang åå, Qi X, Gu Q, Geng M, Li J (2013) Undecylprodigiosin apoptose i P388 kreftceller er assosiert med binding til ribosom. PLoS ONE 8 (6): e65381. doi: 10,1371 /journal.pone.0065381
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada
mottatt: 05.11.2012; Godkjent: 24 april 2013; Publisert: 14 juni 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National High-tech R D Program (2011AA09070104) i Kina og Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research team i University (IRT0944). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prodigiosins (PGS) er en familie av naturlige røde pigmenter, strukturelt preget av en felles pyrrolylpyrromethene skjelett med varierende sidekjeder. PGS, opprinnelig isolert fra Serratia av Amak i 1929, er sammensatt av prodigiosin (PG), prodigiosin 25-C (PG 25-C), metacycloprodigiosin (MP), cycloprodigiosin (CPrG) og undecylprodigiosin (UP), etc. PG er sekundære metabolitter av ulike bakterier med ulike biologiske aktiviteter som antimikrobiell, anti-malaria, immundempende og anticancer. Strukturene av PG og UP er vist i Figur 1 [1], [2].
Økende studier har antydet at anticancer aktivitet av PG-er. Det har blitt rapportert at PG induserer apoptose i hematopoetiske, gastrointestinale, bryst og lunge kreftceller, mens ikke-toksiske til ikke-maligne celler [3] – [5]. Foreløpig har en PG derivat GX15-070 inngått kliniske fase II-studier for sin anticancer aktivitet [6].
Voksende studier har blitt gjennomført for å avdekke molekylære mål for PGS å få innsikt i sin anticancer effekt, men funnene avdekket store avvik i forskjellige celle sammenheng eller ved hjelp av individuelle forbindelser. PG-er er rapportert å utløse signalveier muligens ved induksjon av DNA-dobbeltstrengbrudd og /eller nøytralisering av pH-gradienter, noe som fører til cellesyklus vekslinger og apoptose. Janus tyrosinkinase 3 (Jak3) som assosierer med IL-2R ved aktivering ble også foreslått å være den molekylære mål for PGS i mage kreftceller [7]. Nylig, M. Espona-Fiedler identifisert mammalian target of rapamycin (mTOR) som kandidat molekylære mål av PGS i melanom celler [8]. Likevel, den molekylære mekanismen i PGS fortsatt i stor grad uklart.
Vi har hentet opp fra fermenteringsvæsken av en svamp Mykale plumose-avledet actinomycete
Saccharopolyspora sp.Nov
, og funnet ut at denne forbindelsen utstilt signifikant cytotoksisk aktivitet mot fem kreftcellelinjer, blant annet virkningen på murine leukemi P388 var den mest tydelig [9]. I foreliggende studie forsøkte vi å avdekke den molekylære basis for UP på sin anticanceraktivitet i P388-celler. Resultatene indikerer at UP inhiberer proliferasjon av P388 ved indusering av G2 /M fase og apoptose, som var knyttet til aktivering av P38, JNK snarere enn ERK1 /2-signalering. Ribosomet synes det potensielle målet for UP. Denne studien gir molekylære grunnlaget for ytterligere å belyse anticancer mekanisme av PG i fremtiden.
Materialer og metoder
Reagenser
UP og PG ble gitt av professor Gu (School of medisin og Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao, Kina). Deres renhet var 99,5%. 4,6-diamidino-2-phenyllindile (DAPI), propidiumjodid (PI). Føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra GIBCO (Gaithersburg, MD). En forbedret chemiluminescence (ECL) kit ble kjøpt fra Pierce (Holmdel, NJ) .U0126, SP60012, SB203580, SRB, DCFH-DA, BCECF AM, AO ble alle kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Jiangsu, Kina). PARP, Cyt C, Caspase-3, Caspse-8, caspase-9, β-aktin, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 og P38 antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Ribosomalt protein S3 antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California).
Cellelinjer og kultur
Cellelinjer ble kjøpt fra Institutt for biokjemi og cellebiologi (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i henhold til leverandørens anvisninger. I korte trekk, ble P388-celler opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles minimale essensielle medium (DMEM); A459-celler ble dyrket i F12K-medium. Begge media ble supplert med 10% føtalt bovint serum. Cellene ble holdt i 5% CO2 ved 37 ° C.
Cell Proliferation Assay
celleproliferasjon ble målt ved SRB-analysen. P388-celler ble dyrket ved 8 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater og deretter behandlet med UP i 72 timer. I noen forsøk ble cellene forbehandlet med NAC, iminazole eller MAPK inhibitor i 1 time. Cellene ble inkubert med 16% trikloreddiksyre (TCA) ved 4 ° C i 1 time, hvoretter ble platene vasket fem ganger med kaldt vann, ble det overskytende vann tappes av og platene fikk tørke i luft. SRB flekk (100 ul, 0,4% i 1% eddiksyre) ble tilsatt til hver brønn og holdt i kontakt med cellene i 30 minutter, deretter ble cellene vasket med 1% eddiksyre til fem ganger. Platene ble tørket og 150 ul 10 mM Tris-base (pH 10,5) ble tilsatt til hver brønn for å solubilisere fargestoff i 30 minutter. Absorbans (OD) av hver brønn ble avlest på en Microplate Reader (Tecan, Østerrike) ved 490 nm bølgelengde. Den% av cellen levedyktighet = (OD av behandlede celler /OD av kontrollceller) × 100%.
DNA innholdsanalyse
P388 celler ble sådd ut i 100 mm dyrkningsskål på 2 × 10
5-celler /skål, 24 timer senere ble cellene behandlet med UP i 24 timer. Deretter ble cellene høstet, fiksert med 70% kald etanol ved 4 ° C i 12 timer, inkubert med RNase A (30 ug /ml) i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter farget med propidiumjodid (50 ug /ml ) ved 4 ° C i 30 minutter. Cellular DNA ble analysert ved flowcytometri (Vantage, Becton Dickinson, San Jose, California).
Western Blot analyse
Etter UP (0,05 mm) behandling for en h eller 24 timer, 1 x 10
6-celler ble vasket med PBS og deretter lysert med RIPA (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) i 30 minutter på is. Cellelysatet ble lastet for elektroforese på 10% SDS-PAGE. De separerte proteiner ble elektroforetisk blottet på NC-membran (Millipore, USA). Membranene ble blokkert i 5% ikke-fettholdig melk fortynnet i TBS-T i 2 timer ved RT, og deretter inkubert over natt med antistoffer for PARP, Cyt C, caspase-8, 9, 3, p-AKT, AKT, p- ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 og P38. Geit-anti-kanin-IgG konjugert til pepperrot-peroksidase (1:3000 fortynning) ble inkubert i 1 time ved RT. Mellom hver inkubasjon ble membranene vasket 3 x 5 minutter i TBS-T. -Antistoff-binding ble påvist med forsterket kjemiluminescens reagens.
Lokalisering av UP i celler
P388-celler dyrket på dekkglass ble behandlet med UP (0,05 uM) .at 37 ° C i 1 time. Etter tre vaskinger med PBS ble cellene deretter inkubert med DAPI. Glassene ble undersøkt med en laser scanning confocal mikroskop (LSM510-Meta, Zeiss, tysk) [10].
AO Farging
De levende dyrkede celler ble farget med acridinoransje som beskrevet tidligere [ ,,,0],11], [12]. Kort sagt ble P388 celler i et kammer lysbilde utsettes for UP i 1 time. Deretter ble cellene inkubert med 5 pg /ml akridinorange i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Kammerobjektglass ble vasket med Hanks «oppløsning og deretter ble undersøkt ved bruk av konfokal laser-mikroskopi.
Påvisning av intracellulære pH (phi)
P388-celler ble utsatt for 0,05 uM av UP i 1 time. Dyrkede celler ble vasket med PBS, sentrifugert og lastet med 10 uM 29, 79-bis- (karboksyetyl) -5 (69) -Carboxyfluorescein acetoksymetylester (BCECF-AM) ved 37 ° C i 30 minutter i PBS. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i PBS og analysert ved hjelp av strømningscytometri [4].
Påvisning av Intracellulære Reactive Oxygen Species (ROS)
Intracellulær oksidativt stress ble bestemt ved å måle intracellulær oksydasjon av 2 «, 7»-dichlorofluorescin (DCFH). Substratet er DCFH-DA som lett diffunderer inn i cellen og blir deretter deacetylert ved cellulære esteraser til de mer hydrofile, ikke-fluorescerende DCFH. ROS generasjon i cellen oksiderer DCFH til fluorescerende 2 «, 7»-dichlorofluorescein (DCF). P388-celler ble sådd og inkubert med UP (0,05 uM) i 1 time, deretter høstes cellene, vasket og lastet med DCFH (10 pM) ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter ble cellene høstet, vasket og lastet med DCFH (10 pM) ved 37 ° C i 30 minutter. Til slutt ble cellene vasket med PBS, og mobilnettet fluorescens ble kjøpt ved hjelp av flowcytometri med eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 530 nm [13], [14].
Native-PAGE og massespektrometrisk analyse
etter inkubasjon med UP (0,05 uM) i 1 time ved 37 ° C, P388-celler ble høstet og lysert med lyseringsbuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) i 30 min på is, sentrifugert ved 12 000 g i 20 min ved 4 ° C. Et like stort volum av ladningsbuffer (50 mM trisbase, 30% glycerol, 0,01% bromfenolblått) ble tilsatt til supernatanten. Prøvene ble separert på 8% Native-PAGE, og strimmelen ble kuttet i henhold til fargen av UP. Proteinene bindende med UP ble analysert ved LC-ESI-LTQ (Thermo Finnigan LTQ) mot NCBI mus protein database [15].
Sukrose Density Gradient Fraksjone
For å forberede cytoplasma ekstrakt for ribosomal fraksjone , P388-celler ble behandlet med 0,05 pM opp i 1 time, deretter vasket med iskald PBS to ganger og lysert i iskald RIPA i 30 min, deretter sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min for å fjerne den resulterende supernatanten av kjerner, mitokondrier og rusk. Lysat proteinoppløsning ble lagt over 9 ml lineær sucrose-gradient-oppløsning (10-50%) i en 11,5 ml Sorvall sentrifugerør og sentrifugert ved 35 000 x g i 3 timer ved 4 ° C i ultrasentrifuge (Beckman Optima tm L-100 XP). Bare UP uten lysat på toppen av lineær sukrosegradient løsning ble anvendt som kontroll [16].
Immunofluorescence Farging
P388-celler ble inokulert i en seks-brønns plate og dyrket over natten. Celler ble utsatt for UP (0,05 uM) i 1 time. Cellene ble skylt to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert i 10 minutter med 4% formaldehyd. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og permeabilisert deretter i 10 minutter med 0,1% Triton X-100, cellene ble pre-inkubert med PBS inneholdende 1% BSA i 20-30 min og farget med ribosomalt protein S3-antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med anti-mus-IgG-FITC i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket med PBS og undersøkt ved hjelp confocal laserskanning mikroskop [17].
Resultater
UP hemmer veksten av P388 Cells
For å bestemme den cytotoksiske effekten av UP på P388 celler, ble SRB-analysen brukt til å vurdere celleformering etter 72 timers behandling. I et konsentrasjonsområde på 0,0048 til 15
μ
Μ, UP behandling resulterte i en konsentrasjonsavhengig inhibering i cellevekst av P388 celler. IC
20 og IC
50 på P388 celler var 0,0049
μ
Μ og 0,042
μ
Μ henholdsvis (fig. 2).
Celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av UP og PG i 72 timer. De data som er vist representerer prosentandelene av cellelevedyktigheten av tre uavhengige forsøk med tre bestemmelser i hver. **,
p
0,01 og ***, p. 0,001 vs. Kontroll
UP induserer G2 /M fase og apoptose i P388 Cells
undertrykkelse av kreftcellevekst er kjent for å være primært mediert av apoptose og cellesyklus-stans. Vi neste søkt flowcytometri å analysere cellesyklus fase distribusjon og apoptose på UP behandling. P388-celler behandlet med UP (0,05 uM) i 24 timer viste akkumulering i G2 /M (40,73%) med en samtidig reduksjon i G0 /G1 faseceller, noe som tyder på en cellesyklus-stans i G2 /M-fasen. UP også induserte en høyere prosentandel av sub G0 /G1 befolkningen, en indikasjon på apoptose forekomst. Ca 8,23% cellene var apoptotiske når de behandles med UP i 24 timer i motsetning til 1% apoptotiske celler i den ubehandlede kontrollgruppen. Videre undersøkte vi UP indusert poly (ADP-ribose) polymerase cleavage, et kjennetegn på apoptose som indikerer aktivering av kaspaser. Resultatene viste at hydrolyse av 116 KD poly (ADP-ribose) polymerase proteinet til 85 KD ble påvist i UP behandlede celler etter 24 timers eksponering ved 0,05 pM. For å undersøke om caspases var involvert i UP indusert apoptose, ble western blot analyse utført for ytterligere å bekrefte deltakelse av caspase-3, caspase-8 og caspase-9. De cleavaged bånd av procaspase-3, procaspase-8 og procaspase-9 ble påvist etter behandling med UP i 24 timer, noe som indikerer at aktiveringen av caspase-3, caspase-8 og caspase-9.
A. DNA-histogrammer av P388-celler dyrket i medium alene, eller i DMSO (1:1000) eller i nærvær av 0,05 pM PG og opp til 24 timer. B. Ekspresjon av apoptose-relaterte proteiner ble bestemt ved immunoblotting med spesifikke antistoffer etter eksponering for UP i 24 timer. Uttrykket ble kvantifisert ved hjelp av datastyrt bildeanalyse system Imagequant. Hver kolonne representerer de skannes i duplikat av tre brønner uttrykt som prosent av kontroll ± standardavvik. *,
P
0,05, UP vs. Blank. C. Representative flowcytometri-profiler av Rhodamine 123 farging, etter at cellene ble inkubert med 0,05 pM av UP i 24 timer. en, DMSO; b, 0,05 mikrometer PG; c, 0,05 μΜ UP.
Vi neste undersøkte mitokondrie utgivelsen av Cyt C, oppstrøms sti av caspase 9. Etter 24-timers behandling med UP, utgivelsen av Cyt C i cytosol var betydelig øket, mens Cyt C i mitokondriene redusert åpenbart (fig. 3B). Det har vært kjent at utslipp av intermembrane proteiner som Cyt C oppstår etter integriteten av mitokondriemembranen ble svekket, noe som fører til en forstyrrelse av den indre transmembranpotensialet (ΔΨm). Virkningen av UP på mitokondrie transmembrane potensial (ΔΨm) ble videre undersøkt ved hjelp av rhodamine 123, en bestemt fluorescerende probe. Fluorescerende intensitet ble signifikant redusert i UP behandlede celler sammenlignet med (fig. 3C) kontrollgruppen. Disse resultatene sammen tyder på at den indre mitokondrielle apoptotiske sti, med caspase-9 og -3, er innblandet i UP-indusert apoptose i P388 celler.
UP Overveiende lokaliserer i Cytoplasm
UP avgir rødt fluorescens ved 488 nm eksitering, som kan visualiseres i levende celler. P388-celler ble farget med det DNA-bindende fargestoff DAPI etter 1 timers eksponering til 0,05 pM opp for å undersøke den sub-cellulære lokalisering av UP. Cellene ble fotografert i henhold konfokal lasermikroskopi. Som vist på fig. 4, UP ble hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma, men ikke membran eller i kjernen.
Den blå representerer kjernen flekker og røde representerer UP.
UP Aktiverer MAPK men ikke AKT Signa
for å fastslå potensialet involvering av protein kinase pathways i G2 /M arrest og apoptose indusert av UP, vi undersøkt fosforylering status av fire store proteinkinaser som forholder seg til celle spredning i P388 celler etter eksponert for UP i 1 time. Som vist på fig. 5A, UP åpenbart økte nivåene av fosfo-ERK1 /2, fosfo-p38MAPK, og fosfo-JNK1 /2, mens AKT-fosforylering status var knapt påvirket. Totale proteininnhold i de respektive proteinkinaser ble ikke endret.
A. Effekten av eksponering av P388 celler til 0,05 pM opp i 1 time på fosforylering status og ekspresjonsnivå av proteinkinaser. Uttrykket ble kvantifisert ved hjelp av datastyrt bildeanalyse system Imagequant. Hver kolonne representerer de skannes i duplikat av tre brønner uttrykt som prosent av kontroll ± standardavvik. ***,
P
0,001, UP vs Control. B. Virkninger av MAPK-inhibitorer på UP-indusert P388 vekstinhibisjon ble cellene forbehandlet med U0126 (10 uM), SP60012 (20 uM) eller SB203580 (20 pM) i 1 time, deretter ko-behandlet med UP i 72 timer. U0126, ERK inhibitor; SP60012 (SP), JNK inhibitor; SB203580 (SB), P38 inhibitor. **, P 0,01, PG vs. (PG + inhibitor), UP vs. (UP + hemmer)
For ytterligere å adressere om ERK1 /2, JNK1 /2 eller P38 var involvert i UP. -inhibited celleveksten, ble cellene inkubert med eller uten inhibitor av ERK1 /2, JNK1 /2 og P38 henholdsvis og deretter cotreated med 0,05 pM opp til 72 timer. Celler proliferasjon ble beregnet ved SRB-metoden. Som vist på fig. 5B, er ingen av disse inhibitorene påvirket cellene spredning per se. SP og SB, men ikke U0126 selvsagt reverseres den hemmende effekten av UP på proliferasjon av P388-celler, noe som indikerer at JNK1 /2 og p38-aktivering var involvert i UP-indusert apoptose. Bare P38 aktivering ble funnet å være relatert til PG-indusert apoptose, som var i overensstemmelse med litteraturrapporter [18].
NAC Svikter for å redde UP forårsaket Hemming av celleproliferasjon
Det er rapportert at PGS kan indusere ROS produksjonen i celler [19]. For å undersøke mulige involvering av ROS i UP-indusert apoptose og G2 /M fase arrest i P388 celler, vi først målt ROS generasjon i cellene. Resultatene viste at ROS-generasjon ble øket så tidlig som 1 time etter behandling UP (Fig. 6A). For å avdekke om de ROS generasjon står for UP-indusert apoptose, ble en ROS åtseldyr NAC brukes før UP behandling. Som vist på fig. 6A, NAC ikke klarte å redde veksthemming indusert av UP og PG, hvor i motsetning H
2o
2 undertrykt celleproliferasjon ble klart reversert ved NAC behandling. Disse funnene tyder på at ROS generasjon er mest sannsynlig ikke involvert i UP-indusert apoptose.
A. P388-celler ble behandlet med 0,05 pM opp i 1 time, og farget med DCFH (10 uM). Fluorescens ble målt ved flow-cytometri. en, DMSO + DCFH; b, 0,05 mikrometer PG; c, 0,05 mikrometer PG + DCFH; d, 0,05 mikrometer UP; e, 0,05 mikrometer UP + DCFH. B. P388-celler ble forhåndsbehandling med eller uten NAC (0,5 mM) i 1 time, deretter ble cellene inkubert gitt samtidig med PG (0,05 uM), DEG (0,05 uM) og H
2o
2 (0,4 mM) i 72 timer. *, P . 0,05, H
2o
2 vs (H
2o
2 + NAC)
Forsuring deltar ikke i UP forårsaket Vekst Hemming
akridinorange er en «syre trofisk» svak base, som tas opp av levende celler og akkumuleres i surgjorte kamrene slik som lysosomer [17], [20]. Fluorescens av akridinorange er grønn ved lave konsentrasjoner, mens ved høye konsentrasjoner fluorescens skifter til oransje [17]. Vi har observert åpenbar forsvinning i oransje granuler i celler etter kort behandling (1 time) med 0,05 uM av PG og UP (Fig. 7A). Endringene over Phi ble også analysert ved hjelp av strømningscytometri med BCECF-AM, en membran-gjennomtrengelige fluorescerende indikator for måling av cytoplasmisk pH. Vi fant ut at PHI redusert betydelig i PG eller UP-behandlede celler (Fig. 7B) sammenlignet med ubehandlede celler.
A. Akridin orange farging av P388 celler, PG og MP var 0,05 pM, AO var 5 ug /ml. Oransje granulat ble syrnet avdelinger. B. representere data av flow-cytometri phi-analyse ved anvendelse av 10 uM BCECF-AM-farging etter at cellene ble inkubert med 0,05 pM av PG eller opp til 24 timer med eller uten imidazol (0,5 mM) forbehandling i 1 time. en, kontroll; b, PG; c, PG + imidazol; d, UP; e, UP + imidazol C. Virkning av surgjøring inhibitor på UP-indusert P388 vekstinhibisjon ble cellene forbehandlet med imidazol (0,5 mM) i 1 time, deretter ko-behandlet med PG (0,05 uM) og UP (0,05 uM) i 72 h.
i motsetning til celle-gjennomtrengelig baser imidazol behandling markert forhindret nedgangen i Phi. Vi deretter testet om UP-forårsaket veksthemming kan bli reddet av imidazol. Samtidig å UP eksponering, var vi ikke i stand til å identifisere eventuelle vesentlige forskjeller sammenlignet med celler behandlet, om bare 3% gjenvinning (Fig. 7C), noe som tyder på at forsuring av cytoplasma bør ikke være den viktigste grunnen av apoptose indusert av UP. PG ble lagt merke til å ha lignende resultater til OPP.
UP binder seg til ribosomene i P388 Cells
Vi fortsatte å identifisere molekylære mål av UP i P388 celler ved å identifisere UP bindende proteiner ved hjelp av massespektrometri analyse. UP migrasjon kan lett observeres med en blotte øye som et band i oransje farge i nativ PAGE (Fig. 8A). Gelen bånd ble kuttet og underkastet massespektrometri-analyse. Totalt 951 proteiner ble oppdaget, blant som 171 proteiner, til vår overraskelse, var ribosomale proteiner med høyere CoverPercent (tabell 1), noe som tyder på at UP kan primært binde seg til ribosom.
A. Stripe av UP i Native-PAGE. B. Sukrose tettshetsgradient fraksjonering av UP-behandlede P388 celler og UP alene. C og D. subcellulær lokalisering av Rps3 og UP i P388-celler (C) og A549-celler (D) som detekteres av konfokal. UP fluorescens vises i rødt, Rps3 fluorescens i grønt og colocalization (fusjonere) i gult.
For ytterligere validering, ble P388 celler inkubert med UP på 0,05 mikrometer i 1 time og ribosom ble isolert ved sukrose tetthetsgradient-fraksjonering. Sammenligning med kontrollgruppen hvor UP ble beriket på toppen av sukrose tetthet løsning, ble åpen lagdelte fargebånd funnet i UP behandlede celler (Fig. 8B), som støtter en forestilling om at UP binder seg til ribosom. Vi har også oppdaget colocalization mellom UP og ribosom hjelp konfokalmikroskop i begge P388 celler (Fig. 8C) og A549 celler (Fig. 8D). Immunfluorescens farging viste at UP colocalized til ribosom identifisert av endogen Rps3 i de to cellelinjene.
Diskusjoner
Opp til dato, anticancer mekanisme i PGS fortsatt ikke har blitt avklart i detaljer. For eksempel, Francisco R rapportert PG påvirket mitokondrier, utøves en frakopling effekt på den elektroniske kjede, ble cellekjernen bevart fra prodigiosin adgang [17]. Men resultatene av Mont B indikerte at apoptose indusert av PG-er ble kobber-formidlet kløyving av DNA [21]. Jing Zhang et al. rapporterte også at PGS økte inter ROS, noe som førte til cytotoksiske effekter [19]. De molekylære mål for PGS er inkonsekvent rapportert inkludert JAK3, mTOR og NAG-en [7], [8], [22]. I vår studie, tror vi at UP indusert apoptose i P388 celler er assosiert med UP-ribosombindende.
Vi fant at UP hemmet celleproliferasjon, arrestert cellesyklusen i G2 /M fase, førte til aktivering av kaspase 3, 8, 9, forandringer av mitokondrier membranpotensialet, frigjøring av Cyt C og spalting av PARP. Disse resultatene indikerer at UP har cytotoksisitet overfor P388 og P388-celler som induserer apoptose involverer i mitokondriene apoptotisk reaksjonsvei minst. For å belyse mekanismen liggende apoptose indusert ved UP, vi først vurderes cellen fordeling av UP med sin auto-fluorescens, et resultat viste at UP fordelt i cytoplasma, men ikke membran eller kjernen, noe som antyder oss at UP kan interagere med molekylene cytoplasma å indusere apoptose.
PI3K /Akt pathway regulerer grunnleggende cellulære funksjoner som cellevekst, overlevelse, og bevegelse. Ekstravagant aktivering av PI3K /Akt veien har blitt rapportert å være assosiert med utvikling av kreft. Akt kan også direkte regulere den apoptotiske maskiner ved fosforylering og inaktivering av pro-apoptotiske proteiner som dårlig, i tillegg er Akt-aktivitet som er nødvendig for G2 /M fase overgang og AKT inhibering ofte induserer G2-M rest [23]. Men i våre eksperimenter, UP ble ikke funnet å påvirke AKT aktivering av P388.
MAP kinaser er sammensatt av serin /treonin proteinkinaser, herunder de ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK), p38 MAPK, c-Jun-NH2-terminal kinaser (JNK) og MAP-kinaser signalveier regulere hovedsak alle aspekter av ondartet celle atferd, spredning, overlevelse, migrasjon og invasjon [24]. Våre resultater viser at UP aktiverer P38, ERK og JNK bemerkelsesverdig. De selektive inhibitorer av p38 og JNK i stedet for ERK-inhibitor, hindret P388 kreftceller fra cytotoksisiteten indusert av UP. Disse resultatene indikerer at apoptose indusert ved UP er relatert til aktivering av p38 og JNK, som er forskjellig fra PG ved hvilken bare fosforylering av p38 innebærer i sin aktivitet.
ROS dannes intracellulært som biprodukter av normal aerob metabolisme eller som andre budbringere i forskjellige signaloverføringsveier, eller som respons på miljøstress [25], [26]. Som spesifikke andre budbringere i signaleringskaskader som er involvert i celle-proliferasjon og differensiering, og ROS vært implisert i reguleringen av forskjellige cellulære funksjoner inkludert intracellulær signale transkripsjonen aktivering, proliferasjon og apoptose [27]. I de senere årene har mange forskningsfokus på forholdet mellom ROS og mitogen aktivert protein kinase-MA
PK
signalveier. Ling Liu et al rapporterte at NG-indusert apoptose av HepG2-celler som var karakteristisk for intracellulær ROS generasjon. Samtidig NG behandling kan føre til aktivering av fosforylering av JNK og p38, men ikke ERK1 /2. Våre data viser at UP indusert intracellulær ROS produksjon i P388 celler. Men en ROS åtseldyr NAC kan ikke reversere hemming av spredning forårsaket av UP, selv om det åpenbart antagonized ROS produksjon av H
2o
2. Disse resultatene tyder på at generasjonen av ROS er ikke innblandet i apoptose indusert av UP.
Phi innen sure organeller er ansvarlig for en rekke viktige cellulære funksjoner, som for eksempel endocytose, eksocytose og intracellulær trafficking, samt celledifferensiering, cellevekst og celledød. Phi i transformerte eller kreftceller generelt forblir nøytral eller til og med noe mer basisk enn normale celler [28], regulert av en rekke phi homeostatiske mekanismer, inkludert Na
+ /H
+, Na
+ – avhengig og uavhengig Cl
– /HCO
3
– lere, vacuolar type H
+ – ATPase (V-ATPase) og andre. Daigo Ya mamoto rapportert at intracellulær forsuring av KPL-en ved cPrG.HCl behandling indusert apoptose og syklus arrest, som ble sterkt undertrykt av imidazol, en celle-gjennomtrengelig base. Det har blitt demonstrert at bafilomycin A1, en potent selektiv inhibitor av vacuolar H
+ – ATPase [29] induserer også en nedgang i intracellulær pH og hemmer veksten av forskjellige kreftcellelinjer [30]. Vi fant også at UP kan redusere intracellulær Phi oppdaget av konfokal og flowcytometri hhv. Imidlertid, imidazol, en inhibitor for surgjøring ikke klarte å redde veksthemming av UP. Disse resultatene utelukke muligheten for forsuring i apoptose indusert av UP.
Å dra nytte av sin autofluorescence funksjon, la vi merke til at UP er hovedsakelig fordelt i cytoplasma. Vi ytterligere isolert proteiner som binder til UP i native-PAGE gel og sendt til massespektrometri analyse. 171 proteiner fra 951 påvisbare proteiner ble ribosom-relatert, noe som tyder på at UP kan sannsynligvis binde seg til ribosom. Vi ytterligere validert hypotesen ved sukrose tettshetsgradient fraksjoneringsmetode, en konvensjonell tilnærming til å isolere og studere ribosom og ved immunfluorescens farging for å observere colocalization av UP og ribosom i P388 celler og A549 celler. Ribosomale proteiner spille flere roller i koordineringen proteinsyntese for å opprettholde celle homeostase og overlevelse. Nylige bevis antyder at et antall av ribosomale proteiner har sekundære funksjoner uavhengig av deres engasjement i proteinsyntese. Disse proteinene fungerer som celleproliferasjonsprosesser regulatorer og i noen tilfeller som induserer celledød [31], [32]. Johnson CR fant at interferens med 28S-rRNA av BCS initiert apoptose i Reh cellene gjennom rekruttering av SAPK-JNK signale [33]. Bae HK rapportert at SG spesifikt samhandlet med 40S og 60S ribosomale underenhetene så tidlig som 5 min i RAW 264.7 celler og indusert fosforylering av p38 og JNK [16]. Tatt i betraktning at UP kan indusere P388 celler apoptose som involverer aktivering av P38 og JNK i vår tidligere studie, spekulere vi at apoptose av indusert av UP kan være relatert til UP-ribosom-bindings, som i sin tur påvirker funksjonen av enkelte ribosom proteiner og fører til apoptose. Det var også verdt å nevne at bare to mitokondrier proteiner ble detektert ved massespektrometri med coverprecent av protein. 10%, noe som i stor grad utelukker muligheten for direkte målretting til mitokondrielle proteiner ved UP
i sammendrag, resultatene presentert i denne studien utelukke involvering av ROS og surgjøring i UP indusert apoptose, på tross av enorme litteratur. Våre data antyder at i stedet UP binder seg til ribosomet, som kan, i det minste delvis, utløse P38, JNK signalering og mitokondrielle veien apoptose, til slutt fører til inhibering av celle proliferation.The rettet ribosomale molekyler trenger å bli ytterligere undersøkt. Likevel ribosom kunne åpne en ny vei for å utforske anticancer mekanisme for PGS i fremtiden.
