Abstract
Mål
Kreft utvikling og progresjon er ikke bare knyttet til tumor celleproliferasjon, men også avhengig av samspillet mellom kreftceller og stromal mikromiljøet. En ny forståelse av rollen av tumoren mikromiljøet tyder på at tapet av stromal caveolin-1 (CAV-1) som en nøkkel regulator kan bli en potensiell terapi mål. Denne studien tar sikte på å belyse hvorvidt stromal Cav-1 uttrykk i bukspyttkjertelkreft kan være en sterk prognose biomarkør.
Metoder
Vevsprøver fra 45 kreftpasienter pankreas ble studert. Parenchyma og stroma ble separert og renset ved hjelp av laser fange mikrodisseksjon. Stromal Cav-1 uttrykk ble målt fra kreft i bukspyttkjertelen, paraneoplastic, og normalt vev ved hjelp av immunhistokjemi. Vi analyserte sammenhengen av stromal Cav-1 uttrykk med clinicopathologic funksjoner og prognostiske indikatorer, som for eksempel svulst markør HER-2 /neu genet.
Resultater
Prøver fra seks pasienter (13,3%) viste høye nivåer av stromal Cav-1-farging, de fra åtte pasienter (17,8%) viste et lavere, mellomliggende nivå av flekker, mens de fra 31 pasienter (68,9%) viste et fravær av farging. CAV-1-ekspresjon i kreft-assosiert fibroblaster var lavere enn den i paracancer-assosiert og i normale fibroblaster. Stromal Cav-1 tap ble assosiert med TNM stadium (
P =
0,018), lymfeknutemetastase (
P
= 0,014), fjernmetastaser (
P
= 0,027) og HER-2 /neu forsterkning (
P
= 0,007). Forholdet til alder, kjønn, histologisk grad, og tumor størrelse med stromal Cav-1 uttrykk var ikke signifikant (
P
0,05). En negativ korrelasjon ble funnet mellom sirkulerende tumorceller og stromale Cav-1 uttrykk (
P
0,05).
Konklusjon
Tapet av stromal Cav-1 i bukspyttkjertelen kreft var et uavhengig prognostisk indikator, slik som tyder på at stromal Cav-1 kan være et effektivt terapeutisk mål for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
relasjon:. Shan T, Lu H, Ji H, Li Y, Guo J, Chen X, et al. (2014) Tap av stromal Caveolin-1 Expression: A Novel svulstens mikromiljø Biomarker som kan forutsi dårlige kliniske utfall for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (6): e97239. doi: 10,1371 /journal.pone.0097239
Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrike
mottatt: 25 oktober 2013; Godkjent: 16 april 2014; Publisert: 20 juni 2014
Copyright: © 2014 Shan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Scientific Hotel Shaanxi (2012SXKG-21). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen har en overlevelse på mindre enn 25% på fem år etter delvis pancreaticoduodenectomy og er en av de mest aggressive og vanskelige menneskelige ondartede svulster [1]. Nyere studier har vist at mikromiljøet tjener en funksjon i utviklingen av ondartede epiteltumorer, og således fremhever betydningen av forståelsen av stromale celler i forebygging av kreftcelle aggresjon og anti-kreft-behandling strategier [2]. For å forstå fullt ut mekanismen drivende tumorresidiv, metastase, og klinisk resultat hos kreftpasienter, må rollen av tumoren mikromiljøet skal undersøkes. Spesielt kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) er blitt funnet å betjene en viktig funksjon ved parakrine interaksjoner med tilstøtende epiteliale kreftceller [3], [4].
Caveolins (CAV) utgjør en familie av proteiner stillas at pelsen 50 nm til 100 nm plasma membran invaginations [5]. Den Cav familie består av tre isoformer: CAV-1, CAV-2, og Cav-3. CAV-1-genet er lokalisert i kromosom 7 (locus 7q31.1) og omfatter tre eksoner (30, 165, og 342 bp) og to introner (1,5 og 32 kb). CAV-1 er en strukturell komponent av caveolae involvert i forskjellige cellulære funksjoner, slik som vesikulært transport, kolesterol homeostase, og signaltransduksjon [6]. Til tross for en økende mengde bevis på Cav-en innblanding i tumorigenesis, om Cav-en fungerer som en tumor suppressor eller som et onkogen er fortsatt uklart. Disse motstridende resultater er sannsynligvis avledet fra studiet av ondartede epiteltumorer [7], [8], [9]. En ny paradigme av «the autophagic tumor stroma modell av kreft metabolisme» ble nylig introdusert for å lette forståelsen av funksjonen av tumor microenvironments [10], [11]. I denne modellen tapet av stromal Cav-en som en sentral regulator er et potensielt mål terapi, som tyder således den prognostiske betydningen av stromal Cav-1 [12]. Tap av stromal Cav-en er den eneste uavhengige prediktor for tidlig brystkreft tilbakefall og progresjon [7]. Ayala et al. rapportert at tap av stromal Cav-en har bidratt til metastatisk oppførselen til prostatakreftceller gjennom en mekanisme som involverer oppregulering av TGF-β1 og SNCG gjennom Akt aktivering [13]. Zhao et al. rapportert at Cav-1-ekspresjon nivå i kafeer forutsagte magekreft utbytte [14]. Karen et al. uttalte at tapet av stromal Cav-1 uttrykk i malignt melanom metastaser spådd dårlig overlevelse [15]. Imidlertid stromal Cav-1-ekspresjon i bukspyttkjertelkreft, så vel som dens kliniske signifikans, er fortsatt uklar. For å belyse funksjonen av stromal Cav-1 i kreft i bukspyttkjertelen, undersøkte vi stromal Cav-1-ekspresjon i bukspyttkjertelkreft prøver, sammen med korrelasjonen av stromal Cav-1-ekspresjonen med tumor markør HER-2 /neu og et antall sirkulerende tumor celler (CTCs).
Materialer og metoder
pasientprøver
fra januar 2007 til desember 2012, kreft i bukspyttkjertelen vev (inkludert tilstrekkelig store kreft vevsprøver og vevsprøver hentet fra områder innenfor 2,0 cm av svulsten) ble oppnådd fra 45 pasienter som gjennomgår delvis pancreaticoduodenectomy (Whipple reseksjon) for kreft i bukspyttkjertelen ved Institutt for Hepatobiliær og bukspyttkjertelen kirurgi, første og andre tilknyttede sykehus av Xi’an Jiaotong University. En porsjon av hver prøve ble frosset og forberedt for laser-fangst mikrodisseksjon (LCM); andre prøve porsjoner ble fiksert med 10% formalin for histologiske studier. Ti prøver som inneholder normale bukspyttkjertelen vev fra pasienter som fikk delvis pancreatectomy for godartede svulster ble brukt som normale kontroller. Av de 45 studiepasienter, 24 var menn, og 21 var kvinner. Median alder på tidspunktet for operasjonen var 64,5 år (fra 44 år til 82 år). Alle 45 pasienter hadde bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom. Tumor scenen og histopatologiske gradering ble registrert i henhold til klassifiseringen av International Union Against Cancer. Tre pasienter hadde stadium I svulster, 11 hadde stadium II, 27 hadde stadium III, og 4 pasienter hadde stadium IV svulster. Histologiske tumor karakterer var som følger: 7 pasienter grad I, 20 hadde klasse II, og 18 hadde klasse III svulster. Alle pasienter deltok i oppfølgingsprosedyre. Median tid for oppfølging var 22 måneder (variasjon fra 4 måneder til 52 måneder). Disse prøvene ble hentet fra givere eller pårørende som har signert et skriftlig informert samtykke. Studiene ble godkjent av Institutional Review Board og etikkomiteen av Xi’an Jiaotong University, Kina.
Immunohistochemistry
Cav-1 protein ble oppdaget av immunhistokjemi hjelp av standardiserte streptavidin-peroksidase metoden. Vevssnitt (4 um) ble inkubert over natten med en standard primær antistoffkonsentrasjon. Platene ble inkubert i 30 minutter med biotinylert geite-anti-kanin-IgG, fulgt av inkubering med peroksidase-konjugert streptavidin i 20 minutter ved romtemperatur. Fargen ble utviklet ved bruk av 0,02% oppløsning av 3, 3′-diaminobenzidin i 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,6) i 5 min til 7 min. Til slutt ble seksjonene kontra med hematoksylin, skylles med vann, dehydrert, ryddet, og dekselet sklei. I negative kontroller for farging, ble det primære antistoff erstattet med ikke-immun geite- eller kanin serum. Antallet fargede celler pr 1000, ble bestemt under et mikroskop (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan) i tre synsfelt, ved en forstørrelse på x 400. Når det totale antall celler observert under mikroskopet var mindre enn 1000, ble alle celler tellet. Farging ble bedømt semikvantitativt som negativ (0; ingen farging), svak (1; enten diffunderer svak farging eller sterk farging på mindre enn 30% av stromale celler), eller sterk (2, definert som sterk farging av 30% eller mer av stromale celler). Antistoffer mot Cav-en, vimentin, og β-aktin ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA eller Santa Cruz, California, USA).
LCM
Frysesnitt (5 mikrometer tykk ) av kreft i bukspyttkjertelen, paraneoplastic, og normalt vev ble microdissected bruker en PixCell II LCM system (Arcturus Engineering, Mountain View, California, USA). Laseren fange systemet var utstyrt med PixCell II bildearkivering programvare. Innstillingene for laseren var som følger: flekk diameter på 15 um, pulsvarighet på 50 ms, og strømmen innstilt på 50 mW. Vevet ble microdissected til 10 deler av hver prøve med en egen «cap» benyttes for å fange opp materialet fra hver seksjon. Typisk ble 2500 til 3000 laserpulser anvendt for hver hette. Etter mikrodisseksjon ble plastfilm inneholdende de microdissected cellene fjernet fra resten av hetten, og alle filmer inneholdende materiale fra en enkelt prøve ble plassert i et mikrosentrifugerør og frosset i flytende nitrogen eller lagret ved -80 ° C i mRNA-ekstraksjon . Frysesnitt ble kuttet på en cryostat. Snittene ble tint og montert på ubestrøket glass. De frosne seksjoner ble fiksert i 70% etanol i 30 s og farget med H E, etterfulgt av tre dehydrering trinn på 5 s hver i 70%, 95% og 99,5% ethanol, og endelig 5 min dehydrering i xylen. To viktige faktorer for å sikre tilfredsstillende mikrodisseksjon og kontroll av utvalgsskjevhet ved hjelp LCM er: (1) behovet for en trenet patolog for å diskriminere spesifikke bestander av syke celler, for eksempel kafeer, visuelt; og (2) fravær av dekkglass i å analysere microdissected vev delen. Fraværet av et dekkglass og indekstilpasning mellom monterings media og vev føre det tørre vev delen for å ha en reflekterende kvalitet som tilslører cellulær detalj ved store forstørrelser. For å bedre visualisering, er en dråpe xylen lagt til vev for å gi fukting og legge til rette for brytningsindeks matching.
RT-PCR og Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra bukspyttkjertelen svulst, paraneoplastic, og prøver normalt vev ved hjelp TRIzol reagens (Gibco BRL, Rednings Technology, Grand Island, New York, USA).
Første tråd cDNA ble syntetisert fra 2 mikrogram total RNA bruker RevertAid Kit ( Fermentas MBI, Waltham, Massachusetts, USA). PCR primersett ble utviklet som følger: 1) for Cav-en (140 bp), videresender CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 «og 5′-revers CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3′; og 2) for β-aktin (179 bp), frem til 5»-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 «og 5′-revers AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3». PCR-betingelser omfattet et innledende denatureringstrinn i 5 minutter ved 94 ° C etterfulgt av 22 sykluser med amplifikasjon: 30 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 55 ° C og 30 sek ved 72 ° C. Etter den siste syklus, ble en endelig forlengelse utført ved 72 ° C i 10 min. Husholdningsgenet, β-aktin ble benyttet som en intern kontroll.
Sanntids kvantitativ PCR ble utført med platina SYBR grønn qPCR SuperMix UDG (Invitrogen, USA) ved bruk av Rotor-Gene RG-3000 (Corbett forskning, Doncaster Victoria, Australia). For hver amplikon, ble mengden av Cav-1 og β-actin bestemmes fra en standard kurve generert ved seriell fortynning. Før amplifisering, ble prøvene inkubert ved 95 ° C i 10 minutter, og hver forsterkning syklus besto av denaturering i 45 sekunder ved 95 ° C, glødning i 30 sekunder ved 57 ° C, og forlengelse i 30 sek ved 73 ° C. Mengden av mål-gener i cDNA-prøvene ble beregnet på grunnlag av terskelen syklus (Ct). PCR-signalene ble kvantifisert ved densitometrisk analyse ved hjelp Antall En analyse programvare.
Isolering og kultur av primære humane fibroblaster
kafeer og normale fibroblaster (NFS) ble isolert fra kreft i bukspyttkjertelen og ikke-kreft delvis pankreasreseksjon prøver, henholdsvis. Prøvene ble oppsamlet og overført til laboratoriet. Etter flere vaskinger med steril fosfatbufret saltløsning (PBS), 1 cm
2 deler av vevene ble plassert i brønnene i kulturflasker. Når vevet først å feste til kolbene (5 timer til 6 timer), var Dulbeccos modifiserte Eagle medium inneholdende 10% føtalt bovint serum tilsatt. Prøvene ble inspisert daglig i fremveksten av fibroblaster, og mediet ble skiftet etter 24 timer, og hver tredje dag deretter. Vevsprøver ble fjernet fra kulturene når fibroblaster nådde 70% konfluens (ca. to uker), og fibroblaster ble overført til store vevskultur fartøy. Alle fibroblaster brukt i denne studien var fra passasjer 3 til 5. fibroblaster ble verifisert av vimentin positiv immunhistokjemi farging.
immunfluorescens analyse
eksponentielt voksende celler ble sådd på 25 mm firkant glass dekkglass som plasseres i 35 mm diameter kultur retter. Etter behandling ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i 5 minutter, permeabilisert med 0,2% oppløsning av Triton X-100 i PBS og blokkert med 2% bovint serumalbumin (BSA) -PBS i 30 minutter. Glassene ble inkubert med anti-Cav-en over natten. Fluorescerende avbildning ble oppnådd med en konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).
Fluorescens in situ hybridisering
HER-2 /neu genet ble forsterket med dual-farge (fluorescens i situ hybridisering) FISH bruke en Passvision HER-2 DNA probe kit (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble 4 um tykke vevssnitt bakes over natten ved 56 ° C og ble utsatt for deparaffinization, enzymoppslutning, og fiksering. Objektglassene ble deretter denaturert i 70% formamid /to-tidsstandard saltvann citrat ved 72 ° C i 5 minutter. Etter vask buffer, ble 10 ul av en blanding av to direkte merkede prober (HER-2 /neu spesifikke sekvens probe) tilsatt til vevssnittene, og hybridisering ble utført ved 37 ° C i 14 timer til 18 timer. Objektglassene ble deretter vasket i en post-hybridisering vask ved 72 ° C, motfarget med 4, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), montert og lagret i mørke før signalet telling. HER-2 /neu-spektrum orange sonde inneholder en DNA-sekvens som er spesifikke for HER-2 /neu gen locus og hybridisert til regionen 17q11.2-q12 av humane kromosomer. Kromosom opplisting sonde 17 (CEP17) /Spektrum grønn probe inneholdende alfa-satellitt-DNA som hybridiserer til de D17Z1 locus (cent region av kromosom 17) ble anvendt som kontroll. Skinnene ble observert etter fluorescens mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (DP50, Olympus, Tokyo, Japan). For hver prøve ble genamplifikasjon mottok når et minimum 20 kreftcellekjerner oppviste et HER-2 /CEP17 forholdet ≥2 eller når et HER-2 signal klynge ble observert.
blodprøvetaking og Anrikning av CTCs
Samtykke skjemaer ble godkjent av etikk Review Committee for Human Emner Committee of Xi’an Jiaotong University, Kina og signert av alle studie pasienter. Først ble 7,5 ml prøver av perifert blod samles i BD Vacutainer-rør (Becton, Dickinson and Company, Franklin, New Jersey, USA) og vasket med PBS. For å unngå epitelcelle forurensning ved venepunksjon, ble alle prøver innsamlet etter kassering av de første 2 ml blod. Røde blodceller (RBC) ble blandet med 45 ml lyseringsbuffer (155 mM NH
4Cl, 10 mM KHCO
3, 0,1 mM EDTA), fulgt av rotasjon i 8 minutter og sentrifugering (600 g i 5 min ) for å fjerne røde blodceller. Den resulterende cellepellet ble resuspendert i PBS og deretter inkubert med 0,5 ml av markør antileukocyte overflate CD45 monoklonale antistoff-belagte magnetiske kuler i 30 minutter, etterfulgt av separering av magnetiske kuler ved hjelp av et magnetisk stativ (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Supernatanter ble overført til et nytt rør, og deretter sentrifugert ved 800 g i 3 min. Celle pellets ble oppdaget på objektglass, fulgte med (immunfluorescens in situ hybridisering) imFISH farging.
imFISH Farging (CEP8-CD45-DAPI)
Negativ berikelse av tumorceller ble utført ved hjelp immunomagnetisk perler, etterfulgt av identifikasjon med cytologi analyse. Fisk ble utført ved anvendelse av cent DNA-prober i kromosom 8 (gul) (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA), og immunofluorescens-analysen ble utført ved å bruke anti-CD45 (rød) (Santa Cruz, California, USA). Objektglassene ble vasket tre ganger med tris-bufret saltvann (TBS) (10 mM Tris, 2,8 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende 0,2% BSA i 3 minutter og deretter skylt med TBS gang. Celler ble montert sammen med monteringsmedium inneholdende kjernefysiske fargestoff DAPI. En blindet gjennomgang av fluorescerende bilder av tre teknikere bekreftet identiteten til CTCs fra tre-farge fluorescerende bilder som ble forstørret 400 ganger. Evalueringskriterier for CTC identifikasjon fra fluorescerende bilder tatt med både CEP8≥3 og CD45 (-) fargemønster overliggende DAPI farging av kjernen
Statistisk analyse og Patient Outcome
Data ble analysert ved hjelp. chi-kvadrat test (χ2) eller tosidig Fisher eksakt test, som passer. Pearson korrelasjonskoeffisient ble anvendt for å måle styrken av foreningen mellom Cav-1, telling av CTCs, og HER-2 /neu ekspresjonsnivåer. Overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene ble undersøkt av log-rank test. Faktorer funnet å være av betydning ble deretter valgt for en trinnvis Cox «multivariate proporsjonal risikomodell for å bestemme deres prognostiske verdier.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 13.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).
Resultater
Expression of stromal Cav-en i bukspyttkjertelen
Cav-en er uttrykt både på membranen og i cytoplasma av celler [16]. For å undersøke uttrykket status for stromal Cav-en i kreft i bukspyttkjertelen, brukte vi immunhistokjemi for å evaluere kreft i bukspyttkjertelen, paraneoplastic, og normale deler vev. Våre resultater viste representative bilder av CAV-1 antistoff farget vevssnitt (fig. 1), for således å fremheve forskjellene observert i Cav-1-immunfarging i det fibroblastiske stromal rommet. Interessant, Cav-1 uttrykk var sterk og begrenset hovedsakelig til stroma i paraneoplastic og normalt vev, men ble bare påvist sporadisk i tumor stroma. I 45 kreftprøvene 6 (13,3%) pasienter viste høye nivåer av stromal Cav-1-farging, mens 8 (17,8%) viste en lavere mellomliggende grad av farging, og 31 (68,9%) viste et fravær av stromal Cav-1-farging .
Parafin-snitt ble immunofarget som beskrevet i metodedelen. (N) Normal vev sterkt positiv for Cav-1 uttrykk; (P) Paracancer vev moderat for Cav-1 uttrykk; (C) svulstvev med negative Cav-1 uttrykk (× 400).
PCR Analyser i Laser Captured Prøver
Tap av stromal Cav-en er en enkelt selvstendig prediktor for tidlig brystkreft og progresjon [17]. Vår immunhistokjemisk data viste også lavere stromal Cav-1 uttrykk i bukspyttkjertelkreft. For å verifisere immunhistokjemiske data videre, vi separert og renset stroma hjelp LCM. Stroma celler av bukspyttkjertelen prøver ble microdissected vellykket fra svulsten, paraneoplastic, og normale deler. LCM teknikk forårsaket ingen synlig forandring i morfologien av de dissekerte prøver (fig. 2A). Vi sekvensielt analyserte mRNA uttrykk for Cav-en i laser-fanget stroma prøver ved RT-PCR og Real-time PCR (qPCR). MRNA nivået av Cav-en var signifikant dårligere i laser-fanget tumor stroma prøvene sammenlignet med paraneoplastic og normalt vev (figur 2B, 2C.) (
P
0,05).
A: Prinsippskisse som representerer LCM teknikk. B: mRNA uttrykk for stromal Cav-en i laser-fanget prøver som fastsatt av RT-PCR. C: Kvantifisering av mRNA ved hjelp av sanntids-kvantitativ PCR. Data fra minst tre uavhengige eksperimenter med duplikate bestemmelser er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (N) Normal vev; (P) Paracancer vev; (C) tumorvev. *
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Uttrykk for Cav-en i kafeer, PAFs, og NFS
For å forstå videre stromal Cav-. 1 protein uttrykk i bukspyttkjertelen stroma (for det meste fibrocytt), vi først hentet kafeer fra kreft i bukspyttkjertelen celler, paracancer-assosiert fibroblaster (PAFs), paracancerous vev og NFS fra ikke-kreft delvis pancreatectomy prøver. Ulike vimentin uttrykk nivåer i stroma kafeer, PAFs og NFS ble vurdert ved immunhistokjemi analyse. Disse resultatene også bekreftet at vår celle utvinning var vellykket (fig. 3A, 3B). Deretter fant vi ut og analysert stromal Cav-1 uttrykk i kafeer og NFS farget med fluoresceinisotiocyanat merking-IgG antistoff av konfokal mikroskopi. Cav-en fluorescens signal i kafeer var lavere enn i PAF og NF prøver (figur 3C.), Noe som tyder på at Cav-en er tapt i en bukspyttkjertelkreft mikro
A:. Cell morfologisk karakteristikk av kafeer, PAFs, og NFS (× 100). Hentet kafeer fra kreft i bukspyttkjertelen og PAFs og NFS fra paracancerous vev og ikke-kreft delvis pankreasreseksjon prøver. B: Ulike vimentin uttrykk nivåer i stroma kafeer, PAFs og NFS ble vurdert ved immunhistokjemi (× 200). C: Cav-1 protein uttrykk i kafeer og NFS farget med FITC merking-IgG antistoff og analysert ved konfokalmikroskopi. Cav-en fluorescens signal i CAF er lavere enn i PAFs og NFS (× 200). (kafeer) Kreft assosiert fibroblaster; (PAFs) Paracancerous assosiert fibroblaster; (NFS) Normal assosiert fibroblaster.
Relasjoner mellom stromal Cav-1 Expression og Clinicopathological Parametere
Tabell 1 oppsummerer sammenslutninger av stromal Cav-1 protein uttrykk og clinicopathological parametere i kreft i bukspyttkjertelen . Den stromal Cav-1 tap ble sett i seks av 14 stadium I og II tilfeller (42,9%) og var betydelig lavere enn i fase III (77,8%, 21 av 27 tilfeller) og stadium IV tilfeller (100,0%, 4 av 4 tilfeller ) (
P =
0,018). Stromal Cav-1 tap var også assosiert med lymfeknutemetastase (
P
= 0,014) og fjernmetastaser (
P
= 0,027). Vi har også undersøkt forholdet av alder, kjønn, histologiske grad, og tumorstørrelse med stromal Cav-1-ekspresjon. Men statistisk signifikante sammenhenger ble ikke observert (
P
0,05).
Tap av stromal Cav-en korrelerer med HER-2 /neu Gene Amplification
HER-2 /neu er et transvekstfaktor reseptor, overekspresjon av som er anerkjent som en selvstendig negativ prognostisk faktor i flere kreftformer, blant annet kreft i bukspyttkjertelen [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25]. Å utforske videre om stromal Cav-1 tap er en negativ prognostisk biomarkør i kreft i bukspyttkjertelen, ble sammenhengen mellom stromal Cav-1 uttrykk og HER-2 /neu genamplifisering analysert. HER-2 /neu gen amplifisering ble evaluert ved hjelp av FISH, som anses gullstandarden for å måle prosentandelen av positive celler. Våre resultater viste at 64,4% av pankreas adenocarcinomer oppviste HER-2 /neu genamplifikasjon (fig. 4). Stromal Cav-1 tap hadde en positiv sammenheng med HER-2 /neu genet forsterkning (r = -0,697,
P
= 0.000, tabell 2). Firedobbelt stromal Cav-en tap ble observert i prøvene som viser HER-2 /neu genamplifikasjon. I motsetning i peritumoral og normale prøver, stromal Cav-1-ekspresjonen var høy når HER-2 /neu genet ikke ble amplifisert. Som konklusjon, ble stromal Cav-en tap positivt korrelert med forsterkning av HER-2 /neu genet
(N) Normalt vev negativ for HER-2 /neu genamplifikasjon.; (P) Paracancer vev moderat for HER-2 /neu gen amplifisering; (C) svulstvev positive for HER-2 /neu genet forsterkning (× 1000).
Tap av stromal Cav-en korrelerer med CTC oppregning
CTCs er svulst celler utøst fra den primære svulsten inn i sirkulerende blod. Tilstedeværelsen av CTCs i det perifere blod hos pasienter har vært forbundet med metastase og dårlig overlevelse, selv om den biologiske betydning av CTCs tilskrives tumor genomiske ustabilitet og potensielle metastatisk ineffektivitet har vært diskutert i [26]. Basert på klinisk relevans, er CTC anbefalt av American Society of Clinical Oncology å være en akseptabel kreftmarkør [27]. Å utforske videre om stromal Cav-1 tap er en negativ prognostisk biomarkør, ble sammenhengen mellom stromal Cav-1 uttrykk og CTC telling analysert. Våre resultater viste at CTCs ble detektert på 35,71% (5/14) av kreft i bukspyttkjertelen hos pasienter med stromal Cav-1-ekspresjonen sammenlignet med 77,42% (24/31) av pasientene med stromal Cav-en tap (fig. 5). Dessuten, var signifikant høyere CTC oppregning observert hos pasienter med stromal Cav-en tap enn i pasienter med stromal Cav-1-ekspresjonen (18,5 ± 2,0 i 7,5 ml blod vs 6,0 ± 1,5 i 7,5 ml blod). Avslutningsvis ble stromal Cav-1 tap positivt korrelert med CTC oppregning
A:. CTCs negativ hos pasienter med stromal Cav-1 tap. B: CTCs positive pasienter med stromal Cav-en tap. C: CTCs negative pasienter med stromal Cav-1-ekspresjon. D: CTCs positive pasienter med stromal Cav-1-ekspresjon. Den hvite skala linjen viser 10 mikrometer (x400).
Prognostiske verdier av tap av stromal Cav-1 i pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
For å finne den prognostiske verdien av stromal Cav-en for kreft i bukspyttkjertelen, analyserte vi den kumulative overlevelse av pasienter ifølge deres Cav-1-status (fig. 6). Stromal Cav-1 fravær, som vist ved mangel på farging, ble ansett som negativt, mens svak eller sterk farging ble betraktet som positiv. Akkumulert overlevelse i stromal Cav-1 negative pasienter (n = 31) på tre år var 8,8% (median overlevelse på 16 måneder). I motsetning til dette, den kumulative overlevelsen i stromale Cav-1-positive pasienter (n = 14) var 20,2% (gjennomsnittlig overlevelsestid på 28 måneder), en forskjell som var statistisk signifikant (
P
0,05).
Basert på multivariat analyse, sammendraget OR av lymfeknutemetastaser på kumulative overlevelses ganger på tre år var 1,32 (95% KI, 1,10 til 1,63), og TNM (III + IV /II + i ) stadium (OR = 1,27, 95% KI, 1,15 til 1,46) var en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse tid i studie pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Tapet av stromal Cav-1 protein var også en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse tid (
P =
0.006). Men svulst diameter og andre kliniske parametre var avhengige prognostiske faktorer.
Diskusjon
Solide svulster er ikke lenger anses bare som klonal utvidelser av kreftceller. I tillegg til ervervet celle iboende egenskaper, er startfasen og vekst støttes av en overflod av parenkymatøs, provoserende, og stromal celletyper, som infiltrerer og omslutter svulsten [28]. Våre funn markere betydningen av et utviklende mikromiljøet og foreslår at behandling bør målrette både neoplastiske celler og støttende stromale celler [29]. Den autophagic tumor stroma modell av kreft metabolismen [30] tyder på at tapet av stromal Cav-en som en sentral regulator er et potensielt mål terapi, som tyder på at ytterligere stromal Cav-1-ekspresjon i stromale celler kan være av prognostisk betydning. Videre har et tap av stromal Cav-1 er rapportert å være en prediktor for tidlig tumorresidiv, lymfeknutemetastase, tamoxifen motstand, og dårlig klinisk resultat i humane brystcancerpasienter [17]. Vi undersøkte stromal Cav-1 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen for å vurdere en mulig rolle for stromal Cav-en som en prognostisk markør. Stromal Cav-en ble nedregulert i bukspyttkjertelkreft sammenlignet med paraneoplastic og normalt vev. Tap av stromal Cav-en er nært korrelert med avansert TNM stadium, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser, og dårlig prognose. Tapet av stromal Cav-1 ble korrelert med amplifikasjon av klassiske markører for tumorprogresjon (HER-2 /neu genet). Enda viktigere, var tapet av stromal Cav-1 assosiert med metastase, fordi sirkulerende tumorceller ble funnet i pasientens blod. Disse funnene utvide vår forståelse av funksjonen av stromal Cav-en som en diagnostisk markør. Viktigst, så vidt vi vet, er denne studien den første til å vise at tap av stromal Cav-1 i kreft i bukspyttkjertelen er en negativ prognostisk indikator. Imidlertid er arbeidet med Witkiewicz et al. [31] viste at co-uttrykk for FASN og Cav-en kan være en informativ klinisk markør. Witkiewicz et al. fant at Cav-en og FASN hadde høyere uttrykk i PDAer enn i Panin. I tillegg til farging av neoplastiske epitelceller, Cav-1 var også til stede i fibroblaster av desmoplastic kreft stroma. Stromale celler i normal bukspyttkjertel eller kronisk pankreatitt vev tilstøtende til tumorceller var negative, noe som står i kontrast til våre funn. Denne forskjellen kan skyldes den mulighet at studie av Witkiewicz et al. Det oppsto under immunolocalization av de to molekyler (FASN og CAV-1), og resultatet kan tilskrives gjensidig interferens. Videre er det anvendt Cav-1 Ab hadde en annen spesifisitet. Metoden som brukes av Witkiewicz et al. (Immunhistokjemi) er forskjellig fra den som anvendes i denne studien, hvor PCR ble anvendt med hensyn til kvantifisering. Endelig kan prøve heterogenitet har også påvirket resultatene. Selv om funnene i Witkiewicz et al. [17] er i samsvar med de av vår studie, videre studier bør gjennomføres på dette temaet.
CTCs er kreftceller utøst fra den primære svulsten i blodsirkulasjonen. Tilstedeværelsen av CTCs i det perifere blod hos pasienter har lenge vært assosiert med metastase og dårlig overlevelse [32] og blir nå betraktet som en akseptabel kreftmarkør [27]. Imidlertid, nåværende teknikker er begrenset. Den eneste kommersielt tilgjengelige CTC test (Cell Søk; Veridex LLC, North Raritan, New Jersey, USA) har en oppklaringsprosenten på 50% i sene stadier av pasienter [33].
