Abstract
microRNAs (Mirs) er små, endogene, ikke-kodende RNA som regulerer stabilitet og /eller oversettelse av komplementære mRNA mål. Mirs har dukket opp ikke bare som kritiske modulatorer av normale fysiologiske prosesser, men deres deregulering kan ha betydelig innvirkning prostata og andre kreftformer. Ekspresjonen av MIR-23b og MIR-27b, som er kodet av den samme MIR klynge (MIR-23b /-27b), er nedregulert i metastatisk, kastrerings-resistente svulster i forhold til primær prostatakreft og godartet vev; men deres mulige rolle i prostata kreft progresjon er ukjent. Vi fant at ektopisk ekspresjon av MIR-23b /-27b i to uavhengige kastreringsresistent prostatakreftcellelinjer førte til undertrykkelse av invasjon og migrasjon, samt redusert overlevelse i bløt agar (et mål på anoikis). Men var det ingen effekt av MIR-23b /-27b på celleproliferasjon tyder på at disse Mirs fungere som metastaser (men ikke vekst) dempere i prostatakreft. Omvendt, inhibering av MIR-23b /-27b i mindre aggressive androgen-avhengige prostatacancer LNCaP-cellelinje resulterte i økt invasjon og migrasjon også uten å påvirke proliferasjon. Mekanistisk, fant vi at innføringen av MIR-23b /-27b i metastatisk, kastreringsresistent prostatakreft cellelinjer resulterte i en betydelig svekkelse av Rac1 aktivitet uten at det påvirker total Rac1 nivåer og forårsaket økte nivåer av svulsten suppressor E-cadherin. Hemming av disse Mirs hadde motsatt effekt i androgen-avhengige LNCaP celler. Disse resultatene tyder på at Mir-23b /-27b er metastasedempere som kan tjene som nye biomarkører og terapeutiske midler for kastrering-resistent sykdom
Citation. Ishteiwy RA, Ward TM, Dykxhoorn DM, Burnstein KL (2012) den mikroRNA -23b /-27b Cluster Undertrykker metastatisk Phenotype av kastrering resistent prostatakreft celler. PLoS ONE 7 (12): e52106. doi: 10,1371 /journal.pone.0052106
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 31 juli 2012; Godkjent: 09.11.2012; Publisert: 26.12.2012
Copyright: © 2012 Ishteiwy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant CA132200 (til KLB) og DOD Pre-forskerutdanning stipend w81xwh-11-1-0314 (RAI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
for over et halvt århundre, androgen deprivasjon har vært standard behandling ved avansert og metastatisk prostatakreft, som svulster er i utgangspunktet avhengig av androgener for overlevelse og vekst. Dessverre, i de fleste pasienter, svulster slutt utvikle seg til en uhelbredelig, kastrering-resistent og metastatisk form. Derfor er effektive nye behandlingsformer og nøyaktige prognostiske indikatorer for å forbedre klinisk vare på menn med prostatakreft.
metastaser, et kjennetegn på malignitet, er migrering av kreftceller via blodet eller lymfesystemet fra den opprinnelige svulsten området for å fjerne organer. Metastatisk utviklingen går gjennom en flertrinnsprosess som omfatter lokal invasjon, bevegelse inn i blodet (intravasation), overlevelse i sirkulasjon, exit fra blodkar (ekstravasasjon), initiering og vedlikehold av mikrometastaser i fjerne områder, og til slutt, vaskularisering av de nye svulster [ ,,,0],1]. For å fortsette ned denne metastatisk kaskade, primærtumorceller akkumulere genetiske og epigenetiske endringer, herunder dereguleringen av miRNA uttrykk mønstre. Belyse mekanismene som letter kreft celle migrasjon og invasjon er et hovedmål for kreftforskning, som metastaser forblir årsaken til 90% av dødsfallene fra solide tumorer [1]. Median overlevelse for pasienter med lokalisert prostatakreft er større enn 5 år, mens menn med metastatisk sykdom har vesentlig redusert overlevelse [1].
microRNAs (Mirs), liten kodende 18- til 24-nukleotid RNA, er forutsagt for å regulere ekspresjon av mer enn 90% av protein-kodende gener, for derved å påvirke diverse cellulære og molekylære prosesser [2]. Mirs modulere mRNA nivåer og oversettelses gjennom kanoniske baseparing mellom frøet sekvens av miRNA (nukleotider 2-8 på 5’end) og de komplementære frø kamp sekvenser av målet mRNA, som vanligvis ligger i 3 «uoversatt region (UTR ) [3]. MicroRNAs slå deres beslektede mål ved mRNA spaltning, translasjonell undertrykkelse, mRNA destabilisering eller en kombinasjon av disse mekanismer [4]. Mer enn 50% av merket humane mir gener er lokalisert i kromosomale regioner som er utsatt for amplifikasjon, delesjon eller translokasjon i løpet av tumorutvikling [5]. Mirs spille en avgjørende rolle i metastase, trolig på grunn av deres evne til å poste-transcriptionally regulere gen-nettverk viktige for celle invasjon, motilitet og migrasjon [6].
biogenesis av Mirs er en svært regulert, flertrinnsprosessen [ ,,,0],7]. Over 40% av menneskelige Mirs er organisert i evolusjonært konserverte klynger, som er cotranscribed som diskret polycistronic pri-miRNAs. Et stort antall Mirs og MIR klynger er deregulert i onkogenese og metastatisk utvikling [8].
MiR-23b og MIR-27b, som omfatter en klynge på menneskelig kromosom 9, er spesielt nedregulert i menneskelig kastrering -resistente prostatakreft (CRPC) kliniske prøver [9] – [12], så vel som i cellemodeller av CRPC [10], [13]. Interessant, Sun et al. [12] fant at MIR-23b /-27b uttrykk er betydelig redusert (2,8 ganger) i primærsvulster (i forhold til nærliggende normalt vev) og er videre redusert med 3,2 ganger i metastatiske CRPC prøver. I denne studien, 15 av 17 CRPC tumorprøver viste nedregulering av MIR-23b /-27b i forhold til primærtumorprøver [12]. Til tross for korrelasjonen av redusert MIR-23b /-27b med økt sykdoms patogenesen, rollen MIR-23b /-27b i CRPC metastatisk sykdom har ikke vært godt karakterisert. Her gir vi bevis for at MIR-23b /-27b undertrykker viktige metastatiske prosesser inkludert celle invasjon, migrasjon og forankringsuavhengig overleve uten å påvirke celledeling. Disse effektene er ledsaget av økte E-cadherin nivåer og demping av Rac1 aktivitet
E-cadherin, en celle adhesjon molekyl, undertrykker invasiv og vandrende fenotype av kreftceller [14] -. [17]. Tap av E-cadherin er vanligvis assosiert med tumor invasivitet, metastatisk spredning og dårlig prognose pasient i en rekke kreftformer, inkludert prostata. For eksempel tap av E-cadherin overfører metastatisk evne til relativt ikke-aggressive, forvandlet bryst epitelceller [16]. Videre oppviser E-cadherin negative celler økt invasjon og metastatisk potensiale, sammenlignet med E-cadherin-positive celler i Dunning rotteprostatatumormodell [14], [15], [18]. Rho GTPase Rac1, som regulerer cytoskjelett rearrangements nødvendige for cellemigrasjon, er sterkt assosiert med aggressiv prostatakreft [19] – [22]. Forhøyet Rac1 er nødvendig for invasiv oppførsel av den humane prostatacancer-cellelinjen PC3 [23]. Dermed data som presenteres her er konsistent med en rolle for Mir-23b /-27b klynge i metastase undertrykkelse via effekter på E-cadherin og Rac1.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer ALVA31 (hentet fra legene. Stephen Loop og Richard Østensen, Department of Veteran Affairs Medical Center, Tacoma, WA) [24], LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, VA), PC3 -ML (oppnådd fra Dr. Alessandro Fatatis, Drexel University College of Medicine) [25] ble passert, og opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin, 100 pg /ml streptomycin, og 100 g /ml L-glutamin. Alle kulturene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
RNA Isolation og kvantitative RT-PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Mirvana miRNA isolasjon kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Den TaqMan stilk-løkke RT-PCR-metoden bruker Taqman® miRNA revers transkripsjon kit og Taqman® miRNA analyser (Applied Biosystems) ble brukt for å vurdere uttrykket av MIR-27b.U6 liten kjernefysiske RNA fungerte som en intern kontroll for alle eksperimenter .
Immunoblotting
Cellulære proteiner ble ekstrahert og separert på SDS-PAGE-geler, og western blot analyser ble utført i henhold til standardprosedyrer. Western blotting av β-actin på den samme membranen ble anvendt som en kontroll lasting. Antistoffene som ble brukt var anti-E-cadherin (BD 610 181), anti-Rac1 (Milipore 23A8), og anti-aktin (Santa Cruz 1616).
plasmider og Lentiviral Produksjon
Den menneskelige MIR-23b /-27b forløper (pMIRNA-23b /-27b-GFP) og egge kontroll (pMIRNA-egge~~POS=TRUNC-GFP) klonet inn lentiviral vektorer (Systems biovitenskap (SBI) Mountain View i California, USA) ble transfektert inn LentiX HEK celler ( Clontech, Mountain View, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. GFP uttrykk i omsatte ALVA31 og PC3-ML-celler ble bestemt ved flow cytometery.
flowcytometri
tryptinisert celler ble permeabilized bruker 0,05% Trypsin med 0,53 mM EDTA (Cellgro). Flowcytometri ble utført på en Accuri C6 cytometri hjelp CFLOW programvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
Cell transfections
Kjemisk modifiserte antisense nukleotider (antagomiRs) mot Mir-23b og Mir-27b eller kontroll antagomiRs ble kjøpt fra Applied Biosystems og transfektert 50 nm med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Alle eksperimentelle analyser ble utført 72 timer etter transfeksjon.
Migrasjon Analyser
Skrape analysene ble utført på ALVA31 celler 72 timer etter transduksjon med MIR-23b /-27b eller kryptert kontrollen eller på LNCaP celler 72 timer etter transfeksjon med antagomiR-23b /-27b eller kontrollere antagomiR. En steril pipette tips ble dratt over konfluent cellemono å lage bunnen av. Monolag ble så vasket to ganger for å fjerne cellerester og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 4 timer. Bildene ble tatt umiddelbart etter skrape og igjen etter 4 timer. Bilde J ble anvendt for å måle bunnen bredde som en funksjon av tid. Den prosent av spalten (bunnen) lukke ble beregnet som prosentandel av det gjenværende cellefrie område i forhold til området av den opprinnelige sår. To uavhengige eksperimenter ble utført med en total på minst 6 riper for hver cellelinje.
celleproliferasjon Assays
ALVA31, PC3-ML (uttrykk MIR-23b /-27b eller kryptert kontroll) og LNCaP-celler (transfektert med antagomiR-23b /-27b eller tak antagomiR) ble sådd ut ved en initial densitet på 10.000 celler /brønn i en seks-brønns plate. På de angitte tidspunkter, ble cellene trypsinert og levedyktige celler (de som ekskluderer trypanblått) ble talt opp ved hjelp av en hemocytometer.
Matrigel Invasion Analyser
Matrigel invasjonen analysen (BD Biosciences) ble utført bruker ALVA31 og PC3-ML celler 72 timer etter transduksjon med MIR-23b /-27b eller kryptert kontroll og LNCaP cellene 72 timer etter transfeksjon med antagomiR-23b /-27b eller kontrollere antagomiR. 50.000 celler ble serum-sultet i 16 timer og deretter sådd ut i toppkammeret i transwell anordningen med Matrigel belagte membran (24 vel innsats, 8 mm porestørrelse). Medium supplert med 10% FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer ble de øverste kamre tørkes med vatt for å fjerne ikke-trekkende eller ikke-invasive celler. Celler på den nedre overflaten av membranen ble deretter fiksert med kald metanol, farget med 0,01% krystallfiolett og tellet under et mikroskop.
Soft Agar Assays
soft agar analyser ble utført på ALVA31 eller PC3-ML celler 72 timer etter transduksjon med MIR-23b /-27b eller egge kontroll. Anchorage-uavhengig vekst ble evaluert som tidligere beskrevet [26]
Rac1 aktivitetsanalyser
Rac1 aktivitetsanalyser ble utført på ALVA31 eller PC3-ML celler 72 timer etter transduksjon med MIR-23b /. – 27b eller egge kontroll. GTP-bundet Rac1 ble skilt fra BNP-Rac1 bruke en pull-down tilnærming som tidligere beskrevet [19]. Kort sagt ble cellelysatene inkubert med 200 mg /ml PBD-GST [p21-bindende domene, PBD, av Rac1 /Cdc42 effektor PAK (p21-aktivert kinase)]. GTP-Rac1 ble gjenfunnet etter inkubasjon med glutation-agarose perler. Komplekser ble samlet, denaturert og løses ved hjelp av SDS-PAGE. Aktiv Rac1 ble oppdaget av Western blotting med anti-Rac1 antistoffer (Millipore). Totalt 5% av den opprinnelige lysat ble også analysert ved immunoblot å bestemme de totale nivåer av Rac1 (BNP-og GTP-bundet).
Resultater
MiR-23b /-27b Undertrykker motilitet , Invasion og Anchorage uavhengig Vekst av kastrering-resistente prostata kreft celler
Gitt omvendt korrelasjon mellom MIR-23b /-27b uttrykk og ondartet fenotype av menneskelig prostata kreft, forsøkte vi å vurdere potensielle antineoplastiske rolle (e) for denne miRNA klyngen. For å nå dette målet, ble Mir-23b /-27b klynge ectopically uttrykkes ved hjelp av en lentiviral vektor (også koding GFP) i to uavhengige svært aggressive kastrering-resistent prostatakreft cellelinjer, ALVA31 og PC3-ML. 72 timer etter transduksjon, ble cellene analysert for GFP ekspresjon ved hjelp av flow cytometri for å bestemme transduksjon effektivitet for hvert eksperiment (S1). Eksperimenter ble utført bare når mer enn 95% av cellene uttrykte GFP. Siden Mir-27b ligger 3 «i Mir-23b, overvåket vi Mir-27b nivåer av revers transkriptase qPCR følgende transduksjon med lentiviruses koder denne miRNA klynge eller en kontroll uspesifikk miRNA (data ikke vist). Transduksjon med Mir-23b /-27b lentiviral vektor resulterte i mir-27b nivåer sammenlignes med de naturlig finnes i MCF7 celler, som fungerte som en positiv kontroll for Mir-27b [27]. Alternativt MIR-23b /-27b ble hemmet i androgen-avhengige LNCaP linje ved hjelp antagomiRs, som er syntetiske oligonukleotider komplementære til målet miRNA som fører til spalting av den tilsvarende miRNA (S2).
For å avgjøre om MIR-23b /-27b regulerer cellemetastatiske prosesser, vi analysert virkningene av å endre Mir-23b /-27b uttrykk på kastrering-resistente cellemotilitet og migrasjon. Ved hjelp av skrape analyser, har vi funnet at ektopisk uttrykk for MIR-23b /-27b i CRPC linje, redusert ALVA31 cellemotilitet ca. 2 ganger etter bare fire timer (Figur 1a). Omvendt, inhibering av endogen MIR-23b /-27b-ekspresjon i LNCaP-celler, som har relativt høye endogene nivåer av disse mirnas og oppviser lite motilitet, resulterte i mer enn to ganger så høy motilitet sammenlignet med kontroll antagomiR-transfekterte celler (figur 1B ).
-27b uttrykk reduserer kastrering resistent prostatakreft cellemigrasjon mens hemming av MIR-23b /-27b øker migrasjon av androgen-avhengige prostatakreftceller. Skrape analyser ble utført på celler som uttrykker ALVA31 MIR-23b /-27b eller kryptert kontroll (A) og LNCaP-celler transfektert med 50 nM antagomiR-23b-27b eller tak antagomiR (B). Bilder av de klarerte sonene (representative bildene som vises på høyre) ble tatt før og etter en 4 timers inkubasjon og ryddet områder målt ved hjelp av Image J programvare. Den midlere prosentandel av gap lukke (± SD) (på grunn av cellemigrering) er vist for to uavhengige eksperimenter fra 7 riper (A) og 6 riper (B) *** (P 0,001).
Deretter bestemmes vi om Mir-23b /-27b uttrykk påvirket invasivitet av kastreringsresistent celler ved hjelp av Matrigel invasjonen kamre. Serum sultet celler ble tilsatt til de øvre kamrene i transwell og antall celler invaderer gjennom Matrigel barriere som reaksjon på kjemotiltrekkende (serum) i løpet av en 48 timers periode ble vurdert. Innføring av MIR-23b /-27b inn i ALVA31 og PC3-ML-celler signifikant redusert antall invaderende celler med mer enn 2 ganger (figur 2A og B). I motsetning til utarming av MIR-23b /-27b aktivitet i mindre aggressive androgen-avhengige LNCaP cellelinje betydelig forbedret celle invasjon (figur 2C).
-27b uttrykk reduserer invasivitet av kastreringsresistent prostatakreft celler mens hemming av MIR-23b /-27b i androgen-avhengige prostatakreftceller øker invasivitet. A, Matrigel invasjons analyser ble utført på celler ALVA31 (A) og PC3-ML-celler (B) som uttrykker MIR-23b /-27b eller kryptert kontroll-transdusert celler. De øvre panelene viser representative områder av kammer filtre med krystallfiolett-farget celler. Folden endring (± SEM) representerer antallet invaderte celler pr kammeret dividert med kontroller fra tre uavhengige eksperimenter utført i triplikat for A og middel (± SD) av en uavhengig forsøk utført in triplo for B (*** P 0,001 ). C, LNCaP celler ble transfektert med 50 nM kontroll antagomiR eller antagomiR-23b /-27b. Matrigel invasjonsanalyser ble utført 72 timer etter transfeksjon som forklart ovenfor. Midlene (± SD) av to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer vises (*** P 0,001).
I tillegg til migrasjon og invasjon, metastaserende celler ofte tilegne seg evnen til å vokse i en anker-uavhengig måte, motstand anoikis. Derfor analysert vi effekten av Mir-23b /-27b uttrykk på prostata kreft celle overlevelse i myk agar. ALVA31 og PC3-ML celler (MIR-23b /-27b uttrykke og egge kontroll omformet) ble sådd ut på lav-vedlegg media (soft agar) og koloni overlevelse ble evaluert 2-4 uker etter plating. Kolonidannelse ble betydelig svekket i ALVA31 og P3-ML cellelinjer som uttrykker Mir-23b /-27b forhold til egge kontroller (figur 3). Disse dataene antyder sterkt at MIR-23b /-27b uttrykk overfører anoikis følsomhet for aggressive kastrering-resistente prostata kreft celler.
-27b reduserer forankringsuavhengig vekst av kastreringsresistent prostatakreft cellelinjer. Myke agar ble utført på ALVA31 og PC3-ML celler uttrykker Mir-23b /-27b eller omformet med egge kontroll (** P 0,01). Gjennomsnittlig koloni nummer (± SEM) per plate fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer for hver cellelinje er vist (** P 0,01).
Interessant, over-uttrykk for MIR-23b /- 27b i kastreringsresistent cellelinjer, ALVA31 og P3-ML, ikke signifikant påvirker celleproliferasjon (Figur 4A og B). Videre hemming av disse Mirs i androgen-avhengige LNCaP prostatakreftceller heller ikke påvirke spredningsrater (Figur 4C). Disse resultatene tyder på at Mir-23b /-27b klynge kan spille en nøkkelrolle i metastatisk prosess, som indikert av de observerte fenotyper i invasjon, migrasjon og anoikis analyser. Imidlertid, endringer i nivået for MIR-23b /-27b klynge hadde ingen virkning på proliferasjon av prostata cancer-cellelinjer.
-27b regulerer ikke prostatacancer celleproliferasjon. A og B, proliferasjon av celler som uttrykker MIR-23b /-27b ble sammenlignet med den krypterte kontroll-transdusert celler. Den midlere celletall (± SEM) av en total av tre uavhengige eksperimenter utført i triplikat er vist for ALVA31 celler og det midlere celletall (± SD) av et representativt eksperiment utføres i triplikat er vist for PC3-ML-celler. C, spredning av LNCaP celler transfektert med antagomiR-23b /-27b eller kontrollere antagomiR ble vurdert. Gjennomsnittlig celle nummer (± SD) fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer vises.
Ektopisk Expression of Mir-23b /-27b Markert Øker E-cadherin proteinnivåer og reduserer Rac1 aktivitet
for å forstå de molekylære mekanismene for Mir-23b /-27b mediert hemming av metastatisk fenotyper, undersøkte vi uttrykket av viktige faktorer i kreft celle migrasjon og invasjon. Vanligvis er migrasjon og invasjon av tumorceller fremmet av tap av samspillet av adherens veikryss med cytoskjelettet og senere endringer i aktivitetene til Rho familien små GTPases som Rac1 og Cdc42 [28]. Vi fant at ektopisk uttrykk for MIR-23b /-27b resulterte i en markant økning av E-cadherin proteinnivåer i både ALVA31 og PC3-ML celler. Omvendt, inhibering av MIR-23b /-27b i LNCaP-celler resulterte i redusert E-cadherin nivåer (figur 5).
-27b i betydelig grad øker E-cadherin ekspresjon i kastrerings -resistente cellelinjer. ALVA31 eller PC3-ML celler uttrykker Mir-23b /-27b eller omformet med egge kontroll og LNCaP celler transfektert med antagomiR-23b /-27b eller kontrollere antagomiR ble utsatt for western blotting for E-cadherin og aktin. Representative blot er vist på totalt 2-6 eksperimenter.
Rac1 aktivitet er forbundet med, og ser ut til å være avgjørende for den metastatiske fenotypen til prostata kreft, så vel som andre epiteliale cancere [19] , [29]. Endogen Rac1 aktivitet fremmer forankringsuavhengig vekst, og er nødvendig for invasiv virkemåten til CRPC cellelinjen PC3 [29]. Av disse grunner, bestemt vi om ektopisk uttrykk for MIR-23b /-27b i aggressive prostatakreftceller påvirkes Rac1 aktivitet. Innføring av MIR-23b /-27b i ALVA31 og PC3-ML, som begge har høy endogen Rac1 aktivitet [19], dempes vesentlig Rac1 aktivitet uten å påvirke total Rac1 nivå (figur 6). Samlet utgjør disse dataene gir mekanistisk innsikt i rollen som MIR-23b /-27b i undertrykkelse av metastatiske fenotyper.
-27b reduseres betydelig Rac1 aktivitet, men ikke totalt Rac1 nivåer i kastreringsresistent prostatakreft cellelinjer. Rac1 aktivitetsanalyser ble utført på ALVA31 (A) og PC3-ML (B) celler som uttrykker MIR-23b /-27b eller transdusert med egge kontroll. GTP-bundet Rac1 ble skilt fra BNP-Rac1 bruke en pull-down analyse som beskrevet i materialer og metoder. Komplekser som inneholder GTP-Rac1 (aktiv Rac1) ble samlet, denaturert og løses ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting med anti-Rac1 antistoffer. Total Rac1 (GDP-og GTP-bundet) representerer 5% av den opprinnelige cellelysat. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Kvantifisering av tre uavhengige eksperimenter er vist med feilfelt representerer SEM (* P 0,05), (** P 0,01).
Diskusjoner
Mirs modulere et bredt utvalg av biologisk og patologiske prosesser, inkludert metastatisk kaskade. Over tusen Mirs er kodet i det menneskelige genom og klarlegging av deres funksjoner er et viktig forskningsområde [6]. Siden mange Mirs ha roller i apoptose og mitogenese [30] deres potensielle bidrag til metastasering kan være vanskelig å skjelne. Vi viser her at MIR-23b /-27b trykkes migrasjon og invasjon av aggressive prostata kreft celler uten å øve konfunderende påvirkninger på celleproliferasjon. Mirs med disse typene egenskaper er beskrevet som kandidat «metastasedempere» [6], [31].
Kapasiteten av kreftceller til å motvirke anoikis, migrere og invadere krever kjøp av flere molekylære egenskaper [32] . Våre data viser at ektopisk uttrykk for MIR-23b /-27b i metastatisk CRPC cellelinjer, ALVA31 og PC3-ML, resulterte i redusert vekst i myk agar samt redusert celle migrasjon og invasjon. Omvendt, inhibering av MIR-23b /-27b i androgen-avhengig prostata cancer cellelinje, LNCaP, resulterte i forbedret celle migrering og invasjon. For at tumor epitelceller å invadere og migrere, må integriteten av epitel og grunnmembranen bli forstyrret slik at cellene til å få adgang til det underliggende stroma. Denne prosessen krever avbrudd av epitel-celle-celle-kontakter som kan forekomme gjennom reduserte nivåer av celleadhesjonsmolekyler som E-cadherin. Expression of Mir-23b /-27b økte E-cadherin protein nivåer i to uavhengige CRPC cellelinjer; omvendt inhibering av MIR-23b /-27b i en mindre aggressiv androgen-avhengig prostata cancer cellelinje, LNCaP, resulterte i en reduksjon av E-cadherin nivåer.
Tap av celleadhesjonsmolekyl E-cadherin i prostata kreftprøver pasienten er sterkt assosiert med metastatisk oppførsel og dårlig klinisk utfall [14], [15], [18]. Disse studiene støtter E-cadherin deregulering som en kritisk hendelse i prostata kreft progresjon og er i samsvar med våre funn at MIR-23b /-27b utfoldelse resulterte i økte E-cadherin nivåer og en nedgang i metastatiske egenskaper. Den molekylære basis for oppregulering av E-cadherin i MIR-23b /27b uttrykkprostatakreftceller er ukjent. Mens vi spekulert i at denne effekten skyldes MIR-23b /-27b hemming (enten direkte eller indirekte) av en eller flere av de kjente E-cadherin transkripsjons repressors [33] – [35], vi ikke observere konsekvent bevis undertrykkelse av E-cadherin repressors Twist, Slug, sneglen, Zeb1 eller Zeb2 i CRPC cellelinjer overekspresjon Mir-23b /-27b (data ikke vist). Disse funnene tyder på en mulig involvering av andre repressors og /eller at MIR-23b /-27b-mediert opp regulering av E-cadherin skjer gjennom en mer kompleks mekanisme (r).
metastatisk prosessen ikke bare innebærer tap av celle-celle adhesjon men tumorceller må også skaffe seg kapasitet til å migrere for å kolon fjerne områder. Rho GTPase Rac1 regulerer omorganisering av aktin cytoskjelettet som kreves for celle migrasjon. Overekspresjon av Rac1 er assosiert med forbedret metastatisk potensial av prostata og andre epiteliale krefttyper [36] – [38]. Forhøyet Rac1 aktivitet forekommer i CRPC, fremmer kastrering motstandsdyktig, så vel som, forankringsuavhengig vekst, og er nødvendig for invasiv virkemåten til CRPC cellelinjen PC3 [19], [21]. Et utvalg av aktivatorer av Rac1 har vist seg å være viktig i prostata kreft progresjon eller ved kjøp av en invasiv fenotype. For eksempel, vi og andre vist betydningen av Rho guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) i utviklingen av CRPC [21], [22], [26], [39]. I tillegg økt uttrykk av visse Rac1 GEFs korrelerer med økt biokjemisk tilbakefall [22] og redusert sykdomsfri overlevelse hos pasienter med prostatakreft [40]. Proteiner som reduserer Rac1 aktivitet gjennom hydrolyse av GTP, GTPase aktiverer proteiner (hull), fungere som tumor suppressors [41]. Selv MIR-23b /-27b ikke påvirke nivåer av total Rac1, innføringen av disse Mirs i ALVA31 og PC3-ML celler reduserte nivåer av aktiv (GTP-bundet) Rac1. Derfor forutsettes det at MIR-23-b /27-b må hemme en eller flere av de mange oppstrøms aktivatorer av Rac1 eller indirekte øke Rac1 inhibitoriske proteiner.
Selv om ekspresjonen av MIR-23b /-27b-formidlet reduksjon av Rac1 aktivitet og resulterte i økte E-cadherin protein nivåer, er disse effektene mistenkt for å være indirekte. Siden enkelte Mirs ofte regulere mange målgener, MIR-23b /-27b kan undertrykke flere mål og nettverk som til slutt resulterer i de store fenotypiske endringer som vi observerte. Et antall MIR-23b og MIR-27b målgener er blitt identifisert i andre kreftcelletyper i hvilke disse Mirs er differensielt uttrykt i forhold til normalt vev, inkludert bryst, lever og lunge [42] – [50]. Imidlertid, siden mange av proteinene kodet for av disse gener målene er involvert i reguleringen av celleproliferasjon, forventer vi at disse genene ikke representerer de aktuelle mål i prostatakreftceller. I tillegg har vi identifisert en rekke beregningsmessig forutsagte kandidaten mål fra Mir-23b /-27b som er knyttet til Rac1 signalering og E-cadherin regulering inkludert PI3-kinase, MAPK, TGF-beta, Wnt, mTOR, Jak-STAT, toll-like reseptor og Notch blant andre. Innenfor disse komplekse integrerende nettverk, mål fra Mir-23b /-27b kan møtes for å regulere Rac1 aktivitet og E-cadherin. Vi arbeider aktivt med disse mulige mål. I tillegg vil det være viktig å avgrense de enkelte rollene til de to Mirs i denne gruppen på invasjon og migrering av prostatacancerceller.
Siden metastaser er ansvarlig for pasient dødelighet i nesten alle humane karsinomer, evne MIR-23b /-27b å hindre metastatiske prosesser kan være av klinisk verdi. Tap av MIR-23b /-27b kan tjene som en prognostisk markør for aggressiv prostatakreft. Biomarkører som skiller lat fra aggressiv prostatakreft er kritisk nødvendig, og tap av MIR-23b /-27b kan forutsi metastatisk sykdom. Siden Mirs har også potensial bruk som terapeutiske metoder [51], Mir-23b /-27b «etterligner» bør vurderes i prekliniske modeller for prostatakreft metastasering.
Hjelpemiddel Informasjon
Skyv S1.
Vurdering av transduksjon effektiviteten av ALVA31 og PC3-ML celler. GFP uttrykk for ALVA31 (A) eller PC3-ML (B) celler 72 timer etter to sekvensielle transductions med GFP-kodet lentiviral vektorer pMIRNA-MIR-23b /-27b eller pMIRNA-kryptert lentiviral vektorer (Systems biovitenskap (SBI) i Mountain View CA, USA). GFP uttrykk i untransduced og omsatte celler ble bestemt ved FACS analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052106.s001 plakater (TIF)
Slide S2.
MiR-27b synker i LNCaP celler transfektert med antagomiR-23b /-27b. LNCaP celler ble transfektert med 50 nM antagomiR-23b /-27b eller kontrollere antagomiR. MiR-27b nivåer ble bestemt ved hjelp av sanntids-PCR 72 timer etter transfeksjon. Verdier er Mir-27b nivå normalisert til U6 snRNA i LNCaP celler transfektert med kontroll antagomiR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052106.s002 plakater (TIF)
Takk
Vi takker legene. Balakrishna og Vinata Lokeshwar, Pedro Salas (University of Miami Miller School of Medicine), Jennifer Richer (University of Colorado Health Sciences Center), for sjenerøst gi reagenser og råd. Vi takker også Dr. Seth Wander, Dekaung Zhao, Carol Maiorino, Dr. Leah Lyons, Dr. Fayi Wu, Stephanie Peacock og Cale Fahrenholtz (University of Miami Miller School of Medicine) for å få råd og hjelp.
