Abstract
Bakgrunn
Vi har nylig rapportert at kolon svulsten celler stimulere makrofager til å frigi IL-1β, som igjen inaktiverer GSK3p og forbedrer Wnt signal i tykktarm kreft celler, genererer en selvforsterkende sløyfe som fremmer veksten av kreftceller.
hovedfunnene
Her beskriver vi at makrofager beskytte HCT116 og HKE-3 tykktarmskreftceller fra TRAIL-indusert apoptose. Inaktivering av IL-1β ved nøytralisering av IL-1β antistoff, eller stanse av IL-1β i makrofager inhiberes deres evne til å motvirke TRAIL-fremkalt apoptose. Følgelig var tilstrekkelig til å hemme TRAIL-fremkalt apoptose IL-1β. TRAIL-indusert kollaps av mitokondriemembranen potensial (Δψ) og aktivering av caspases ble hindret av makrofager eller ved rekombinant IL-1β. Farmakologisk hemming av IL-1β frigjøring fra makrofager av vitamin D
3, en potent chemopreventive agent for tykktarmskreft, restaurert evne TRAIL å indusere apoptose av tumorceller dyrket med makrofager. Makrofager og IL-1β mislyktes i å hemme TRAIL-fremkalt apoptose i HCT116-celler som uttrykker dnIκB, dnAKT eller dnTCF4, som bekrefter at de motsetter TRAIL-fremkalt celledød gjennom induksjon av Wnt signalisering i tumorceller. Vi viste at makrofager og IL-1β stabilisert Snail i tumorceller i en NF-kB /Wnt avhengig måte og at Snail mangeltumorceller ble ikke beskyttet mot TRAIL-indusert apoptose av makrofager eller IL-1β, viser en avgjørende rolle Snail i motstanden av kreftceller til Trail
Betydningen
Vi har identifisert en positiv feedback loop mellom kreftceller og makrofager som forplanter vekst og fremmer overlevelse av tykktarm kreft celler. tumorceller stimulere makrofager til å utskille IL-1β, som i sin tur fremmer Wnt signalering og stabiliserer snegl i tumorceller, som gir resistens til TRAIL. Vitamin D
3 stopper denne forsterkende sløyfe ved å forstyrre med utgivelsen av IL-1β fra makrofager. Følgelig vitamin D
3 sensitizes tumorceller i Trail-indusert apoptose, noe som tyder på at den terapeutiske effekten av TRAIL kan bli forsterket av denne lett tilgjengelig chemopreventive agenten
Citation. Kaler P, Galea V, Augenlicht L , Klampfer L (2010) Tumor Associated Makrofager Beskytt Colon Cancer Celler fra TRAIL apoptose gjennom IL-1β- Avhengig Stabilisering av Snail i tumorceller. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10,1371 /journal.pone.0011700
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 13 april 2010; Godkjent: 27 juni 2010; Publisert: 22.07.2010
Copyright: © 2010 Kaler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CA 111 361 (LK), U54 CA 100926 (til LA) og P30-13330 fra National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betennelse bidrar til tumorprogresjon ved å etablere forhold som støtter tumorcellevekst og overlevelse og øke sin metastatiske potensial. Faktisk har kronisk inflammasjon vist seg å disponere til utvikling av en rekke av tumorer, en slående eksempel er inflammatorisk tarmsykdom, som er assosiert med forhøyet risiko for tykktarmskreft [1]. Videre viser det seg at coloncancere som ikke utvikler som en komplikasjon av inflammatorisk tarmsykdom, er også drevet av betennelse, fordi det har vist seg at regelmessig anvendelse av NSAIDs reduserer dødeligheten av sporadisk tykktarmskreft og resulterer i regresjon av adenomer i pasienter med FAP , som arver en mutasjon i APC genet [2]. Oppløselige faktorer som forplanter seg betennelse kan fremstilles ved tumorcellene eller, oftere, av celler som rekrutteres til tumoren mikromiljøet, slik som tumorassosierte makrofager (TAM). Koordinert signalering mellom tumorceller og ikke-ondartede celler i svulsten mikromiljøet er nødvendig for utviklingen av svulster, og signalveier som regulerer krysstale mellom colon tumorceller og stroma, så som NF-kB og STAT3, har dukket opp som viktige mål for Kjemopreventivt og kjemoterapeutiske midler [3], [4]. Likeledes TNFa-antagonister er i fase I /II kliniske studier og har vist seg å være godt tolerert hos pasienter med solide tumorer [5], [6].
Vi har nylig etablert som makrofager fremme Wnt signal i tykktarmskreft celler og dermed forbedre deres spredning, og viste at makrofager utøve sin protumorigenic aktivitet hovedsakelig gjennom utgivelsen av IL-1β [7], [8]. Her viser vi at makrofag-avledete faktorer, i tillegg til å støtte vekst av tumorceller, også fremme deres overlevelse etter behandling med TNF-relatert apoptose induserende ligand (TRAIL), en potent initiator av den ytre vei av apoptose.
TRAIL initierer apoptose ved å binde seg til to dødsreseptorer, DR4 og DR5, mens binding til lokkefugl reseptorer som mangler død domene, for eksempel DCR1, DCR2 og osteoprotegerin hemmer sin pro-apoptotiske aktivitet [9]. Binding av TRAIL til døden induserende reseptorer DR4 /DR5 resultater i rekrutteringen av Fas -associated død domene (FADD) til reseptorene, som initierer binding av procaspase-8 og procaspase-9, og dannelsen av dødsinduserende signale kompleks (DISC) [9]. I type I-celler, er caspase-8-aktivering er tilstrekkelig til å aktivere kaspaser effektor 3, 6 og 7, mens i type II celler, krever den apoptotiske kaskade integrering av mitokondrielle reaksjonsvei mediert av caspase-8-indusert spaltning av bud.
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP er betydelig mer følsomme for TRAIL-indusert apoptose enn normale celler, etablere TRAIL og DR4 eller DR5 agonistiske antistoffer som attraktive anti-kreft narkotika. Faktisk, i sterk kontrast til andre medlemmer av TNF-familien, behandling av mus og primater med rekombinant TRAIL induserte signifikant regresjon av tumorer uten systemisk toksisitet [10], [11]. Nylig, har kombinasjonen av TRAIL med alle trans-retinylacetat (RAC) vist å indusere apoptose selektivt i adenomatøs polypose (APC) mangel epitelcelledifferensiering uten å skade normale cellsαα og behandling av Apc
Min
mus med TRAIL og RAC indusert apoptose i tarmpolypper og langvarig dyr overlevelse [12].
det er imidlertid betydelige forskjeller i TRAIL følsomhet mellom humane kreftceller. Motstandsdyktighet mot TRAIL har vist seg å utvikle i celler med mutert DR5 [13] eller i mismatch repair mangelfulle tumorer med Bax mutasjoner [14]. I kontrast, fremmer c-myc responsen til TRAIL ved å hemme uttrykk for FLIP, en hemmer av TRAIL signale [15], og ved å motvirke TRAIL-indusert oppregulering av MCL-en og cIAP2, to proteiner med iboende evne til å hemme apoptose [ ,,,0],16]. I tillegg er det stromale celler og løselige faktorer som er tilstede i tumoren mikromiljøet blitt vist å ha en betydelig innvirkning på følsomheten av tumorceller til terapeutiske midler [17], [18].
TRAIL mangelfull mus DISPLAY økt mottakelighet til karsinogen indusert tumordannelse og økt metastatisk potensiale [19], [20], viser at TRAIL utøver tumor suppressor aktivitet, og antyder en viktig rolle endogent TRAIL i tumor overvåking. Faktisk forfatterne viste at TRAIL er, i det minste delvis, ansvarlig for NK-celleformidlet, IFNy avhengig, mekanisme for tumor eliminering.
I denne studien demonstrerte vi at TRAIL-indusert apoptose av tykktarmskreftceller inhiberes av makrofag-avledet IL-1β, og viste at makrofager og rekombinant IL-1β motvirke TRAIL-fremkalt apoptose gjennom aktivering av Wnt signalering og stabilisering av snegle i tumorceller. Til slutt presenterer vi data som indikerer at «normalisering» av svulsten mikromiljøet av vitamin D
3, en potent chemopreventive agent, gjenoppretter følsomheten av tykktarmskreftceller til TRAIL, noe som tyder på at den terapeutiske effektiviteten av TRAIL kan bli mye bedre ved agenter som hemmer crosstalk mellom tumorceller og svulsten mikromiljøet.
Materialer og metoder
cellelinjer og co-kultur eksperimenter
HCT116 og HKE-3 tykktarmskreft cellelinjer , som bare skiller seg ved tilstedeværelsen av den mutante k-Ras-allelet [21] og SW480 celler ble dyrket i MEM, mens 293T-celler ble dyrket i DMEM. Den humane monocyttisk cellelinje, THP1, ble dyrket i RPMI. Normale humane monocytter, 90% CD14 og CD11c positiv positiv og mindre enn 1% anti-T-celle-reseptor, ble kjøpt fra
Astarte Biologics plakater (Redmond, WA). Tumorceller og monocytter /makrofager ble ko-dyrket adskilt av Transwell innsatser av en polykarbonatmembran med 0,4 uM porestørrelse som utelukker direkte celle-celle-kontakt, men tillater utveksling av løselige faktorer (Corning Incorporated, Lowell, MA).
for klonogene assay, HCT116 og hke-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 200 celler per brønn i en brønns plate alene eller sammen med THP1 makrofager eller monocytter fra perifert blod i 7 dager. Tumorceller ble dyrket med THP1 monocytter direkte (1600 per brønn i en 6-brønners plate), som THP1 cellene ikke heftet til og danne kolonier. Det optimale forholdet mellom tumorceller og makrofager ble etablert tidligere [7], [8]. Koloniene ble fiksert og farget med 6% glutaraldehyd og 0,5% krystallfiolett og telles ved hjelp av Total Lab 1.1-programvaren (lineære Dynamics, Durham, NC, USA).
apoptose analysen
Celler ble behandlet med rekombinant TRAIL (50 ng /ml, som vi har fastslått var den optimale konsentrasjon) alene eller i nærvær av makrofager, IL-1β (5 ng /ml) eller TNFa (10 ng /ml) i 7 timer. Celler ble resuspendert i hypotonisk buffer (0,1% Triton X-100, 0,1% natrium- citrat) og farget med propidiumjodid (50 ug /ml) i 4 timer ved 4 ° C som beskrevet [22]. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri og cellesyklusfordeling, og omfanget av apoptose (celler med en subG1 DNA-innhold) ble analysert ved hjelp av den
Modfit
programvare. Mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved flowcytometri hjelp av fluorescerende fargestoff JC-1 (
Invitrogen
). Celler ble farget med 1 uM av JC1 i 1 time ved 37 ° C, vasket med PBS og analysert ved fluorescens i FL2-kanalen. Cellene ble behandlet med TRAIL for -7 timer og var samlet for evaluering basert på morfologiske kriterier. Men som PI flekker kan undervurdere hvor mye apoptose [23], vi bekreftet den apoptotiske natur celler ved biokjemisk analyse av cellelysatene. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av uparet Student t test, med verdier og 0,05 anses statistisk signifikant
Transient transfeksjon og reporter gen analysen
HCT116 og HKE-3 celler ble transient transfektert med TOP-. FLASH eller TOP-FOP luciferase reporter plasmider ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. Transfeksjon effektivitet ble normalisert ved ko-transfeksjon med pTK-Renilla og luciferase aktivitet ble bestemt i henhold til leverandørens protokollen (Dual Luciferase reporter analysen, Promega, Madison, WI). Dominant negativ IκBα ble uttrykt fra et plasmid som koder for IκBα med seriner 32 og 36 mutert til alanin, som gir resistens på stimuli indusert degradering [24]. Plasmider uttrykker konstitutivt aktiv AKT, ble (HA-mdelta (4-129) PH-AKT), og dominant negativ AKT (HA-AKT-K179M) levert av Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 ble beskrevet tidligere [27].
Makrofager ble transfektert med 20 nM av uspesifikk siRNA (NSP) eller sirnas spesifikk for VDR, IL-1β eller STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) ved hjelp Lipofectamin LTX (Invitrogen , Carlsbad, California). Effektiviteten av tie ble overvåket ved immunblotting (for STAT1 og VDR), eller ved hjelp av ELISA (for IL-1β), som rapportert [7], [8].
Immunofluorescence
For subcellulære påvisning av β-catenin ved immunofluorescens ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Cellene ble inkubert med anti-β-catenin antistoff (1:100) i 1 time ved 37 ° C og med sekundære anti-kanin antistoff konjugert til FITC i 45 minutter ved 37 ° C. Bilder ble kjøpt med en SPOT CCD-kamera og analyseres av SPOT programvare.
Western Blot
Western blot ble utført ved hjelp av standard prosedyrer. Membraner ble blokkert med 5% melk i TBS som inneholder 0,1% Tween 20, og inkubert med antistoffer spesifikke for caspase 8 (Abcam), caspase 9, PARP, Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, MA), total beta -catenin (BD Biosciences, San Jose, CA), og β-aktin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Immunreaktive bånd ble visualisert ved kjemiluminescens (Amersham ECLTM western blotting deteksjon kit, Piscataway, NJ).
Resultater
Makrofager og IL-1β beskytte tykktarmskreftceller fra TRAIL indusert apoptose
vi vist at makrofager fremkalle flere signalveier prosurvival i tykktarmskreftceller, inkludert NF-kB, AKT og Wnt signale [7], [8], som tyder på at nærværet av makrofager kan påvirke responsen av tumorceller til terapeutiske midler. HCT116 tykktarm kreft celler er svært utsatt for TRAIL-indusert apoptose [16]. Følgelig TRAIL vesentlig hemmet veksten av klonogene HCT116 og hke-3-celler (fig. 1A og B), cellelinjer som skiller seg bare ved tilstedeværelsen av de mutante Kras [21]. Det var ingen reproduserbar forskjell mellom respons fra HCT116 og HKE-3 celler til TRAIL (Fig. 1 og 2), viser at tilstedeværelse av muterte KRAS ikke regulere respons av celler til TRAIL. For å avgjøre om makrofager endre følsomheten av kreftceller til TRAIL, behandlet vi HCT116 og HKE-3 celler med TRAIL i fravær eller i nærvær av THP1 makrofager. Bemerkelsesverdig, tilstedeværelse av THP1 makrofager eller behandling med IL-1β, et cytokin som produseres i cocultures av tumorceller og makrofager [7], gjenopprettes den klonogene veksten av TRAIL-behandlede tykktarmskreftceller (Fig. 1).
A og B: HCT116 og hke-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 200 celler per brønn i en brønns plate i fravær eller nærvær av makrofager (1600 /brønn) eller IL-1β, og ble behandlet med TRAIL for 4 timer. Resultatene er vist i B representerer gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat.
Makrofager har ikke inhiberer ekspresjonen av DR4 eller DR5, eller modulerer nivået av lokkereseptorer DcR1 eller DcR2 i HCT116 /HKE-3 celler (Figur S1), noe som tyder på at de ikke modulere responsen til sti gjennom regulering av TRAIL reseptorer.
det neste vi viste at makrofager og IL-1β hemmet TRAIL-indusert apoptose av HCT116 og Hke- 3-celler (fig. 2A). THP1 makrofager og IL-1β utelukket TRAIL-fremkalt kollaps av mitokondriemembranpotensialet (MMP) (Fig. 2B) og forhindret TRAIL-indusert aktivering av kaspase-8 og caspase-9 (fig. 2C). Den humane monocyttisk cellelinje THP-1 ble avledet fra perifert blod fra en pasient med akutt monocyttisk leukemi og THP1 celler har egenskaper av humane monocytt-avledede makrofager [28]. Disse cellene har flere karakteristika for tumorassosierte makrofager (TAM), inkludert svekket aktivering av NF-kB, mangel på nitrogenoksidproduksjon som respons på LPS /IFNy (ikke vist) og høy konstitutiv STAT1 signale [7], [8]. Imidlertid, for å bekrefte at de resultater som oppnås ved hjelp av THP1 celler er biologisk relevant viste vi at normale perifere blodmonocytter, forløpere for tumorassosierte makrofager, som er beskyttet av et panel av tykktarmskreft cellelinjer fra TRAIL-fremkalt apoptose (Fig. 2D). Som THP1 makrofager, normale perifere blodmonocytter gjenopprettet MMP og hindret aktivering av kaspase 8 og spaltning av PARP i TRAIL-behandlede tumorceller (data ikke vist, fig S2), som er i samsvar med muligheten for tykktarmskreftceller til å indusere IL- 1β utgivelse fra perifert blod monocytter [7]
A:. HCT116 (gjennomsnittlig 5 uavhengige eksperimenter) og HKE-3 celler (gjennomsnitt av 4 uavhengige eksperimenter) ble behandlet med TRAIL i fravær eller tilstedeværelse av makrofager eller IL-1β (5 ng /ml) som angitt, og graden av apoptose ble bestemt etter 7 timer. B: mitokondriemembranpotensialet (MMP) ble bestemt ved farging JC1 5 timer etter behandling. C: Aktivering av kaspase 8 og caspase-9 ble bestemt i tykktarmskreftceller behandlet med TRAIL (50 ng /ml) under betingelser som er angitt. D: Trail-sensitive kreftcellelinjer ble behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær av humane perifere blodmonocytter (Mo) og omfanget av apoptose ble bestemt 7 timer etter behandling. Viste data representerer gjennomsnittet av 2 eller 3 uavhengige eksperimenter.
perifert blod monocytter hemmet TRAIL-indusert apoptose også i 293T celler (fig. 2D), viser at makro avledet faktorer er generelle og potente hemmere av TRAIL-indusert celledød.
Makrofager beskytte mot TRAIL-indusert apoptose gjennom IL-1β
Vi viste at IL-1β er tilstrekkelig til å hemme TRAIL-indusert apoptose (fig. 2). For å fastslå hvorvidt IL-1β er nødvendig for makrofag-mediert beskyttelse av tumorceller fra TRAIL-fremkalt apoptose, vi først dempet IL-1β i THP1 makrofager. Disse forsøk viste at IL-1 p mangelfull makrofager mislykkes i å beskytte tumorceller fra TRAIL-fremkalt apoptose (Fig. 3A og 3B). I samsvar med disse data, nøytralisering av IL-1β av IL-1β spesifikke antistoff, eller å stanse all STAT1, en transkripsjonsfaktor som vi viste er nødvendig for frigjøringen av IL-1β fra makrofager [7] har også hemmet anti-apoptotiske aktivitet av makrofager (fig. 3A og 3B). Som forventet, nøytraliserer IL-1β-antistoff inhiberte prosurvival aktiviteten til IL-1β, noe som viser spesifisiteten av antistoffet. Sammen utgjør disse data fastslått at tumorassosierte makrofager beskytte tumorceller fra TRAIL-fremkalt apoptose i en IL-1β avhengig måte
A og B:. HCT116-celler ble dyrket med THP1 makrofager med taushet IL-1β eller STAT1 uttrykk og ble behandlet med TRAIL som angitt. IL-1β ble nøytralisert ved anti-IL-1β spesifikt antistoff. Det ble tatt bilder (A) og mengden av apoptose (B) ble bestemt etter 7 timer. Data som vises i B representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. C og D: Studier av Gyorffy
et al plakater ([29], C) og ved Khambata-Ford
et al plakater ([30], D) ble undersøkt gjennom Oncomine og indikerer at celle linjer (C) og primær tykktarm kreft (D) med høyere nivåer av IL-1βdisplay resistens mot terapeutiske midler, slik som vinblastin, doxorubicin og cetuximab (CTX).
for å avgjøre om evnen til IL -1β å interferere med behandlingen indusert apoptose er begrenset til TRAIL, undersøkte vi Oncomine (www.oncomine.org), som er en sammenstilling av humane tumormicroarray studier. Analysen av 30 cellelinjer ved Gyorffy
et al product: [29] avslørte at høy ekspresjon av IL-1β i tumorcellelinjer sterkt korrelerer med motstanden av cellene til vinblastin og doxorubicin (Fig. 3C). Analysen av 70 metastatisk tykktarmskreft [30] viste at colontumorer som havn muterte KRAS har høyere nivåer av IL-1β enn svulster med WT Kras (Fig. 3D, venstre panel). Hvorvidt IL-1β er produsert av stromale celler eller tumorceller selv kan ikke i stand, men analysen av denne databasen viste at høyere nivåer av IL-1β i tumorer korrelerer med resistens overfor cetuximab [30] (fig. 3D, høyre panel). Oppsummert disse dataene etablert at nivåene av IL-1β er forhøyet i en undergruppe av humane tykktarmskreft, og at IL-1β modulerer responsen av tumorceller til en rekke terapeutiske midler både
in vitro og
in vivo
.
Farmakologisk hemming av IL-1β stimulering av vitamin D
3 hemmer prosurvival aktiviteten av makrofager
Vi har nylig vist at krysstale mellom tumor celler og makrofager blir forstyrret av vitamin D
3, et viktig chemopreventive agent for tykktarmskreft. Vitamin D
3 hemmet evnen til tumorceller for å stimulere IL-1β frigjøring fra makrofager [7], og senere, vitamin D
3 behandlede makrofager ikke klarte å indusere Wnt signalering på tumorceller [7]. Disse data antydet at vitamin D
3 kan også regulere TRAIL indusert apoptose. HCT116-celler ble dyrket alene eller i nærvær av makrofager, og ble behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær av vitamin D
3. Vitamin D
3 påvirket ikke TRAIL-fremkalt apoptose i HCT116 eller hke-3-celler (data ikke vist), som er konsistent med den ikke-responsivitet av disse cellene til vitamin D
3 [31]. Imidlertid demonstrerte vi at evnen til makrofager til å beskytte tykktarmskreftceller fra TRAIL-fremkalt apoptose ble inhibert med vitamin D
3 (fig. 4A). Tilsetningen av eksogent IL-1β hindret muligheten for vitamin D
3 for å regulere TRAIL indusert apoptose, noe som bekrefter at vitamin D
3 gjengitte følsomheten av tumorceller til TRAIL ved å hemme frigjøringen av IL-1β fra makrofager, og ikke ved å påvirke signalering av IL-1β. Stanse av VDR av VDR bestemt siRNA i makrofager ikke påvirker deres evne til å hemme TRAIL-indusert apoptose i tumorceller, men vitamin D
3 ikke klarte å gjenopprette TRAIL indusert apoptose av tumorceller cocultured med VDR mangelfulle makrofager (fig. 4A) . Disse data viser at vitamin D
3 påvirker krysstale mellom tumorceller og makrofager ved å målrette makrofager og ikke til tumorcellene, og at følgelig den krever ekspresjon av VDR på makrofager, i samsvar med vår publiserte data [7].
Sv: Hvor mye av apoptose ble bestemt i HCT116 cellene behandlet med TRAIL henhold angitte vilkår. Feilfelt ble avledet fra 2 uavhengige forsøk. B: Effekten av vitamin D
3 på TRAIL-indusert aktivering av caspases og spalting av PARP og β-catenin ble bestemt ved immunoblotting
Biokjemisk analyse bekreftet at mens makrofager hemmet Trail-. indusert aktivering av kaspase 8 og caspase-9 og spaltning av PARP og β-catenin, behandling med vitamin D
3 fremmet TRAIL-mediert aktivering av den apoptotiske kaskade i tumorceller som var dyrket i nærvær av WT, men ikke VDR mangelfull makrofager (fig. 4B). Som vitamin D
3 virker som en inhibitor av IL1-β frigivelse, var dens aktivitet forhindret av eksogent IL1β og var avhengig av ekspresjonen av VDR på makrofager (Fig. 4A Fig. 4B), og ikke på tumorceller (data ikke vist).
Vitamin D
3 også restaurert følsomhet for TRAIL i tykktarm kreft celler som ble dyrket i nærvær av perifert blod monocytter. Den forbedrede aktivering av kaspase 8 og påfølgende spaltning av PARP og β-catenin i HCT116 som ervervet resistens mot TRAIL på grunn av tilstedeværelsen av perifere blodmonocytter (figur S2).
Disse data antyder at den terapeutiske effekt av TRAIL kan bli mye bedre ved vitamin D
3 i kreft som er infiltrert av makrofager.
Wnt signal er nødvendig for prosurvival aktiviteten til makrofager
Vi har nylig vist at makrofager og IL-1β indusere Wnt signal i tykktarm kreft celler gjennom aktivering av NF-kB avhengig AKT signale [8], veier som har vist seg å beskytte kreftceller fra apoptose. For å avgjøre om makrofager og IL-1β sperre TRAIL-indusert apoptose gjennom aktivering av disse pro-overlevelse signalveier, uttrykte vi i HCT116 cellene dnIκB (en inhibitor av NF-kB signalering), dnAKT (en inhibitor av AKT signalering) og dnTCF4 ( hemmer Wnt signal). Hemming av NF-kB eller AKT ikke påvirke TRAIL-indusert apoptose. Imidlertid, celler transfektert med dnTCF4 reproduserbart viste en moderat redusert mengde av TRAIL-fremkalt apoptose (forskjellene var ikke statistisk signifikant), som kan være i samsvar med kravene i Wnt reaksjonsveien for optimal TRAIL-fremkalt apoptose [32] (fig. 5A) . Men det kritiske punktet var at i motsetning til celler transfektert med et tomt plasmid, ble makrofager og IL-1β ikke beskytte celler med nedsatt NF-kB, AKT eller Wnt signalering fra TRAIL-fremkalt apoptose (Fig. 5A). Vi har bekreftet at makrofager og IL-1β unnlatt å motvirke TRAIL-indusert aktivering av kaspase-8 og caspase-9 og påfølgende spaltning av PARP i celler som uttrykker enten dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 (Fig. 5B). Av spesiell interesse, makrofager og IL-1β forhindret TRAIL-indusert spalting av β-catenin, men bare i celler med intakt NF-kB /AKT /Wnt signal (Fig 5B.)
A og B:. HCT116 uttrykk dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 ble behandlet med TRAIL henhold angitte betingelser, og mengden av apoptose ble bestemt ved propidiumjodidfarging. A: Data representerer gjennomsnittet av 5 uavhengige eksperimenter. B: Omfanget av kaspase-aktivering og spaltingen av PARP og β-catenin ble bestemt i cellelysatene ved immunblotting. C:. Lokalisering av β-catenin ble bestemt ved immunofluorescens i HCT116-celler behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær av IL-1β eller TNFa
Spalting av β-catenin ble formidlet av caspaser, som vi kunne hindre behandling av ZVAD, en pan-caspase inhibitor (Figur S3). Spaltes β-catenin har blitt vist å utvise nedsatt transkripsjonen aktivitet [33]. Vi viste at TRAIL hemmer TCF4 /β-catenin transkripsjonen aktivitet og at makrofager og IL-1β kan delvis gjenopprette β-catenin transkripsjonen aktivitet i TRAIL-behandlede celler (Figur S3).
I likhet med publiserte rapporter [34] har vi funnet at, til tross for det faktum at HCT116-celler bærer en mutant β-catenin allel har de fleste av β-catenin er lokalisert til membranene i HCT116-celler. I samsvar med spaltingen av β-catenin av TRAIL, ble membranøs lokalisering av β-catenin svært redusert i TRAIL behandlede celler (fig. 5C). Både IL-1β og TNFa gjenopprettet membran lokalisering av β-catenin i HCT116-celler i TRAIL-behandlede celler (fig. 5C), i samsvar med deres prosurvival aktivitet.
Til sammen utgjør disse data viser at tumorassosierte makrofager (TAM) beskytte kreftceller fra TRAIL-indusert apoptose gjennom sin evne til å stabilisere β-catenin og å fremme Wnt signal i tykktarm kreft celler.
Makrofager, TNFa og IL-1β stabil Snail i en NF-kB og AKT /WNT avhengig måte
Selv om makrofager og IL-1B beskyttet tumorceller fra TRAIL-indusert apoptose, gjorde de ikke regulere nivåer av BCL-2 familiemedlemmer i tumorceller, for eksempel Bcl-x eller Mcl1 eller endre ekspresjonen av cIAPs, som har vist seg å modulere responsen av celler til TRAIL-fremkalt apoptose [16] (data ikke vist). Imidlertid viste vi at nivåene av sneglen protein ble øket i HCT116-celler behandlet med IL-1β eller i HCT116-celler dyrket i nærvær av makrofager (Fig. 6A). TNFa, en annen makrofag-avledet faktor som kan indusere Wnt signalisering på tumorceller [7], [35], også forhøyede nivåer av sneglen i tumorceller (Fig. 6A). Vi har vist at makrofager, IL-1β og TNFa forhøyet snegle via NF-kB, AKT og Wnt signalering, da de ikke klarte å øke nivåene av sneglen i celler som uttrykker dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 (Fig. 6A). Nivåene av sneglen mRNA i HCT116 eller hke-3-celler økte ikke av makrofager (ikke vist), hvilket antyder at makrofag-avledete faktorer stabilisere snegle-proteinet i tumorceller. Induksjonen av c-jun av IL-1β og TNFa kreves også NF-kB, i overensstemmelse med publiserte data (Fig. 6A). Vi viste at TNFa og IL-1β også mislyktes i å fremkalle c-jun i celler som uttrykker dnTCF4, noe som bekrefter viktigheten av Wnt signalering for den biologiske aktivitet av disse cytokiner og for interaksjonen mellom tumorceller med makrofager.
A : Makrofager, IL-1β og TNFa stabil Snail i en NF-kB /AKT /Wnt avhengig måte. HCT116-celler ble transfektert med dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 og ble behandlet med IL-1β eller TNFa, eller ble dyrket med THP1 makrofager som angitt. Nivåene av Snail og c-jun ble bestemt ved immunoblotting. B: Nivåene av sneglen og pGSK3β ble bestemt ved immuno i HKE-3 celler som ble behandlet med IL-1β, TNFa eller var co-dyrket med makrofager i fravær eller tilstedeværelse av LY 294 002 i 24 timer. C: HCT116 og HKE-3-celler ble behandlet med TRAIL i fravær eller tilstedeværelse av IL-1β og LY294002, som angitt. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger.
GSK3P er en stor kinase som fosforylerer sneglen og induserer dens degradering [36], [37]. Fordi vi rapporterte at makrofager og IL-1β inaktivere GSK3P i tumorceller [7], [8], vi neste undersøkt om makrofager /IL-1β stabilisere snegle gjennom inhibering av GSK3p. HCT116 og HKE-3-celler ble behandlet med LY294002, en PI3K inhibitor – og dermed aktivator av GSK3p (phoshorylation av GSK3p på Serine 9 hemmer dens aktivitet). Som vist på fig. 6B, behandling av celler med LY294002 faktisk utelukket makrofager /IL-1B /TNFa-mediert inaktivering av GSK3p, og helt forhindret stabilisering av Snail av makrofager, TNFa og IL-1β. Dette resultat viser at inhibering av GSK3p regulerer stabiliteten av sneglen i HCT116-celler, og tyder på at makrofager, TNFa og IL-1β stabilisere snegle gjennom deres evne til å inhibere GSK3p. Faktisk, farmakologisk inhibering av GSK3P av LiCl eller ved GSK3P spesifikk inhibitor, AR-A014418, var tilstrekkelig for å stabilisere sneglen i tumorceller (figur S4).
Endelig behandling av celler med LY29004 fullstendig forhindret muligheten av IL -1β å beskytte tykktarmskreftceller fra TRAIL-indusert apoptose (fig. 6C), noe som tyder på at makrofager og IL-1β beskytte mot TRAIL indusert apoptose gjennom GSK3p avhengig stabilisering av sneglen.
Makrofager og IL-1β beskytte mot TRAIL-indusert apoptose gjennom stabilisering av Snail
snegle har vist seg å samhandle med β-catenin og å fremme uttrykket av wnt målgener [38]. I samsvar med disse dataene, fant vi at overekspresjon av Snail fremmer TOP-BLINK-drevet aktivitet både HCT116 og HKE-3 celler (fig. 7A). For å bestemme hvorvidt stabilisering av sneglen av makrofager /IL-1β bidrar til deres evne til å kjøre Wnt signalering, stilnet vi sneglen i tumorceller (Fig. 7B), og undersøkt evnen til makrofager og IL-1β å indusere Wnt signalisering i sneglen mangel HCT116 og HKE-3 celler. I motsetning til HCT116 og HKE-3 celler transfektert med NSP (nontargeting) RNAi, celler transfektert med Snail bestemt RNAi unnlatt å svare på makrofager og IL-1β med forbedret Wnt signal (Fig. 7C). Snegl mangel svekket ikke IL-1β indusert NF-kB-aktivering i HCT116-celler (data ikke vist), som viser et bestemt krav for snegl i makrofag-mediert β-catenin drevet transkripsjon
A.: HCT116 og hke-3- celler ble transfektert med TOP-FLASH reporter sammen med en tom vektor (neo), eller den økende konsentrasjoner av Snail ekspresjonsvektor. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. B: Tumor-celler ble transfektert med NSP eller snegle spesifikk siRNA og ble behandlet med IL-1β som angitt. Nivåene av Snail ble bestemt ved immunoblotting. C: Kreftceller ble transfektert med TOP-FLASH reporter sammen med NSP eller Snail bestemt siRNA.
