Abstract
Fenylbutyl isoselenocyanate (ISC-4) er en Akt inhibitor med demonstrert preklinisk effekt mot melanom og tykktarmskreft . I denne studien, søkte vi å forbedre den kliniske nytten av ISC-4 ved å identifisere en synergistisk kombinasjon med FDA-godkjente anti-kreft terapi, en relevant og hensiktsmessig sykdom innstilling for testing, og biomarkører for respons. Vi testet aktiviteten av 19 FDA-godkjente legemidler mot kreft, alene eller i kombinasjon ISC-4, og mot SW480 og RKO menneskelige tykktarmskreft cellelinjer. En synergistisk interaksjon med cetuximab ble identifisert og validert i et panel av ytterligere tykktarmskreft cellelinjer, så vel som kinetikken av synergi. ISC-4 i kombinasjon med cetuximab synergi redusert levedyktighet av menneskelige tykktarmskreftceller med vill-type, men ikke mutant
KRAS
gener. Ytterligere analyse viste at kombinasjonsterapi samvirkende redusert cellesyklusprogresjon, økt caspase-avhengig apoptose, og redusert fosfo-Akt i responsive tumorceller. Synergien mellom ISC-4 og cetuximab ble beholdt uavhengig av ervervet resistens mot 5-FU i humane tykktarmskreftceller. Kombinasjonen vist synergistisk antitumoreffekter
in vivo
uten toksisitet og i møte med motstand mot 5-FU. Disse resultatene tyder på at å kombinere ISC-4 og cetuximab bør utforskes hos pasienter med 5-FU-resistente tykktarmskreft husing villtype
KRAS
Citation. Allen JE, Gallant JN, Dicker DT, Amin S, Irby RB, Sharma AK, et al. (2013) De Akt inhibitor ISC-4 synergizes med cetuximab i 5-FU-Resistant Colon Cancer. PLoS ONE 8 (3): e59380. doi: 10,1371 /journal.pone.0059380
Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 21 november 2012; Godkjent: 13 februar 2013; Publisert: 12 mars 2013
Copyright: © 2013 Allen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til WSE-D. og midler fra Penn State Hershey Cancer Institute, NIH National Cancer Institute stipend R03-CA143999 til A.K.S., og Lung Cancer Research Foundation tilskudd til A.K.S. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erkjenner den konkurrerende interesse at Dr. El-Diery er i redaksjonen for Plos, og som ba om, bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
fenylalkyl isoselenocyanates (ISCS), den isosterisk selen analoger av den naturlig forekommende isotiocyanatet klasse av forbindelser [1], [2], ble nylig utviklet i laboratoriet, og er blitt vist å inhibere Akt-aktivitet [3], [4], [5], [6]. Blant de undersøkte ISCS har ISC-4 vist den beste anti-tumor aktivitet i prekliniske modeller, både
in vitro Hotell og
in vivo
, med lovende sikkerhet [4]. ISC-4 har vist beskjeden preklinisk effekt mot mange krefttyper
in vitro
, og anti-tumor effekter har blitt rapportert i sammenheng med melanom når ISC-4 brukes et mono-agenten
in vivo
[4], [5], [6]. ISC-4 har også vist betydelig antitumoreffekter, via inhibering av Akt, i tykktarmskreft xenotransplantater når det anvendes som en mono-middel, og når det brukes i kombinasjon med 5-fluorouracil (5-FU)-selv om den kliniske nytten av kombinasjonen var uklart [5].
PI3K /Akt veien er over-aktivert eller endret i de fleste kolorektal kreft, som er den tredje hyppigst diagnostisert og dødelig kreft i USA [7]. Standarden-of-care kjemoterapi for avansert sykdom inkluderer FOLFOX eller FOLFIRI regimer, som består av 5-FU, leukovorin, oksaliplatin og irinotekan i tillegg til andre behandlingsalternativer, inkludert anti-VEGF monoklonalt antistoff bevacizumab og anti -EGFR monoklonalt antistoff cetuximab. Selv om disse behandlingskombinasjonsmuligheter har bedret overlevelsen av pasienter, er flere ikke-giftige målrettet behandling trengs i terapi-ildfaste innstilling av avansert kreft i tykktarmen.
Selv om prekliniske mono-agenten aktivitet av ISC-4 er betydelig, kombinasjonsterapi er ikke blitt grundig undersøkt. Vi søkte derfor for synergistiske kombinasjoner med ISC-4 ved hjelp av et panel av FDA-godkjente legemidler. Her rapporterer vi identifisering av ISC-4 og cetuximab som en lovende kombinasjonsbehandling som har synergistisk anti-tumor aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
mot menneskelige tykktarm kreft skjuler en villtype
KRAS
genet.
Materialer og metoder
Cell kultur, celleviabilitet analyser, og reagenser
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP ble hentet fra ATCC og dyrket i ATCC- anbefalte medier i en fuktet inkubator ved 5% CO
2 og 37 ° C. Cellelinjer brukt i denne studien ble ikke godkjent. For celleviabilitet analysene ble celler utsådd i 96-brønners sorte vegger plater ved en konsentrasjon på 1 x 10
5 celler per ml i friskt medium og i et volum på 100 ul per brønn. Celler ble tillatt å holde seg over natten og ble behandlet den neste dag som angitt. Ved endepunkt, ble CellTiter-Glo (Promega) analyser utført i henhold til produsentens protokoll, og bioluminescent avlesning ble spilt inn på en IVIS Imaging System (Xenogen). For cellesynkronisering, ble celler inkubert med 200 ng /mL nocodazol i 16 timer før behandling. Klorokin ble oppnådd fra Sigma. zVAD-FMK ble oppnådd fra Promega og anvendt ved en arbeidskonsentrasjon på 25 uM. ISC-4 ble syntetisert som tidligere beskrevet [6].
Strømningscytometri
For sub-G1 DNA-innhold analysen ble cellene trypsinert ved de angitte tidspunkter og fiksert i 80% etanol ved 4 ° C i minimum 30 minutter. Fikserte celler ble deretter farget med propidiumjodid i nærvær av RNase og analysert på en Epics Elite strømningscytometer (Coulter Beckman). For Ki-67 ekspresjon ble cellene fiksert etanol, som beskrevet ovenfor, og immunofarget med et anti-Ki-67-antistoff (Sigma) ved 1:500 i 30 minutter. Celler ble deretter inkubert med Alexafluor 488-konjugert antistoff ved 1:500 i PBS i 30 minutter og resuspendert i PBS for analyse.
Western blot-analyse
celler ble behandlet i log-fase vekst, innhøstet ved skraping celle, sentrifugert og lysert på is i 2 timer med cellelyseringsbuffer. Supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories). Prøvene ble underkastet elektroforese under reduserende betingelser på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen), overført til PVDF, og blokkert i 10% ikke-fettholdig melk i TBST i 1 time. Membranene ble deretter inkubert med primære antistoffer erholdt fra Cell Signaling ved 1:1000 i 2% ikke-fettholdig melk i TBST over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket i TBST, inkubert med de passende HRP-konjugert sekundært antistoff (Thermo-Scientific) i 1 time, vasket i TBST og visualisert ved bruk av ECL-Plus (Amersham) og røntgenfilm (Thermo-Scientific).
In vivo
studier
atymiske kvinnelige hårløse mus (Charles River Laboratories) ble inokulert med 1 × 10
6 av 5-fram motstandsdyktig RKO eller HT-29 celler i hver bakre flanke som en 200 ul suspensjon av 01:01 Matrigel (BD): PBS. Behandlingen ble startet når tumorene nådde et gjennomsnittlig volum på ~1650 mm
3, intraperitoneal eller intravenøse injeksjoner ble gitt i et totalt volum på 200 ul i DMSO. For vev analyse ble vev høstet fra mus avlivet og fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS i 48 timer. Tissue ble parafin-embedded og seksjonert ved histologi Kjerne Facility ved Penn State Hershey Medical Center. H E farging (Daiko) og TUNEL-farging (Millipore) ble utført i henhold til produsentens protokoller. For serumkjemi assays, ble 1 ml blod høstet fra bedøvede mus ved terminal kardial punktering av den venstre ventrikkel. For serumkjemi, ble 500 ul anbrakt i et mikrosentrifugerør og tillatt å levre seg i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av sentrifugering. Serum ble fjernet, sentrifugert igjen for å fjerne noen ekstra rusk, og sendt inn for analyse av komparativ medisin Diagnostic Lab ved Penn State Hershey Medical Center. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Penn State Hershey Medical Center.
statistikker
Parvise sammenligninger ble vurdert av studentens to -endepåfestet t-test i Microsoft Excel. Kombinasjon indeksene ble beregnet med CalcuSyn programvare (BioSoft) ved hjelp av Chou-Talalay metode [8].
Resultater
Definere ISC-4
in vitro
aktivitetsprofil
Vi testet mono-agenten
in vitro
aktivitet av ISC-fire i et panel av humane kreftcellelinjer for å karakterisere sin spekteret av aktivitet. Blant de testede cellelinjer, de menneskelige lymfom cellelinjer Daudi og Granta var den mest følsomme, og den menneskelige prostata kreft cellelinjer PC3 og DU145 var den minst følsomme når det gjelder EF
50 verdier (Fig. 1a). Med unntak av HT-29 humane tarmkreftcellelinjer var moderat sensitiv til ISC-4-behandling. De isogene HCT116 cellelinjer tyder på at ISC-fire aktivitet er sannsynlig p53- og Bax uavhengig. For bedre å kunne karakterisere den terapeutiske effekten av ISC-4 og potensielt forbedre sin kombi aktivitet, har vi fokusert på studiet av ISC-4 i tykktarm kreft på grunn av den moderate mono-agenten aktivitet [5].
( A) celleviabilitet analyser og beregnet EC
50 verdiene for den angitte cellelinjer behandlet med ISC-4 eller DMSO (72 timer, n = 3). Effekt av ISC-4-behandling på cellesyklus profiler av synkron og asynkron (B) HCT116 og (C) HT-29 cellelinjer. Asynkrone celler er angitt med A i figuren. (D) Sub-G1 innholdet angitt tykktarmskreft cellelinjer følgende ISC-4 behandling (0, 1, 2, 4, 8 eller 16 mm).
Cell syklus analyse av ISC-4 -behandlet synkronisert HCT116 og HT-29 humane tarmkreftcellelinjer viste en beskjeden økning i sub-G1 innhold og en reduksjon i graden av cellesyklusprogresjon (fig. 1B-C). ISC-4-induserte sub-G1 innhold er doseavhengig og generelt blir tydelig ved 8 uM (Fig. 1D). Dermed har ISC-4 beskjeden monoterapi aktivitet mot humane tykktarmskreftceller ved å forårsake celledød og en reduksjon i spredning.
Identifisere en synergistisk kombinasjon med ISC-4
Vi søkte på synergistiske kombinasjoner fra ISC-4 med FDA-godkjente behandlinger for å forbedre effektiviteten av ISC-4 mot tykktarmskreft. Vi valgte SW480 og RKO menneskelige tykktarmskreft cellelinjer for første profilering basert på deres heterogene onkogene genetiske endringer. SW480 har mutant
p53
, mutant
KRAS
, og villtype
BRAF
mens RKO har villtype
p53
, vill-type
KRAS
, og mutant
BRAF
gener [9]. Blant de testpanel av kjemoterapi og målrettede midler, ble kombinatorisk aktivitet observert i minst én cellelinje når ISC-4 ble kombinert med sorafenib, gefitinib, gemcitabin, cisplatin, bortezomib, imatinib, eller cetuximab (figur 2; Tabeller S1, S2) . Imidlertid er kombinasjonen av ISC-4 og cetuximab var den eneste synergistisk kombinasjonsterapi observert under de testede betingelser. Videre denne synergi ble kun observert i RKO cellelinje, som havner villtype
KRAS
, og ikke i SW480 cellelinje som havner
KRAS
G12V
. Denne observasjonen er i samsvar med kravet om villtype
KRAS
for den kliniske effekten av cetuximab i tykktarmskreft [10], [11].
Celleviabilitet analyser i SW480 og RKO tykktarm cancercellelinjer behandlet med ISC-4 (1, 2, eller 4 mM) og indikerte terapier ved putative EC
12,5, EC
25, og EC
50 alene og i kombinasjon (n = 3). Doser er gitt i tabell S1.
ISC-4 og cetuximab synergi hemme villtype KRAS tumor celleproliferasjon
Vi har evaluert den synergistiske aktiviteten til ISC-4 og cetuximab i flere menneske tykktarm kreft cellelinjer. I tråd med vår forrige observasjon, ble synergistisk aktivitet kun observert i HT-29 og RKO cellelinjer, som har villtype
KRAS
gener, og ikke i HCT116, DLD-en, og andre tykktarmskreft cellelinjer med mutant
KRAS
gener (figur 3A;. Tabell S3, data ikke vist). Interessant, vises den synergistiske interaksjonen mellom ISC-4 og cetuximab å være doseavhengig med hensyn til ISC-4-konsentrasjon, men uavhengig av cetuximab konsentrasjon. For å evaluere dette kombi aktivitet i en klinisk relevant setting, testet vi den synergistiske effekten av ISC-4 og cetuximab i RKO kloner med utviklet resistens mot 5-FU. Fordi 5-FU er et standard-of-care terapi for behandling av kreft i tykktarmen, terapier som tilbyr fordelen i 5-FU-resistente tykktarmskreft er nødvendig i klinikken. Den synergistiske aktiviteten til ISC-4 og cetuximab ble opprettholdt til tross for ervervet 5-FU-resistens hos de testede tykktarmskreftceller (Fig. 3B-C). Sammen utgjør disse dataene identifisere 5-FU-resistente tykktarmskreft med vill-type
KRAS
gener som et egnet klinisk miljø som kan ha nytte av ISC-4 og cetuximab kombinatoriske terapi.
(A) celleviabilitet analyser av humane tarmkreftcellelinjer behandlet med ISC-4 og cetuximab ved angitte doser i 72 timer (n = 3). (B) Celleviabilitet analyse av villtype og 5-FU-resistente RKO-celler ble behandlet med 5-FU som er anført i 24 timer (n = 3). (C) 5-FU-resistente RKO celler behandlet med ISC-4 (2 mm) og cetuximab (1 mg /ml) i 24 timer (n = 3).
Vi bestemte kinetikken den observerte synergistiske effekt og funnet slik aktivitet så tidlig som 8 timer etter behandling, med større synergi ved 12 timer (fig. 4A). Denne observasjonen tyder på at den synergistiske aktiviteten til ISC-4 og cetuximab er kanskje cytotoksisk snarere enn cytostatisk. Forandringer i cellemorfologi, samt fluorescerende merking av DNA, for behandlede kreftceller viste at den ISC-4 og cetuximab kombinasjonsbehandling forårsaker tilsynelatende DNA-fragmentering (figur 4B;. Fig. S1A). Ytterligere analyse viste at kombinasjonen av ISC-4 og cetuximab samvirkende og i betydelig grad øke sub-G1-innhold i forhold til mono-midler, men det kombinatoriske sub-G1 innhold var ikke tilstrekkelig til å fullt ut forklare den observerte synergi (fig. 4C). ISC-4-indusert sub-G1 innhold ble betydelig hemmet ved samtidig inkubasjon med pan-caspase inhibitor zVAD-FMK, noe som tyder på at kombinasjonen induserer caspase-avhengig apoptose. I bæreren av denne observasjon, er kombinasjonen av ISC-4 og cetuximab synergistisk indusert kaspase-3 aktivering (fig. 4D).
(A) cellenes levedyktighet analyser av RKO celler behandlet med ISC-4- (2 pM ) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon for det angitte tidsrom (n = 3). (B) DAPI farging av RKO celler behandlet som i (A) i 12 timer. Hvite piler indikerer celler med fragmentert DNA. (C) Sub-G1 innhold av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon i 12 timer (n = 3). *
P
0,05 sammenlignet med alle behandlingsgrupper av Student tosidige
t
test. (D) Caspase-Glo analyse av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) i kombinasjon med cetuximab (0, 0,25, 0,5 eller 1 mg /ml) ved 24 timer etter behandling. Nedre panel viser kvantifisering av ISC-4 (2 UM) og cetuximab (1 mg /ml) (n = 3).
Western blot analyse viste at ISC-4 i kombinasjon med cetuximab samarbeide reduserer fosfor -Akt nivåer, men ikke fosfor-ERK, til en meget beskjedent nivå på 24 timer etter behandling (fig. 5A). Men en tidsforløp-analyse viste at kombinasjonen samvirkende ablateres phosho-Akt nivåer så snart som 4 timer etter behandling (fig. 5b). Humane tarmkreftcellelinjer som viste en synergistisk respons til ISC-4 og cetuximab også reagert med en signifikant reduksjon i fosfo-Akt (fig. 5C). Men menneskelige tykktarmskreft cellelinjer som bærer muterte KRAS som ikke besvarte synergi til kombinasjonsbehandling også viste ikke endringer i phospho-Akt nivåer i respons på behandling. Således fosfo-Akt nivåer synes å korrelere med den antitumorrespons til ISC-4 og cetuximab. Ingen effekt på Ki-67 ekspresjon eller LC3B spalting, en markør for autophagy, ble observert med kombinasjonen (fig. S1B-D). Disse observasjonene tyder på at gre ISC-4 med cetuximab fører til en samarbeidende reduksjon i fosfor-Akt og celle levedyktighet, som ledsages av økt apoptose.
(A) Western blot analyse av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon i 24 timer. Densitometry av fosfo-Akt nivåer er vist ovenfor blot som normalisert til Ran som i forhold til styre behandlingen. (B) Western blot-analyse av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon for angitte tidsperioder. Ran er vist som en lasting kontroll. (C) Western blot-analyse av angitte humane koloncancer cellelinjer etter behandling med kombinasjonen (Rx) av ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) i 8 timer. *
P
. 0,05 sammenlignet med kontroll
ISC-4 og cetuximab utøver synergistiske anti-tumor effekter uten toksisitet
in vivo
for å etterligne det sannsynlig klinisk setting og nytte, testet vi den anti-tumor effekt av ISC-4 i kombinasjon med cetuximab i avanserte 5-FU-resistente RKO subkutane xenografter. I denne innstillingen, fant vi at kombinasjonsterapi har en synergistisk initial effekt på tumorprogresjon og forårsaket svulst stasis for første behandlingsuken (Fig. 6A). Tissue analyse viste at xenografter som fikk kombinasjonsbehandling hadde høyere nivåer av nekrose av histologi og apoptose ved TUNEL flekker enn xenografter som fikk begge substansene alene (fig 6B;. Fig. S2A). Den terapeutiske doseringsregime som anvendes i disse studiene ble godt tolerert, og forandret ikke musekroppsvekt eller endring i leverhistologi (fig. S2B-C).
(A) Relativ tumorstørrelser på 5-FU-resistente RKO xenotransplantater på 4 dager etter behandlingen med en enkelt dose av ISC-4 (3 mg /kg, ip), cetuximab (10 mg /kg, iv), eller kombinasjonen (n≥5). Individuelle svulster ble normalisert til baseline størrelse målt på dag 0. * P 0,05 sammenlignet med alle behandlede grupper ved hjelp av Student tosidige
t
test. (B) Hematoxylin og eosin (H 0,05 sammenlignet med kontroll
Vi har utforsket neste kombinasjonen av ISC-4 og cetuximab i HT-29 transplantater i mus sammenlignet med monoagents og kombinasjonen av. cetuximab og 5-FU. Vi fant ut at ISC-4 og cetuximab sterkt redusert tumorprogresjon, i motsetning til monoagents, når gitt som ukentlige intravenøse doser som var grovt tilsynelatende av tumorvolum og tumor vekt målinger (Fig 6C;. Fig. S2D). Videre er kombinasjonen oppviste overlegen antitumoraktivitet sammenlignet med kombinasjonen av 5-FU og cetuximab under disse forsøksbetingelser. Denne kombinasjonen var igjen godt tolerert (Fig. S2E) og videre, serumkjemi analyse viste ingen signifikante endringer i elektrolytter, leverfunksjon eller andre molekylære markører knyttet til nyre- eller hjertetoksisitet med kronisk dosering (tabell S4). Kumulativt, disse effekt- og sikkerhetsdata indikerer at kombinatorisk aktivitet av cetuximab og ISC-4 bør vurderes i fremtidige kliniske studier med 5-FU-ildfast tykktarmskreft husing villtype
KRAS
gener.
diskusjon
ISC-4 er et lovende Akt-inhibitor som har vist anti-tumor-aktivitet i flere prekliniske studier [3], [4], [5]. Den observerte synergi mellom ISC-4 og cetuximab som en kombinasjonsterapi tillater ISC-4 for å utøve cytotoksisiteten ved lave mikromolare doser mot humane tarmkreftceller, som kan være en mer oppnåelig dose
in vivo
. Kombinasjonen synes å indusere økte nivåer av apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo
, selv om andre anti-tumor mekanismer kan bidra til synergi. Denne observasjonen er i tråd med tidligere funn som perifosine, et PI3K /Akt-hemmer, synergizes med midler som hemmer EGFR, for eksempel cetuximab [12]. Fremtidige studier bør sammenligne ISC-4 med perifosine alene og i kombinasjon med cetuximab å bestemme deres relative styrke og potensial som nye behandlinger for kreft hos mennesker.
Fremtidige studier bør undersøke underliggende mekanismer for synergi mellom de to agentene. Spesiell oppmerksomhet bør rettes mot den kombinatoriske effekt på fosfor-Akt, som fungerer som terapeutisk respons markør til kombinasjonen og kan benyttes i fremtidige kliniske studier. Interessant nok ble observert synergien mellom disse to agentene i HT29 og RKO celler, som besitter mutant BRAF og PIK3CA gener som bør positivt påvirke Akt aktivitet. Kombi
in vitro
aktivitet ble observert for ISC-4 med flere andre godkjente målrettede agenter og kjemoterapi, men ikke synergistisk, og fortjener videre undersøkelser. Aktiviteten av ISC-4 mot lymfom bør videre utforsket gitt relativt potent
in vitro
aktivitet for mono ISC-4 som vi observerte mot lymfom cellelinjer. P53-uavhengig aktivitet av ISC-4 og bevaring av synergi med cetuximab i 5-FU-refraktær sykdom lover godt for den kliniske nytten av ISC-4. Flere kjemoterapi, herunder 5-FU, har p53-avhengige cytotoksiske effekter på tumorceller, og, derfor, kjemoterapi-resistent sykdom oppstår vanligvis i løpet av sykdomsutvikling på grunn av hyppige inaktivering av p53 tumor suppressor [13].
i tillegg til tumoren stasis indusert av ISC-4 og cetuximab kombinasjonsbehandling på 5-FU-resistente tumorer, bør det bemerkes at det terapeutiske doseringsregimet ble meget godt tolerert. Dette lover godt for bruk i pasienter med avansert sykdom, mange av dem ikke er i stand til å tåle tøffe behandlinger. Den terapeutiske aktiviteten i 5-FU-resistente avansert tykktarmskreft er lovende og kan ha nytte av tillegg av andre vanlig brukte behandlinger i sammenheng med tykktarmskreft ledelse, som for eksempel oksaliplatin. Cetuximab har vist seg å gjenopprette oksaliplatin følsomhet i ildfast tykktarmskreftceller, og kan representere et lovende terapeutisk mulighet [14]. Kliniske data støtter også kombinasjonen av cetuximab med irinotecan i irinotecan-refraktær sykdom [15].
Gitt demonstrert effekt og sikkerhet av denne kombinasjonen, klinisk undersøkelse av ISC-4 i kombinasjon med cetuximab er nødvendig hos pasienter med villtype
KRAS
gener, som er nødvendig for standard cetuximab terapi [11]. Nyere bevis tyder på at en biopsi bør umiddelbart tatt før behandlingsstart for å sikre KRAS er villtype som kolon kreftpasienter kan utvikle seg KRAS-mutasjoner i løpet av cetuximab behandling som forårsaker resistens [16]. Videre gjennomføring av fosfo-Akt som en biomarkør for reaksjon kan vise seg nyttig i fremtiden prøve gjennom tumor biopsier eller analyse av sirkulerende tumorceller [17], [18]. Dette preklinisk studie hevder at kombinasjonen kan tilby en trygg terapeutisk fordel i møte med 5-FU motstand for tykktarmskreftpasienter som trenger flere behandlingsalternativer.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
ISC-4 og cetuximab kombinasjonsbehandling reduseres ikke Ki-67 uttrykk eller indusere autofagi. (A) fase-kontrastmikroskopi av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon i 12 timer. (B) (B) Strømningscytometri og (C) Western bot analyse av Ki-67 ekspresjon i RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon, som bestemt ved. (D) Western blot-analyse av RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 pg /ml) alene eller i kombinasjon i 24 timer. Klorokin (C; 10 mm) er inkludert som en positiv kontroll for autofagi. Beta aktin er vist som en lasting kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
ISC-4 og cetuximab kombinasjonsbehandling er trygt og utøver samarbeidende antitumor aktivitet. (A) Kvantifisering av TUNEL-farging i tumorxenotransplantater beskrevet i figur 6B (n = 10). (B) Endring i kroppsvekt av mus som mottok ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), eller kombinasjonen (n≥5) to ganger i uken i 2 uker. Kroppsvektendring er uttrykt i forhold til kroppsvekten til hver enkelt mus før behandling på dag 0 (n≥3). (C) H & Co. E farging av levervev høstet fra mus ved 24 timer etter behandling med ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.) eller kombinasjonen. (D) Terminal tumorvolum og tumorvekt for HT-29 xenograft beskrevet i figur 6C. Behandlingskullene inkludert ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), kombinasjonen, eller cetuximab og 5-FU (25 mg /kg, iv) en gang per uke (n≥8) . (E) Mus kroppsvekt ved endepunktet, som var tre dager etter den siste dose (n≥8). Feilfelt indikerer SEM replikater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Doser valgt for godkjente antitumormidler i kombinasjon med ISC-4. EF
12,5, EC
25, og EF
50 verdier ble estimert fra litteraturen og doser ble ansatt i forsøkene beskrevet i fig. 2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0059380.s003 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Oppsummering av kombinatoriske effekter av TIC10 med godkjent antitumormidler. Kombi aktivitet ble sammenlignet med monoagent aktiviteter ved celleviabilitet analyser og fast bestemt på å være lite samarbeidsvillig (-) (?), Samarbeidende (+), synergistisk (*), eller tvetydig. Kombinasjoner utstilt samarbeidende aktivitet i minst en cellelinje er merket med gult, mens den grønne markeringen viser synergi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s004 plakater (XLSX)
tabell S3.
Kombinasjon indekser for ISC-4 og cetuximab i villtype KRAS human tykktarm kreft cellelinjer. Kombi aktivitet i RKO og HT-29 cellelinjer kvantifisert i figur 3A ble vurdert av Chou-Talalay metode
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s005 plakater (XLSX)
Tabell S4.
Serum kjemi profiler av mus som fikk ISC-4 og cetuximab kombinasjonsbehandling. Atymisk, kvinnelig 8 uker gamle nakne mus mottok ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), eller kombinasjonen (n≥5) to ganger i uken i 2 uker. Serum ble samlet 2 dager etter siste dose
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s006 plakater (XLSX)
Takk
W.S. El-Deiry er en American Cancer Society forsker.
