Abstract
Somatiske mutasjoner spille en viktig rolle i startfasen og progresjon. Mutasjonen status av en svulst kan forutsi prognose og lede målrettet terapi. De fleste av teknikkene for å studere onkogene mutasjoner krever høy kvalitet og kvantitet DNA eller er analytisk utfordrende. Massespektrometri baserte mutasjonsanalyse er imidlertid en forholdsvis enkel og high-throughput-metoden egnet for formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) tumor materiale. Målrettet genet paneler med denne teknikken er utviklet for flere typer kreft. Disse aktuelle kreft hotspot paneler er ikke fokusert på de genene som er mest relevante i gynekologisk kreft. I denne studien rapporterer vi design og validering av en roman, massespektrometri panel spesielt for gynekologiske kreftformer og presentere frekvensene av påviste mutasjoner. Ved hjelp av frekvensdata fra den elektroniske katalogen av somatiske mutasjoner i kreft, valgte vi 171 somatiske hotspot mutasjoner i de 13 viktigste genene for gynekologisk kreft, blir
BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS , NRAS, PIK3CA, PPP2R1A Hotell og
PTEN
. Totalt 546 tumorer (205 cervical, 227 endometrial, 89 eggstokkreft, og 25 vulva karsinom) ble brukt til å teste og validere vårt panel, og å studere utbredelsen og spekteret av somatiske mutasjoner i disse typer kreft. Resultatene ble validert ved å teste duplikate prøver og ved allel-spesifikk qPCR. Panelet presenteres her ved hjelp av massespektrometri viser å være reproduserbar og høy gjennomstrømming, og er nyttig i FFPE materiale av lav kvalitet og kvantitet. Det gir nye muligheter for å studere et stort antall gynekologiske kreftprøver i daglig praksis, og kan være nyttig i styrt behandling utvalg
Citation. Spaans VM, Trietsch MD, Crobach S, Stelloo E, Kremer D, Osse EM , et al. (2014) Å designe en høy gjennomstrømming somatisk mutasjon Profilering Panel Spesielt for gynekologiske kreftformer. PLoS ONE 9 (3): e93451. doi: 10,1371 /journal.pone.0093451
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 18 desember 2013; Godkjent: 04.03.2014; Publisert: 26 mars 2014
Copyright: © 2014 Spaans et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Susanne Muller jobber som forsker for Sequenom, Hamburg Tyskland. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft genomer bære somatiske mutasjoner, og mutasjonen spekteret varierer etter tumortype og subtype [1] [2]. Vurderer et bredt spekter av viktige kreft genmutasjoner tvers av ulike kreftformer har potensial for å identifisere klinisk relevante mutasjoner. Studier av melanom, lungekreft, kolorektal, og brystkarsinomer har vist at det somatiske mutasjons status kan brukes til å forutsi prognose og lede tumorspesifikke behandlingsstrategier [3] – [6]. Gynekologiske kreftformer representerer 15-20% av alle nye krefttilfeller hos kvinner over hele verden, og tallene fortsetter å øke [7], men carcinogenesen av gynekologiske kreftformer er mangfoldig og rollen til somatiske mutasjoner er ennå ikke helt klarlagt [1].
i løpet av det siste tiåret, somatiske mutasjoner og deres rolle i målrettet terapi har blitt studert i gynekologiske kreftformer, men ennå ikke i samme grad som i andre typer kreft som brystkreft og tykktarmskreft. Mutasjon profilering av gynekologiske kreftformer kan identifisere nye narkotika mål og bidra til å forutsi pasientens prognose og tumor respons på behandling. Forskning har vist overlappende genetiske endringer samt lignende berørte signalveier i de ulike typer gynekologiske svulster [8] – [14]
Når studere et stort antall pasientmateriale, står vi overfor to typer problemer. Teknisk anvendbarhet og svulst spesifisitet. I dag er bare et begrenset antall gener vist i klinisk praksis. Det er forventet at dette tallet vil øke betydelig i nær fremtid. Derfor trenger du en rask og pålitelig metode for å påvise mutasjoner. Denne teknikken må være egnet for DNA ekstrahert fra formalin-fiksert paraffin innleiret (FFPE) vev, som ofte er av lav kvalitet, eller fra små vevsbiopsier, som er av lav kvantitet. Matrix-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF) har vist seg å oppfylle alle disse kriteriene [15] -. [17]
Som for svulst spesifisitet, for tiden, flere onkogene paneler basert på forskjellige teknikker er (kommersielt) tilgjengelig. Disse panelene har blitt brukt i å studere store mengder tumorprøver, for å trekke landskapet i somatiske mutasjoner som karakteriserer tumortyper [18] – [22]. Et utvalg av gener og mutasjoner som er relevante for tumorundertyper har med hell ført til utformingen av tumorspesifikke paneler [15], [16], [23]. Foreløpig er det ingen paneler som er spesielt utformet for å målrette gynekologiske svulster. Derfor ønsket vi å utvikle en høy gjennomstrømming mutasjon panel spesifisert for gynekologiske kreftformer.
En meta-analyse av den kosmiske (Katalog av somatiske mutasjoner i kreft) online database [24], ble utført for å designe en MALDI -TOF-basert, med høy gjennomstrømming mutasjon panel som dekker somatiske mutasjoner i 13 gener som er hyppigst rapportert å være involvert i gynekologiske kreftformer. Vi testet og validert dette panelet i et sett av 546 cervical, endometrial, ovarian og vulva karsinom prøver. Her presenterer vi utformingen av en gynekologisk kreft bestemt panel og frekvensene av somatiske mutasjoner er identifisert ved hjelp av det.
Materialer og metoder
Alle menneskelige vevsprøver i denne studien ble brukt i henhold til den medisinske etiske retningslinjer som er beskrevet i retningslinjene for forsvarlig sekundær bruk av menneskelig vev etablert av den nederlandske Federation of Medical Sciences (www.federa.org, kan en engelsk oversettelse av Code bli funnet here:
https://www.federa.org/sites/default/files/digital_version_first_part_code_of_conduct_in_uk_2011_12092012.pdf).
Patients motta informasjon om sekundær bruk av vev som er samplet for diagnostisk bruk. De kan aktivt motsette seg sekundær bruk. Følgelig til disse retningslinjene all menneskelig materiale som brukes i denne studien er anonymisert. På grunn av dette anonymiserings prosedyren, betyr retrospektiv forskning ikke kreve etisk godkjenning fra Institutional Review Board og enkeltpasienter tillatelse er ikke nødvendig.
Panel design
Først PubMed og COSMIC [24] søkene ble utført for å velge gener og mutasjoner for inkludering i gynekologisk-spesifikk mutasjon panel. Seleksjon var basert på hvorvidt en mutasjon ble gjentatte ganger funnet å være mutert i gynekologiske kreftformer. for det andre, for å dekke en høy prosentandel av de rapporterte varianter pr genet, ble de hyppigste mutasjoner valgt for å oppnå en rimelig gynekologisk -tissue-spesifikke dekning, som kun hotspot mutasjoner var egnet for analyse med MALDI-TOF teknikk. Vi forsøkte å velge gener hvori minst en av de studerte gynekologiske krefttyper (f.eks vulva, cervix, livmor eller kreft i eggstokkene), minst 30% av alle rapporterte mutasjoner skjedde på mindre enn 10 forskjellige steder på genet
Etablering av en gynekologisk bestemt «hotspot» gen panel -. GynCarta 1,0
Consulting PubMed og kosmisk databaser viste tydelig en overlapping i topp ti gener mutert i livmorhals, endometrial og eggstokkreft. Få somatiske mutasjoner studier har blitt utført på vulva kreft og derfor for denne svulsttypen vi er avhengige av frekvenser som finnes i lignende tumortyper (f.eks plateepitelkarsinom i huden på andre områder, og plateepitelkarsinom i hode og hals). De hyppigst muterte gener som oppfylte inklusjonskriteriene ble valgt for panelet. Den første panelet vi utpekt «GynCarta 1.0 (Sequenom, Hamburg, Tyskland) besto av 89 analyser (12 multiplexes) for å påvise 154 mutasjoner i 12 gener som møtte våre inklusjonskriterier:
BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS, NRAS, PIK3CA
, og
PTEN
.
analyse~~POS=TRUNC design
MySequenom.com online analysedesignverktøy ble brukt til å designe somatiske mutasjonsdeteksjon analyser. Maksimalt multipleks nivå på 12 analyser pr brønn ble anvendt. Hvis det er mulig, ble mutant allel forlengelses toppene utformet som først detektert allel topper og villtype forlengelses topper som den sist detekterte allel topper for å redusere faren for falske positiver fra salt-addukter. Alle analyser ble godkjent for villtype DNA, negative kontroller og valgt kjente positive mutasjons prøver.
Mutasjon deteksjon
Mutasjon deteksjon ble utført ved Leiden University Medical Center etter produsentens protokoll (Sequenom, Hamburg , Tyskland) som tidligere beskrevet [29]. I korthet ble villtype og mutant-DNA amplifisert ved multipleks PCR. Reker alkalisk fosfatase behandling inaktivert overskudd nukleotider. En primerforlengelsesreaksjon (iPLEX Pro) ble utført med masse-modifisert terminator nukleotider, og produktet ble flekket på en SpectroCHIP (Sequenom, Hamburg, Tyskland). Mutant og villtype-alleler var så diskriminert ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri.
Dataanalyse
Data ble analysert med MassARRAY Typer Analyser programvare (Typer 4.0.22, Sequenom, Hamburg, Tyskland). Mutasjoner ble detektert med minst 5% grensen av det mutante allel topp. Tre etterforskere blindet for svulst identifikasjon manuelt gjennomgått utgang, og en konsensus besluttsomhet ble nådd. Statistiske analyser ble utført med IBM SPSS statistikk Data Editor versjon 20.0. De uavhengige Studenter
t
-test ble brukt for å sammenligne baseline variabler, og Fishers eksakte test ble brukt til å analysere kategoriske og normalfordelte numeriske data.
P
-verdier ≤0.05, tilsvarende 95% konfidensintervall, ble ansett som statistisk signifikant. Alle testene ble tosidige.
Prøver
Først en trening sett av 51 FFPE- prøver (26 cervical, 17 endometrial, 6 eggstokkene og 2 vulva kreft prøver) ble brukt for å teste effekten av designet panel. Etter mindre tekniske justeringer og forbedringer av panelet, ble antall pasienter for hver vevstype utvidet.
Totalt DNA fra 548 tumorprøver fra livmorhalsen (
N =
209), endometrial (
N =
227), eggstokkene (
N =
89), og vulva (
N =
25) karsinom pasienter ble isolert. To livmorhalskreft prøver mislyktes for alle massespektrometri analyser og ble ekskludert fra videre analyser. Følgende utgangsverdier ble samlet: alder, FIGO (International Federation of gynekologi og obstetrikk) scenen, histopatologiske diagnose, tumor klasse hvis aktuelt, og humant papillomavirus (HPV) positivitet og skriver i tilfeller av livmorhals og vulva svulster (tabell 1)
DNA
DNA ble isolert fra FFPE- vevsblokker for 505 prøver og fra Dypfryst (FF) vev for 43 eggstokkene karsinomer. Tre til fem 0,6 mm diameter vev kjerner av variabel lengde ble tatt fra FFPE-blokkene fra et utvalgt område som omfatter ~70% tumorceller. I 34 prøver, ble tumorceller diffust fordelt, og derfor mikro-disseksjon ble utført på 10 hematoksylin-farget 10-um seksjoner for å oppnå en høy andel av tumorceller. DNA ble utført som beskrevet tidligere [25], etterfulgt av DNA-rensing (NucleoSpin Tissue kit, Machery-Nagel, Tyskland), eller ble utført helautomatisk ved hjelp av Tissue Preparation System (Siemens Healthcare Diagnostics, NY, USA) [28].
DNA kvalitet
DNA av alle prøvene ble isolert og testet for kvalitet; 493 (90%) prøver scoret ≥1 for DNA kvalitet ved hjelp av PCR, og dette ble ansett tilstrekkelig. To prøver, både livmorhalskreft med DNA kvalitetspoeng fra 0, mislyktes i alle analysene, noe som gir en suksessrate på 99,99%. Begge prøver ble utelukket fra videre analyse. Generelt prøver med lav kvalitet DNA var mer sannsynlig å mislykkes i enkelte analyser, men 27 av 48 prøver (56%) med DNA kvalitet score til 0 ble analysert med hell i alle analyser, og 40 av 48 (83%) lav kvalitetsprøver ble analysert med suksess i mer enn 90% av analysene. Prosentandelen av vellykket analyserte prøvene var ikke signifikant forskjellig mellom FFPE og ferske frosne prøver. Dette bekrefter at MALDI-TOF mutasjon påvisningsmetoden er meget godt egnet for analyse av lavere kvalitet, FFPE-ekstraherte DNA.
Validering
I alt 546 tumorprøver ble inkludert i denne studien. For å vurdere analyse reproduserbarhet, ble 57 (10%) prøver testet i duplikat og en annen 26 (5%) i tre eksemplarer. Av de opprinnelig detekterte mutasjoner i disse prøver, ble 95% (40/42) bekreftet i duplikat og 97% (30/31) ble bekreftet i tre eksemplarer. Ikke-sjablon (
N
= 4) og villtype-DNA leukocytter (
N
= 2) kontroller ble inkludert i hver multipleks for å oppnå negativ og villtype MALDI-TOF-spektra. Videre, for en random30% (163 prøver),
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner ble validert ved hjelp av allel-spesifikk qPCR som beskrevet tidligere [26] på 7 mutasjon varianter av
KRAS
(p.G12C, p.G12R, p.G12S, p.G12V, p.G12A, p.G12D, p.G13D) og 3 mutasjons varianter av
PIK3CA plakater (p.E542K, s. E545K, p.H1047R), og en samstemmighet på 99,4% ble oppnådd. (Figur 1) GynCarta panel oppdaget flere mutasjoner enn allel bestemt qPCR gjorde. Dette kan forklares ved det faktum at massespektrometri er i stand til å detektere mutant alleler med en lavere frekvens (ned til 5%) enn allel-spesifikk PCR-er (ned til 20%). Det faktum at vi ikke fant noen mutasjoner i villtype kontroll DNA, eller i noen av H
2o negative kontroller styrker vår tro på at disse ekstra mutasjoner er sanne mutasjoner i stedet for falske positiver.
samsvar mellom MALDI-TOF mutasjon genotyping (GynCarta, Sequenom, Hamburg, Tyskland) og allel-spesifikk qPCR for 3
PIK3CA Hotell og 7
KRAS
mutasjoner ble bestemt for 164 (30% av den totale kohort av 546 karsinom) prøver å validere resultatene. Samstemmighet ble beregnet for alle vill-type-villtype fyrstikker (1546 totalt) og alle mutasjon-mutasjons fyrstikker (45 totalt) i alle reaksjoner (164 * 10, 1640 totalt). Mislykkede reaksjoner ble ekskludert fordi sammenligning var ikke mulig (4 * 3 for
PIK3CA Hotell og 4 * 7 for
KRAS
, 40 totalt). Dette førte til en konkordans på (1546 + 45) /(1640-1640) = 0,994. WT = Wild type; MUT = mutant.
Forbedring av panel og skape GynCarta 2.0
Med den første mutasjons data fra GynCarta 1.0 og litteratur rapporter om nye onkogene mutasjoner, var vi i stand til å forbedre GynCarta 1.0 panel ved å fjerne analyser av mutasjoner som ikke ble oppdaget (
CDKN2A
D108Y, D108XA, Y108XC;
FGFR3
Y373C, A391E, K650Q, K650E, K650T, K650M, S371C;
KRAS
G13S og
NRAS
G13V, G13A, G13D, G13C, G13R, G13S) og ved å legge til 10 nye hotspot mutasjoner av de som allerede er inkludert gener. På denne måten dekning av
FGFR2 Hotell og
PIK3CA
ble økt fra 59% til 71% og fra 72% til 76%, henholdsvis. Videre analyser som hadde vist seg å være vanskelig å tolke på grunn av små funn topper ble forbedret. Under testing og validering periode,
PPP2R1A
, et nytt gen av interesse, hadde dukket opp fra litteraturen [27] – [29]. Ni mutasjoner i dette genet ble også lagt til panelet, og dermed skape «GynCarta versjon 2.0 «. En fullstendig oversikt over de mutasjonene som inngår i GynCarta 2,0 mutasjon panel er gitt i tabell 2, med den ekstra analyser som er oppført i fet skrift. Analysene for GynCarta 2.0 ble organisert på en slik måte, at totalt 13 signal kunne brukes til å analysere hele panelet, konsentrerer de nye analysene på 4 signalpakker. Disse 4 signal ble brukt til å analysere 497 prøver av bekreftelsen sett.
Resultater
Mutasjoner er identifisert ved hjelp av GynCarta 1.0 og 2.0
Mutation genotyping ved hjelp GynCarta 1,0 avslørt 395 mutasjoner i 273 (50%) prøver. De fleste mutasjoner ble detektert i endometrial karsinom (177 prøver (64%)), etterfulgt av ovariekarsinomer (33 prøver (37%)), karsinomer i livmorhalsen (67 prøver (33%)), og vulva karsinomer (5 prøver (20% )).
PIK3CA
ble mutert hyppigst (122 prøver), etterfulgt av
PTEN product: (97 prøver) og
KRAS
(64 prøver). Ingen mutasjoner ble funnet i
BRAF Hotell og
FOXL2
Mutation genotyping hjelp GynCarta 2,0 oppdaget en ekstra 36 mutasjoner:. 4 på
FGFR2 Hotell og fem på
PIK3CA
.
PPP2R1A
mutasjoner ble påvist i 27 prøver (7 cervical, 18 endometrial, to eggstokkene og 0 vulva prøver).
Siden panel versjon 1.0 og 2.0 hadde noen overlappende analyser, vi var i stand til å sammenligne resultatene av begge paneler. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle avvikende mutasjon samtaler, men vi var i stand til å analysere analyser som var vanskelig å tolke i GynCarta 1.0 fordi disse analysene hadde forbedret i GynCarta 2.0. Vi har også innhentet vellykket utgang for 3 prøver som hadde mislyktes i GynCarta 1.0. Mutasjons- frekvenser for hvert locus er oppsummert i tabell 3. mutasjon spekteret er anskueliggjort på figur 2.
spektrum og frekvenser av mutasjoner identifisert ved hjelp av MALDI-TOF i 546 gynekologiske karsinomer. Mutasjonen spekteret vises (fra topp til bunn) for livmorhals (
N
= 205), endometrial (
N
= 227), eggstokkene (
N
= 89) og vulva karsinom (
N
= 25). Fra venstre til høyre,
N
er antall prøver med mutasjonen, er «%» prosentandelen av muterte prøver innen kohorten, og linjene representerer prosenter grafisk: blå, 4 mutasjoner per prøve (
N
= 6); røde, 3 mutasjoner per prøve (
N =
29); grønne, 2 mutasjoner per prøve (
N =
65); og gul, en mutasjon per prøve (
N =
189).
De påviste mutasjoner frekvensene ble sammenlignet med den anslåtte antall mutasjoner basert på rapportert frekvens i kosmiske database [23] og korrigert for panelet dekning (tabell 4).
PIK3CA
mutasjoner ble oppdaget dobbelt så ofte som spådd i livmorhalskreft (
N
= 23 spådd og
N =
51 funnet) og i livmorkreft (
N
= 32 spådd og
N =
71 oppdaget).
PTEN
mutasjoner ble også påvist oftere i livmorkreft enn spådd (
N =
35 spådd og
N =
104 oppdaget). Men no
PTEN
mutasjoner ble oppdaget i vulva kreft selv om
N =
8 mutasjonene ble spådd [19].
Videre no
BRAF
eller
FOXL2
mutasjoner ble oppdaget i denne kohorten, til tross for høy dekning av både gener ved panelet. Dette kan forklares med det faktum at
FOXL2
er sterkt assosiert med granulosa celle svulster i eggstokkene [30], en undertype av eggstokkreft som ble ekskludert fra studien kohort.
GynCarta 2.0 kan brukes i differensiere tumortyper
En visuell illustrasjon som oppsummerer mutasjon frekvenser i de forskjellige tumortyper er vist i figur 2. Som vist i figur 2, gynekologiske tumorer viser betydelig overlapping i somatiske mutasjoner, skjønt vev bestemte profiler kan også bli verdsatt.
livmorkreft har den høyeste mutasjonsfrekvens, med 78% av prøvene med minst en mutasjon. Som spådd, de hyppigst muterte gener i gynekologisk kreft er gener fra Pakt /mTOR sti, men innenfor denne veien, mutasjonsfrekvenser varierer mellom tumortyper. For eggstokkreft,
KRAS
er den hyppigst muterte genet (18%), mens
PIK3CA
er mest påvirket i livmorhalskreft (24%) og
PTEN
i livmor kreft (39%). Selv om antallet vulva karsinom inkludert er liten, synes vulvacancer å ha en annen mutasjonsspekteret i forhold til andre gynekologiske kreftformer med
CDKN2A product: (12%) og
HRAS plakater (8%) mest ofte påvirket.
En interessant forskjell kan observeres når man sammenligner
PIK3CA
fordeling mellom livmorhalskreft og andre krefttyper. I endometrial (og eggstokkreft),
PIK3CA
mutasjoner er funnet oftest på hotspots ligger på ekson 9 og ekson 20, med en jevn fordeling mellom disse eksoner (33% og 45%). I livmorhalskreft imidlertid mutasjoner nesten utelukkende forekommer på loci på exon 9 (47 ut av 50 (94%)
PIK3CA
mutasjoner). Dette klar forskjell (
p
0,0001) kan brukes i klinisk praksis, da skille primær livmorhalskreft fra primærlivmorkreft
Diskusjoner
Etterspørselen etter individuell kreft. terapi har økt de siste årene. Nye genotyping teknikker tillater svulster å være preget basert på deres genomiske profiler, som har avslørt nye mål for tumor-spesifikk behandling, forutsatt innsikt i tumor respons på kjemoterapi og radiotherapies, og hjalp forutsi pasientens utfall [3] – [6], [ ,,,0],9], [12], [14]. Gynekologiske kreftformer står for 15-20% av alle kreftformen hos kvinner over hele verden [7]. De kliniske konsekvensene av somatiske mutasjoner i ulike gynekologiske kreftformer er ennå ikke fullt ut forstått. I den foreliggende undersøkelse har vi utviklet et panel som er meget spesifikt for et bredt spekter av gynekologiske kreftformer, for å undersøkte tumorspesifikk mutasjon spektrum av 162 mutasjoner av 13 gener. Ved hjelp av dette panelet, fant vi at i denne serien somatiske mutasjoner var til stede i 36% av alle cervical karsinomer, i 78% av endometrial carcinoma, i 37% av eggstokkene karsinomer og i 20% av vulva karsinomer.
somatisk mutasjons spektra ble undersøkt tidligere i gynekologiske kreftformer også ved hjelp av MALDI-TOF [17], [18], [22], [31] – [33]. Men de fleste av disse studiene brukte generiske kreft genet paneler basert på innrapporterte frekvenser i alle solide tumorer eller brukt eksisterende paneler som ble laget for generell onkologi [17], [22], [31] – [33]. Disse pre-eksisterende, kommersielt tilgjengelige paneler er ikke justert til feltet av gynekologisk onkologi, med den ulempe som inneholder gener som ikke er involvert i gynekologiske kreftformer som
FLT3 Hotell og
KIT
, eller utelate gener som har vist seg å være involvert relativt hyppig i gynekologisk kreft, for eksempel
PIK3CA
. Derfor har vi opprettet en MALDI-TOF-baserte mutasjon panel spesielt utviklet for å oppdage et bredt spekter av de vanligste hotspot mutasjoner som har blitt rapportert i ulike typer gynekologiske svulster. Lignende mutasjon paneler har blitt designet spesielt for melanomer, tykktarmskreft og ikke-småcellet lungekreft [15], [16], [20]. Ved å bruke en gynekologisk bestemt panel, studerte vi kun relevante mutasjoner, inkludert for eksempel
PIK3CA Hotell og
PPP2R1A
som ikke er innarbeidet i generelle paneler som OncoCarta (Sequenom, Hamburg, Tyskland) og med en bedre og mer spesifikk dekning (for eksempel
CTNNB1
). Som et resultat, kan de rapporterte frekvenser av gen-involvering vesentlig forskjellig. For eksempel, i vår serie av livmorkreft, en
KRAS
mutasjonsraten på 17% ble oppdaget. Dette er i motsetning til studiet av Cote et al [32] som, ved hjelp av en generisk onko-panel, rapporterer en
KRAS
mutasjonsrate på bare 1% i endometrial cancer. Fra andre studier ved hjelp av ulike teknikker, er det kjent at
KRAS
er mutert i 15-20% av alle livmorkreft [18], [34]. Dette eksempel viser at påliteligheten av undersøkelser med en MALDI-TOF metode er alvorlig påvirket av valget og graden av dekning av gener som inngår i panelet.
tilfredsstillende dekning av genene i vårt panel ble oppnådd etter mutasjonene vi studerte, og mutasjonen spektra generert i denne studien er dermed en pålitelig representasjon av mutasjonsfrekvenser i gynekologiske kreftformen hos de genene som er valgt for dette panelet. Men noen relevante gener, for eksempel
TP53 Hotell og
ARID1a
, [8], [13], [34] – [39] ble ikke inkludert i vårt panel, fordi de ikke oppfylle kriteriet for en «hotspot gen». Begge gener har mutasjoner spredt vidt over hele genet og er derfor ikke egnet for en MALDI-TOF tilnærming. Det er noen loci i
TP53 Hotell og
ARID1a Hotell som er oftere mutert; men disse dekker ikke mer enn 20% av alle kjente mutasjoner. Inkludert noen av disse loci i vårt panel, vil undervurdere den sanne mutasjonsfrekvensen av disse genene i gynekologiske kreftformer. Deres mutasjon frekvenser kan bli studert bedre ved hjelp av andre deteksjonsmetoder, som for eksempel Sanger-sekvensering eller ved neste generasjons sekvensering (NGS).
Vi beslutter å inkludere 22 analyser for tumorsuppressorgenet
PTEN
, noe som resulterer i en 40% dekning, som kan anses suboptimal ved hjelp av denne metode. Mutasjonen frekvens rapportert her er derfor sannsynligvis undervurderer den sanne somatisk mutasjonsfrekvens på
PTEN
. I tillegg kan tap av PTEN også være forårsaket av andre molekylære endringer, slik som LOH og promoter hypermethylation [40]. Derfor er det ekstra bruk av andre teknikker som immunhistokjemi anbefales å vurdere den sanne status PTEN.
CDKN2A
er ikke virkelig en hotspot muterte genet også, men det ble lagt til panelet på grunn av sin høye forutsagte relevans i vulvacancer, og fordi vi ventet å oppnå en god dekning av genet. Svulster inkludert i COSMIC databasen viser ofte fullstendig tap av, eller store strykninger i
CDKN2A
genet, en type mutasjon som ikke er lett synlig ved MALDI-TOF massespektrometri. Men siden
CDKN2A
mutasjoner i plateepitelkarsinom i huden er rapportert å være mer peker ofte mutasjoner enn (store) slettinger, tror vi at å legge
CDKN2A
punktmutasjoner til panelet kan gi verdifull informasjon, spesielt for vulva kreft. Selv om tallene er svært lav, resultater fra forskning på
CDKN2A
imutations i vulva og penis plateepitelkarsinom styrke denne hypotesen [41].
FBXW7
ser ut til å ha en lav dekning av panelet, men dette er påvirket av det faktum at det har blitt undersøkt og funnet å være mutert i et relativt lite antall gynekologiske tumorer. Når du vurderer det store antallet tilgjengelige data fra forskning på kreft i tykktarmen, er den forventede dekningen ca 35%.
Nye teknologier som neste generasjons sekvensering er i stand til å oppdage mutasjoner i flere gener uten preselecting og kan derfor overvinne begrensninger i en masse-spektrometri tilnærming. Med NGS kan komp gener av interesse bli analysert og derfor alle mutasjoner vil bli funnet. Imidlertid kan bioinformatiske analyse av data produsert av NGS være utfordrende og er for tiden fortsatt i utvikling. I tillegg skille mellom ikke-patogene somatiske varianter og sykdomsfremkallende mutasjoner kan være tidkrevende og komplisert [42]. Til sammenligning er MALDI-TOF dataanalyse mye mer oversiktlig, spesielt når analysere mutasjoner med kjent klinisk relevans. Panelet presenterer vi her dekker de vanligste mutasjonene i gynekologisk kreft, med noen få unntak. Mutasjonen spektra vi har oppdaget er sammenlignbare med de spektra rapporteres i NGS og exome sekvense studier som fokuserer på gynekologisk kreft [8], [43], [44]. Derfor har MALDI-TOF massespektrometri potensial for bruk i et klinisk miljø, for å detektere mutasjoner status av relevante gener i en rask og pålitelig måte. En annen klar fordel av massespektrometri basert mutasjon analyse er fleksibilitet til å legge til og slette analyser fra et panel, som også er vist i denne rapporten, slik at nye innsikter eller kliniske krav kan bli vedtatt enkelt.
somatisk mutasjon landskapet gynekologiske kreftformer produsert av denne studien (figur 2) og av offentlig tilgjengelige mutasjon biblioteker viser overlappende og særtmutasjonsprofiler mellom gynekologiske svulster. Mutasjoner i PI3K /Akt-veien er hyppige og overlapping, men noen sært mutasjoner ble identifisert. Et eksempel er funn som
PIK3CA
exon 20 mutasjoner bare forekommer sjelden i livmorhalskreft, mens de er et hyppig funn i livmorkreft. Dette funnet kan være av verdi i en klinisk setting, når det er usikkerhet om svulster primære opprinnelse, spesielt i livmorhalsen adenokarsinomer som er HPV negative og ligger i den lave livmor segmentet av livmoren. Det illustrerer at somatisk mutasjons informasjonen kan være nyttig for å klassifisere svulster [45].
Somatisk mutasjon profilering kan også avsløre ny innsikt i krefttyper som ikke er godt preget ennå, for eksempel vulva kreft. Vulva kreft er en sjelden sykdom som kan oppstå gjennom en HPV-avhengig eller en HPV-uavhengig veien. Den kreftutvikling av HPV-uavhengig vulva karsinom er i stor grad ukjent. I denne studien, 25 vulva karsinom (hvorav 19 HPV-negative tumorer) ble analysert, og en
PIK3CA
, 3
CDKN2A
og 2
HRAS
mutasjoner var påvises i HPV-negative karsinomer. Det er ingen mutasjoner ble detektert i noen av de 13 undersøkte gener i de 6 HPV-positive tumorer. Mutasjonen spekteret av vulva kreft virker forskjellig fra spekteret av andre gynekologiske krefttyper, men viser likheter til mutasjon spekteret av plateepitelkarsinom er i hode og nakke [46], en tumortype som deler morfologiske og etiologiske egenskaper med vulva plateepitelkarsinom . At vulva kreft ikke oppstår i Mullarian oppsto strukturer, som de tre andre krefttypene i denne studien gjør, kan også være en forklaring på forskjellene i spekteret som vi har oppdaget. Resultatene fra vår studie rask videre undersøkelser av rollene til
HRAS Hotell og
CDKN2A
i vulva kreft.
I konklusjonen, har vi designet, validert og brukt en roman massespektrometri -basert mutasjon panel for å identifisere somatiske mutasjoner i en stor kohort av gynekologiske kreftformer. Vi har vist at denne nye panel er reproduserbar, høy gjennomstrømming, og egner seg for lav kvalitet og kvantitet DNA fra FFPE-prøver. Våre data støtter muligheten for somatiske mutasjoner profiler som et verktøy for å klassifisere krefttyper innen gynekologisk kanalen. Videre våre resultater viste at PI3K-Akt signalveien er mest fremtredende berørt i gynekologiske kreftformer, begrunner videre undersøkelser av
PI3K Twitter /AKT /mTOR rettet mot behandling i gynekologisk onkologi.
