Abstract
Tetrandrine, en bis-benzylisoquinoline alkaloid isolert fra tørket rot av Hang-Fang-Chi (
Stephania
tetrandra
S. Moore), har blitt rapportert å ha anti-kreft effekt på mange svulster. I denne studien undersøkte vi tetrandrine-indusert apoptose på human magekreft BGC-823 celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene viste at tetrandrine signifikant inhiberte cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte og apoptose. Det økte apoptose; oppregulering av Bax, Bak og Bad; og nedregulering av Bcl-2 og Bcl-xl i BGC-823 celler. Videre tetrandrine økt aktivering av kaspase-3 og -9, frigjøring av cytokrom
c
, og oppregulering av apaf-1, noe som tyder på at tetrandrine-indusert apoptose var relatert til den mitokondrielle pathway. I mellomtiden, forbehandling med pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK i BGC-823 celler reduserte tetrandrine-indusert apoptose ved å blokkere aktivering av kaspaser. Videre tetrandrine effektivt hemmet tumorvekst via apoptose-induksjon, noe som ble bekreftet ved immunhistokjemisk analyse i en naken mus xenograft modell. Til sammen har vi konkludert med at tetrandrine betydelig hemmet spredning av magekreft BGC-823 celler gjennom mitokondriene avhengige apoptose, som kan spille en lovende rolle i mage kreftbehandling
Citation. Qin R, Shen H, Cao Y, Fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrine induserer Mitokondrier-mediert apoptose i Human Gastric Cancer BGC-823 celler. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10,1371 /journal.pone.0076486
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 16. desember, 2012; Godkjent: 27 august 2013; Publisert: 01.10.2013
Copyright: © 2013 Qin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81070423 og 81101677), tilskudd fra Science Foundation Natural i Jiangsu-provinsen (BK 2010332). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i Kina, magekreft, en av de mest vanlige ondartede svulster, som følge av en akkumulering av genetiske og epigenetiske hendelser, fortsatt har en høy insidens og dødelighet [1-3]. Det er flere faktorer som forårsaker angrep av magekreft, slik som
Helicobacter pylori-infeksjon
, diett, tobakk, og så videre [4]. Avhengig av omstendighetene, de fleste pasienter med magekreft behov for kirurgi, kjemoterapi og /eller kjemoradioterapi [5]. Tidligere studier har vist at magekreft er en kompleks genetisk sykdom relatert til onkogener eller tumor suppressors [6].
Tetrandrine (C
38H
42N
2o
6, MW 622,730 ) er en bis-benzylisoquinoline alkaloid isolert fra tørket rot av Hang-Fang-Chi (
Stephania
tetrandra
S. Moore). Nylig har de ulike biologiske aktiviteter av tetrandrine blitt studert intensivt på grunn av sitt store bruk i leddgikt, arytmi, betennelse, silikose, ulike typer svulster, og reversere multilegemiddelresistens [7,8]. Det er rapportert at tetrandrine har betydelige effekter på tumorer inkludert bremse tumorvekst og øke dyr overlevelsestid og overlevelsesraten [9-12]. Tetrandrine bevirker en G1 cellesyklus blokade og induserer apoptose i forskjellige celletyper. Men de nøyaktige mekanismer som tetrandrine initierer apoptose og hemmer celleveksten i gastrisk tumorceller forblir uklar [13]. Det er rapportert at codelivery av paclitaxel (Ptx) og tetrandrine av nanopartikler effektivt kan forsterke cytotoksisiteten til Ptx ved sekvensiell inhibering av ROS-avhengige Akt reaksjonsvei og aktivering av apoptotiske reaksjonsveier basert på oksydasjon terapi mot magekreft [14]. Imidlertid, som et terapeutisk middel, Ptx har uunngåelig alvorlige bivirkninger på grunn av dets ikke-spesifikke toksiske effekter, og spesielle oppløsningsmidler, og tumorceller kan bli mer motstandsdyktig mot Ptx-indusert apoptose [15-17]. En tidligere studie har vist at tetrandrine har en synergistisk effekt med kjemoterapeutika på apoptose av magekreft cellelinjer [18]. Videre er et derivat (H1) av tetrandrine utøver god anti-multilegemiddelresistens-aktivitet ved å initiere den intrinsiske reaksjonsvei apoptose og hemmer aktivering av ERK1 /2 og akt1 /2 [19]. Disse funnene tyder på at tetrandrine kan erstatte Ptx som første linje kjemoterapi for magekreft.
Siden tetrandrine har et stort potensial i anti-kreft terapi, er det viktig å studere det systematisk for å forstå dens mekanisme. Derfor, i denne studien undersøkte vi de mulige mekanismer for tetrandrine på menneskelige mage kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
Tetrandrine ble hentet fra Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Kina). Antistoffer ble hentet fra følgende kilder: antistoffer mot BCL-2, Bax, BCL-XL, Caspase-3, -8, -9, cytokrom
c
, Apaf-en, og β-aktin var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA); anti-Bad og Bak var fra BioWorld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Den Trizol agenssettet ble kjøpt fra Invitrogen (Grand Island, NY, USA). MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Cell kultur
Den menneskelige magekreft cellelinje BGC-823 ble kjøpt fra Shanghai Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin og 1% streptomycin i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. I korte trekk ble celler sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn. Etter 36 timer ble cellene behandlet med eller uten tetrandrine ved variable konsentrasjoner på 24, 48 og 72 timer; og fosfat-bufret saltvann (PBS) tjente som en negativ kontroll. Deretter ble 20 ul av MTT-fargestoff-oppløsning (0,5 mg /ml, oppløst i PBS og filtrert gjennom en 0,2-mm membran) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter ble 150 ul dimetylsulfoksid tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 10 min. Absorbans ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en 96-brønn mikroplateleser. IC
50 verdien ble definert som konsentrasjonen av stoff som hemmer 50% cellevekst sammenlignet med kontrollgruppen.
Western blotting
Gastric kreftceller ble vasket to ganger med PBS, og deretter 100 ul av RIPA lysebuffer (Beyotime, Kina) ble tilsatt til hver brønn for å lyse cellene i omtrent 20 min. Deretter ble blandingen sentrifugert ved 12.000
g
i 15 min, og supernatanten ble oppsamlet. Proteinkonsentrasjonen ble detektert ved anvendelse av en BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt protein ble separert ved SDS-PAGE på 8%, 10% og 12% polyakrylamidgeler og overført elektroforetisk til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Etter blokkering i 2 timer eller over natten med 5% ikke-fettholdig tørrmelk (oppløst i Tris-bufret saltvann-Tween 20 buffer, TBST), ble membranene inkubert med primære antistoffer (1: 500 til 1: 1000 fortynning) i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C og deretter vasket tre ganger med TBST (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20) før omsetning med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff (1: 5000 -1: 10000) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking tre ganger i 10 minutter hver med TBST ble membranene behandlet med ECL western blotting deteksjonsreagens.
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon
Total cellulær RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens ( Invitrogen) ved å følge fremstilling protokoll og oppløst i DEPC-behandlet vann. Konsentrasjonen av total RNA ble målt ved UV-absorbans-spektroskopi. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, USA) etter produsentens protokoll. Det nylig syntetiserte cDNA ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (Fermentas). Sekvensene av hver primer anvendt i denne studien er vist i tabell 1. Den polymerase chain reaksjonsbetingelser er oppført som følger: 95 ° C i 3 minutter, 95 ° C i 5 minutter, 58 ° C i 30 min, og 72 ° C i 30 minutter, fulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle forsøk ble utført in triplo.
Gene
Sense primer (5 «til 3»)
Antisense primer (5 «til 3’)
bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. Sekvenser av primere for genene brukt i denne studien.
CSV ned CSV
Annexin V-propidiumjodid bindingsanalysen
I korte trekk ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av tetrandrine til 24 timer, og PBS tjente som en negativ kontroll. Deretter ble cellene resuspendert i 500 ul kald bindingsbuffer. Cellesuspensjoner suspen~~POS=TRUNC ble farget mot Annexin-V og propidiumjodid (BD Pharmingen
TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, og deretter flowcytometri analyse ble utført av en FACS (Coulter, Becton Dickinson).
Caspase-3 aktivitetsanalyse
Kort, celler ble inkubert i en 6-brønns plate ved en konsentrasjon på 4 x 10
5 /brønn og ble behandlet med den angitte konsentrasjon av narkotika. et like stort volum av PBS ble anvendt som en negativ kontroll. Caspase-3-aktivitet ble målt ved anvendelse av en caspase-3-aktivitet analysesett (Beyotime, Kina) etter produsentens anvisninger. Absorbansen ble deretter målt ved 405 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Etikk uttalelse
Prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg ble gjennomført i samsvar med NIH retningslinjer (NIH Pub. No.85-23, revidert 1996) og ble godkjent av Animal Care og bruk Committee av de tilknyttede Folkets sykehus, Jiangsu University.
Dyreforsøk
Kvinne hårløse mus (BALB /c nu /nu), 4-6 uker gamle, ble hentet fra Experimental Animal Center of the Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og holdt under spesifikke patogen-frie forhold i et biologisk skap på Forsøksdyr Facility Jiangsu University. Dyrene ble holdt i en 12-timers lys-mørke-syklus. Romtemperatur opprettholdes på rundt 20 ° C, og fuktighet ble holdt på ca 50% i et rom med en filtrert luft.
Tetrandrine behandling av subkutane BGC-823 svulster hos mus
Å etablere en BALB /c-mus xenograft modell av human magekreft, BGC-823-celler ved en konsentrasjon på 5,0 x 106/150 ul ble injisert inn i den høyre flanken til hver BALB /c naken mus. Omtrent 10 dager senere (tumorstørrelsen nådde 120-150 mm3), nakne mus ble tilfeldig delt i tre grupper (N = 5) og gitt de følgende behandlinger: Kontroll (behandlet med normal saltoppløsning), lav dosegruppe (behandlet med 40 mg /kg tetrandrine), og høy dosegruppe (behandlet med 120 mg /kg tetrandrine). BALB /c-mus ble injisert intraperitonealt med tetrandrine (200 ul, 40 mg /kg eller 120 mg /kg) eller et tilsvarende volum av fysiologisk saltvann, en gang daglig i 3 uker, respektivt. Tumorstørrelsen ble målt hver 3. dag i to vinkelrette dimensjoner med Vernier calipers, og tumorvolumet (TV) ble beregnet ved formelen: TV = lengde (mm) x bredde
2 (mm
2) × 0,5 . Relativ tumorvolum (RTV) ble beregnet i henhold til følgende formel: RTV = tv
t /TV
0, hvor TV
0 er tumorvolumet på dag 0 og TV
t er svulsten volum på en gitt dag t. I mellomtiden ble dyrene veid to ganger pr uke. Ved slutten av forsøket ble tumorene skåret ut og fiksert i formalin for ytterligere analyse.
Immunhistokjemisk analyse
parafininnstøpte prøver skåret ut fra BGC-823 nakne mus ble farget ved anvendelse av følgende antistoffer : BCL-2 og Bax (BOOSTER), BCL-XL, aktivert caspase-3, og aktivert caspase-9 (Santa Cruz) for immunhistokjemi. Bilder ble tatt med et fluorescens-mikroskop (Carl Zeiss).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger, og alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Statistiske forskjeller ble bestemt ved en-veis ANOVA SPSS 16,0 programvare. En P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være betydelig.
Resultater
cytotoksiske effekten av tetrandrine på BGC-823 celler
Den kjemiske strukturen til tetrandrine er vist i figur 1A. Den anti-proliferative effekt av tetrandrine ble undersøkt i BGC-823 celler ved anvendelse av MTT-analysen. Som vist i Figur 1B, ble cellene behandlet i 24, 48, og 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av tetrandrine. Tetrandrine ble funnet å hemme veksten av BGC-823-celler i en dose- og tidsavhengig måte. BGC-823-celler ble signifikant inhibert ved tetrandrine ved 10 ug /ml (
P
0,05). IC
50 verdi var 6,104 ± 0,786, 4,471 ± 0,650 og 3,744 ± 0,573 etter 24, 48 og 72 timer av tetrandrine behandling, henholdsvis. Således ble 6, 8, og 10 ug /ml bestemt som de representative konsentrasjoner i følgende studier.
(A) Den kjemiske strukturen til tetrandrine. (B) Celleformering ble bestemt ved en MTT-analyse, og BGC-823-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av tetrandrine ved 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Hemmingshastigheten av kontrollgruppen ble satt til 0. Data er uttrykt som middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001 sammenlignet med kontrollgruppen, respektivt.
Induksjon av apoptose ved tetrandrine
Tetrandrine-mediert anti-kreft egenskaper har blitt rapportert å være assosiert med apoptose [9-12]. Følgelig, undersøkte vi muligheten for tetrandrine-indusert apoptose av BGC-823-celler ved anvendelse av en strømningscytometri-analyse. Som målt ved strømningscytometri, er effekten av tetrandrine på BGC-823 celle apoptose vist i figur 2A og B, med 24-h tetrandrine behandlinger på 0, 6, 8, og 10 ug /ml resulterer i 4,35%, 11,4% , 17,72% og 32,34% av apoptotiske celler, henholdsvis, og tetrandrine (8 ug /ml) i 0, 12, 24, og 48 timer resulterer i 3,4%, 6,64%, 19,15% og 25,85% av apoptotiske celler, respektivt (figur 2C og D). Disse dataene klart indikerte at tetrandrine indusert apoptose i BGC-823-celler i en dose- og tidsavhengig måte. Antallet av apoptotiske celler økte sammen med tetrandrine konsentrasjon og behandlingstiden.
A PI-Annexin V-FITC bindingsanalysen ble anvendt for å detektere apoptose av BGC-823-celler. (A) celler behandlet med tetrandrine i 24 timer ved 0, 6, 8, og 10 ug /ml. (C) Cellene ble behandlet med 8 ug /ml tetrandrine for 0, 12, 24 og 48 timer. (B, D) Søyler representerer gjennomsnitt ± SD av apoptotiske celler hentet fra tre uavhengige forsøk. **
P
0,01; ***
P
0.001 versus kontrollgruppen.
Tetrandrine-mediert uttrykk for BCL-2 familiemedlemmer
For å undersøke mer spesifikk mekanisme på induksjon av apoptose i BGC-823 celler ved tetrandrine, vi har oppdaget at ekspresjonen av apoptose-relaterte proteiner ved Western blotting og deres mRNA-nivå ved sanntids (RT) -PCR. Her studerte vi uttrykk for Bax, Bad, Bak, Bcl-2, og BCL-XL i BGC-823 celler behandlet med tetrandrine. Etter 24 timer med eksponering for tetrandrine, Bax, Bad, og Bak protein uttrykk ble doseavhengig økt, mens BCL-2 og Bcl-xl protein uttrykk var doseavhengig redusert (figur 3A). Vi fant også at tetrandrine kan oppregulere ekspresjonen av Bax og nedregulere ekspresjon av Bcl-2 i en tidsavhengig måte (figur 3B). For å bestemme hvorvidt tetrandrine vil påvirke gentranskripsjon av bcl-2, bcl-xl, og Bax, ble deres mRNA-ekspresjon undersøkt ved hjelp av RT-PCR (figur 3C). RT-PCR-resultater klart falt sammen med de som er vist i figur 3A.
(A) Western blot analyse av ekspresjonen av apoptose-relaterte proteiner i BGC-823-celler behandlet med 6, 8 og 10 ug /ml tetrandrine i 24 timer. (B) Western blot-analyse av bcl-2 og bax behandlet med 8 ug /ml tetrandrine for 12, 24, 48 og 72 timer. (C) Effekter av tetrandrine på uttrykket nivåer av bcl-2, bcl-xl, og Bax ble bestemt ved hjelp av sanntids-PCR (1), kontroll (2) 6 ug /ml (3) for 8 ug /ml (4) 10 ug /ml. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD av minst tre forsøk. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0.001 versus kontrollgruppen.
Tetrandrine-indusert apoptose via en mitokondrie vei i BGC-823 celler
For å undersøke om tetrandrine-indusert apoptose var assosiert med aktivering av caspase medlemmer, vi målte ekspresjonen av kaspasene i BGC-823-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av tetrandrine ved hjelp av Western blotting. Resultatene viste en doseavhengig økning av spaltet caspase-3 og spaltet caspase-9 i tetrandrine- behandlede celler (figur 4A). Imidlertid ikke detekterbare nivåer av spaltede kaspase-3 og kaspase-spaltet 9 ble funnet i cellene i fravær av tetrandrine behandling (data ikke vist). For ytterligere å bestemme hvilken rolle caspaseaktivering i tetrandrine-indusert apoptose, ble BGC-823-celler forbehandlet med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (10 uM) i 4 timer, og deretter behandlet med 8 ug /ml tetrandrine for 24 h. Sammenlignet med kontrollen, ble de relative aktivitetene av caspase-3 økte i BGC-823-celler behandlet med kun tetrandrine (figur 4B). I tillegg utgivelsen av cytokrom
c
økte på en doseavhengig måte ved tetrandrine. En representativ flowcytometri Resultatet viste at cellene forbehandlet med Z-VAD-FMK sterkt redusert tetrandrine-indusert apoptose, og at bare et lite antall av apoptotiske celler ble påvist (figur 4C). Deretter undersøkte vi ekspresjonsnivået av cytoplasmatisk cytokrom
c
, som frigjøres fra mitochondria inn i cytoplasma i løpet av apoptose, handlet på apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1) ved å øke bindingen av Apaf- 1 til ATP /dATP, og induserte caspase-9-avhengig aktivering av kaspase-3 [20-22]. Det ble funnet at tetrandrine signifikant økt ekspresjon av cytokrom cytoplasmatiske
c
og Apaf-1 i BGC-823-celler på en doseavhengig måte (figur 4D). Sammen utgjør disse resultatene antydet at en mitokondriene-mediert reaksjonsvei caspase kaskade var involvert i tetrandrine-indusert apoptose.
(A) Western blot analyse av ekspresjonen av procaspase-3, spaltet caspase-3, og spaltet caspase- 9 i BGC-823-celler behandlet med tetrandrine på 6, 8, og 10 ug /ml i 24 timer. (B) Cellene ble forbehandlet med eller uten pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (10 uM) i 4 timer, etterfulgt av behandling med tetrandrine 8 ug /ml i 24 timer, og den relative aktivitet av kaspase-3 ble målt ved hjelp av en caspase-3 aktivitetsanalyse. (C) BGC-823-celler ble forbehandlet med eller uten z-VAD-FMK (10 uM) i 4 timer, etterfulgt av behandling med tetrandrine 8 ug /ml i 24 timer. A PI-Annexin V-FITC bindingsanalysen ble anvendt for å detektere apoptose av BGC-823-celler. (D) Western blot analyse av ekspresjonen av cytoplasmatiske cytokrom
c
og Apaf-1 i BGC-823-celler behandlet med tetrandrine på 6, 8, og 10 ug /ml i 24 timer. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD av minst tre forsøk. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0.001 versus kontrollgruppen.
Anti-tumor effekt av tetrandrine på BGC-823 nakne mus xenografter
Siden tetrandrine ble funnet å hemme veksten av BGC-823 celler
in vitro
, vi evalueres ytterligere anti-tumor effekt av tetrandrine
in vivo
med etablerte xenograft-modeller. Som vist i figur 5A, kan tetrandrine effektivt å hemme tumorvekst etter en 24-dagers behandling. Ved slutten av 24 dager var den gjennomsnittlige tumorvolum var 493.06 mm
3 og 1243.00 mm
3 i høydosegruppen og lavdose-gruppen, henholdsvis, svarende til 80,52% og 50,9% hemning hastighet sammenlignet med kontroll gruppe. I tillegg ble tumorvekten redusert som et resultat av behandling med tetrandrine ved begge konsentrasjoner (Figur 5B 0.001 versus kontrollgruppen.
Group (n = 5)
Tumor volum (mm
3)
Hemmende Rate (%)
Tumorvekt (g)
Hemmende Rate (%)
control2531.78 ± 153.251.194 ± 0.10Tet (40 mg /kg) 1243.00 ± 55.19
*** 50.900.641 ± 0,06
*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493,06 ± 145,63
*** 80.520.298 ± 0,09
*** 75.04Table 2. Hemming av tetrandrine (Tet) på tumorvekst av nakne mus.
***
P
0.001
versus
kontrollgruppen. CSV Last ned CSV
Tetrandrine-indusert apoptose i BGC-823 xenografter
Immunohistochemistry analyse av tumorvev skåret ut fra BGC-823 xenopodet hårløse mus bekreftet at apoptose hadde skjedd i tetrandrine behandlet svulster og at mitokondrie veien spilt en betydelig rolle ved apoptose. Det var fem nakne mus i hver gruppe. Vi har observert at ekspresjon av Bcl-2 og Bcl-xl ble redusert, mens proteinnivåer Bax, aktivert caspase-3, caspase-aktivert og 9 ble betydelig forbedret ved tetrandrine (figur 6). Alle disse funnene sterkt bekreftet at tetrandrine kan indusere apoptose, i samsvar med
in vitro
studie
Immunhistokjemisk farging for apoptose relaterte proteiner:. BCL-2, BCL-XL, Bax, Aktivert caspase -3, og aktivert Capase-9. Forstørrelse er 200 ×. Representative mikrofotografier av tre grupper vises. DAB farget immunreaktive celler (mørk brun).
Diskusjoner
Magekreft, den fjerde vanligste diagnosen svulst bak kreft i lunge, bryst, tykktarm og endetarm, forårsaker nesten en millioner årlige dødsfall og har vært den andre årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [23-26]. Kirurgi, kjemoradioterapi, og molekylær målrettet terapi har vært de viktigste behandlingsstrategier i behandling av magekreft [27]. Selv kirurgisk reseksjon har vært den mest effektive helbredende behandling, resultatene er inkonsekvent og begrenset av svulst tilbakefall og chemoresistance. Konvensjonelle kjemoterapeutiske legemidler, som for eksempel PTX 5-fluorouracil og cisplatin drepe kreftceller ved å fremkalle apoptose og autofagi; men kreftceller kan bli resistente mot narkotika-indusert apoptose [17,28,29].
Det er rapportert at tetrandrine har sterk anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
i vivo
i mange kreftceller, slik som A549 humane lungekarcinomceller, blærekreftceller, tykktarmskreftceller, hepatomceller, og så videre [9-12]. En tidligere studie viste at tetrandrine kan spille en lovende rolle ved synergistisk interaksjon med kjemoterapeutika muligens av sine synergieffekter på indusere apoptose og downregulating kjemoterapeutika assosierte gener i MKN-28 celler og BGC-823 celler [18]. Imidlertid har mekanisme tetrandrine på menneskelige magekreft BGC-823 celler ikke blitt identifisert. I denne studien viste vi at tetrandrine viste potent antitumoraktivitet mot human magekreft
in vitro Hotell og
in vivo
, belyse de underliggende virkningsmekanismer.
For det første, vår resultatene viste at tetrandrine effektivt hemmet BGC-823 celleproliferasjon analysert ved MTT i en dose- og tidsavhengig måte. I mellomtiden, IC
50-årene av tetrandrine var omtrent 6,1, 4,5 og 3,7 ug /ml i BGC823 celler for 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Ifølge tidligere studier, cellegifter drepe solide tumorer hovedsakelig ved å indusere apoptose [30-32]. Vi fant at apoptose ble indusert ved tetrandrine på en konsentrasjonsavhengig måte ved strømningscytometri-analyse med økt tidlige apoptotiske celler og sent apoptotiske celler i magekreft BGC-823-celler.
i mammalske celler, apoptose kan utløses av den ytre vei aktivert ved døden reseptoren og indre vei regulert av BCL-2 familiemedlemmer og caspase kaskader i mitokondrie [33,34]. I vår studie, tetrandrine økt uttrykk av de pro-apoptotiske proteiner Bax, Bad, og Bak og redusert protein nivåer av BCL-2 og Bcl-xl. Derfor er det et øket forhold av anti- og pro-apoptotiske proteinekspresjon, slik som Bax /Bcl-2-forhold, ville føre til tap av mitokondriemembranpotensialet. Dysfunctioning mitokondrier utgivelser cytokrom
c
, som akkumuleres i cytosol og danner et kompleks med apaf-en. I den intrinsiske reaksjonsvei, som en effektor, blir caspase-3 spaltet ved aktivering av kaspase-9 [35-37]. I denne studien, viste vi at caspase-9 og caspase-3 ble aktivert av tetrandrine. Den pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK redusert apoptose i BGC-823 celler, noe som indikerer at mitokondrie pathway spiller en sentral rolle i tetrandrine-indusert apoptose.
Det er rapportert at tetrandrine kunne snu motstanden mot mange kjemoterapi narkotika, for eksempel Ptx og doxorubicin i KBv200 og K562 naken mus xenograft modeller [38,39]. Tetrandrine besitter også en sterk evne til å hemme angiogenese i hjernesvulst hos rotter [40]. Videre er resultatene indikerte at tetrandrine oppviste sterk anti-tumor-aktivitet ved å hemme tumorvekst og indusering av apoptose i den etablerte BGC-823 naken mus xenograft modell.
Som konklusjon, våre data viste at tetrandrine vesentlig indusert apoptose i humane magekreft BGC-823 celler og dens naken mus xenograft modeller. Tetrandrine-indusert apoptose var assosiert med aktivering av apoptose indre reaksjonsvei. Basert på disse resultatene, kan tetrandrine ha stort potensial i behandlingen av menneskelige magekreft i fremtiden.
Takk
Vi vil gjerne takke medlemmene i klinisk medisin Institutt for Jiangsu-universitetet for deres teknisk assistanse.
