Abstract
Bakgrunn
Vi brukte intensive moderne proteomikk tilnærminger til identifisere prediktive proteiner i eggstokk kreft. Vi identifiserer oppregulert proteiner i både serum og peritoneal væske. For å vurdere den generelle ytelsen til den tilnærmingen vi spore atferden til 20 validerte markører på tvers av disse eksperimentene.
Metodikk
Massespektrometri baserte kvantitative proteomikk følgende omfattende protein fraksjonering ble brukt til å sammenligne serum av kvinner med serøs eggstokkreft til friske kvinner og kvinner med godartet ovarietumorer. Kvantifisering ble oppnådd ved isotopisk merking cystein aminosyrer. Etikett-free massespektrometri ble brukt til å sammenligne peritonealvæsken tatt fra kvinner med serøs eggstokkreft og de med godartede svulster. Alle data ble integrert og kommentert basert på om proteinene er tidligere validert ved hjelp av antistoffbaserte analyser.
Funn
Vi valgte 54 kvantifiserte serumproteiner og 358 peritonealvæsken proteiner som kasus-kontroll forskjeller skredet en forhåndsdefinert terskel. Sytten proteiner ble kvantifisert i både materiale og 14 er ekstracellulært. Av 19 validerte markører som ble identifisert alle ble funnet i kreft peritoneal væske og en undergruppe av 7 ble kvantifisert i serum, med en av disse proteiner, IGFBP1, nylig godkjent her.
Konklusjon
Proteome profilering påført på symptoma eggstokkreft tilfeller identifiserer et stort antall oppregulert serumproteiner, hvorav mange er eller har blitt bekreftet av immunoanalyser. Antallet kjente validerte markører er høyest i peritoneal væske, men de utgjør et høyere prosentandel av proteinene observert i både serum og peritoneal væske, noe som tyder på at de 10 ytterligere markører i denne gruppen kan være kandidater av høy kvalitet.
Citation: Amon LM, Law W, Fitzgibbon MP, Gross JA, O’Briant K, Peterson A, et al. (2010) Integrative proteomikk analyse av serum og Peritoneal Fluids bidrar til å identifisere proteiner som er oppregulert i serum av kvinner med eggstokkreft. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10,1371 /journal.pone.0011137
Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children forskningsfond, USA
mottatt: 26 mars 2010; Godkjent: 26 mai 2010; Publisert: 15 juni 2010
Copyright: © 2010 Amon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet har blitt finansiert delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, i henhold til tilskudds tall U01 CA111273, P50 CA83636, kontrakt No. HHSN261200800001E, og Canary Foundation. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjer ved Institutt for helse-og omsorgs, heller ikke nevner av varemerker, kommersielle produkter, eller organisasjoner innebærer godkjennelse av den amerikanske regjeringen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OC) er en ledende årsak til lidelse og død for kvinner i USA, og diagnostisere det på en pre-metastatisk stadium kan dramatisk redusere dødelighet. Selv OC utgjør bare 4% av alle kreftdiagnoser hos kvinner (National Cancer Institute. https://www.cancer.gov) det er den mest dødelige av alle gynekologiske kreftformer. Som med mange kreftformer, er en kvinnes overlevelse [1] med OC sterkt assosiert med sin scenen på diagnose. Serøs eggstokkreft (SOC) er den mest utbredte og dødelige histologi; over 70% av alle OC tilfeller er diagnostisert i en metastatisk stadium.
Tidlig påvisning strategier for OC tiden under evaluering har vanligvis involvert å kombinere en eller flere blodbaserte markører (vanligvis markøren CA 125) som et middel for å henvise kvinner til en bekreftende avbildningsfunksjonalitet som transvaginal sonography. Når du bruker en markør som en første-linje skjermen, vil ytelsen til hele screening strategien være begrenset av resultatene av denne markøren og en kritisk viktig ytelse attributt for en tidlig deteksjon markør er ledetid, dvs. hvor tidlig i sykdomsprosessen markøren løfter. Selv om foreløpige resultater tyder på at det å oppnå en positiv prediktiv verdi terskel på 10% [2] er mulig ved hjelp av sekvensiell multimodal tilnærming, modellering tilnærminger [3] – [6] og pre-kliniske valideringsstudier profilering CA 125 og andre markører [7 ] tyder på at ledetid hentet fra CA 125 kan være utilstrekkelig til menings redusere dødeligheten i en stor andel av kvinner.
Mange markører annet enn CA 125 er identifisert og validert i uavhengige studier med prøver samlet på tidspunktet for klinisk diagnose [8] – [18]. Vi viser til disse markørene som «validerte prediktive proteiner «, som vi mener proteiner bekreftet ved hjelp av immunologiske analyser i flere uavhengige utvalg, og derfor som en gruppe, vil sannsynligvis være overveiende sanne positive. Flere nylig, mange av disse markørene er evaluert i prøver tatt før diagnose og foreslå at vi kan forvente noen proteiner validerte i symptomatisk sykdom til også å heve før symptomene utvikler [7]. Åpenbart vil forbedre tidlig deteksjon for SOC krever identifisering av nye klasser av markører, muligens av plasma eller serum proteomikk tilnærminger.
Et mål med vår studie omfatter identifisering flere markører som bruker serum proteomikk. Imidlertid har muligheten for å oppdage differensial proteiner i serum og plasma vært kontroversiell og ikke allment vellykket, og så et sekundært mål med studien er å validere den totale serum proteomet eksperimentelle arbeidsflyt ved hjelp av flere markører som gull standarder. I dette manuskriptet beskriver vi et sett av proteomikk eksperimenter som avhøre komplekse blandinger av menneskelige OC biomaterialer. Forsøkene hadde to formål; den første var å identifisere tidligere uidentifiserte proteiner som kan være flere kandidater som prediktive markører. Den andre var å validere serum proteomikk tilnærmingen ved å spore atferden til kjente validerte prediktive proteiner for å fastslå at plattformen er i stand til å oppdage markører. Tidlig plasma og serum proteomet oppdagelse innsats, oftest avhengig SELDI eller MALDI metoder [19] – [26], har i stor grad mislyktes i denne forbindelse. Nyere tilnærminger ved hjelp av tandem MS kombinert med intensiv fraksjonering [27] – [29] kan være mer passende for serum og plasma biomarkører som de er blitt vist å identifisere proteiner for kreft i bukspyttkjertelen [30] som har blitt videre validert. Men fordi suksess for enhver oppdagelse tilnærming vil sikkert avhenge av sykdomskarakteristika så mye som teknologien, før du investerer ressurser i å utvikle antistoffer for nye markører, vi først ønsket å bekrefte at tilnærmingen er i stand til å produsere reproduserbare resultater.
Vi har avlest både et sirkulerende fluid, serum, og et fluid proksimalt til tumoren, ascitesvæske eller peritoneal væske fra kontroll pasienter med benigne tumorer serøse (BST). Vi gjennomførte to ulike eksperimenter på serum: Det første eksperimentet sammenlignet serum bassengene fra metastaserende SOC pasienter til bassengene fra tilsvarende friske asymptomatiske frivillige; det andre eksperimentet sammenlignet serum bassengene fra et annet sett med metastaserende SOC pasienter til serum bassengene fra kvinner med BST. For de proksimale væske eksperimenter, vi sammenlignet bassenger av ascitesvæske fra metastaserende SOC pasienter til bassenger av peritoneal væske fra pasienter med BST. I alle forsøkene ble prøver matchet basert på alder, lagring varighet, hormonbehandling bruk og tid for samling før operasjonen (for saksbehandling /kontroll sammenligning). Ved å kombinere disse datasettene og identifisere proteiner som synes å være oppregulert i SOC i både serum og væske proksimale til svulsten, håper vi å berike vårt potensial kandidatlisten med kreftspesifikke markører.
Resultater
Stempler av proteiner basert på eksisterende dataressurser
En liste over 21 proteiner tidligere vist seg å være oppregulert i plasma eller serum av SOC sammenlignet med friske kontroll av ELISA-analyser ble utarbeidet ved å undersøke OC biomarkør litteratur. Vi identifiserte disse proteinene samt en ekstra protein, IGFBP1, oppdaget og validert i dette arbeidet som sanne positive kontroller. Fire av de sanne positive proteiner ble ikke identifisert i enten plasma eller peritoneal væske: MUC16 [31] – [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (aliaser CA 125, DcR3, B7-H4, henholdsvis ) og VEGF [16]. Tabell 1 viser de 19 sanne positive proteiner som ble identifisert i plasma eller peritonealvæske [14], [16], [17], [31] – [33]. Alle av dem ble observert og kvantifisert i peritoneal væske, og 7 ble observert i plasma; ingen positive kontroller ble identifisert utelukkende i plasma.
Serum sammenligninger
Serum proteomikk eksperimenter (beskrevet nedenfor) sammenlignet metastatisk serøs eggstokkreft (SOC) til enten friske asymptomatiske (HA) kvinner eller kvinner med godartede serøs tumorer (BST). Tabell 2 viser det totale antall kvantifisert proteiner i hvert serum eksperiment. Over 360 proteiner ble kvantifisert i hvert forsøk, og en total på 470 proteiner ble kvantifisert i det minste i det ene eller det andre eksperimentet. Kollapser disse proteinene av genet symbol resultater i litt lavere total grunn av ulike isoformer identifisert for det samme genet. I figur 1 er tilknytningen mellom log2 Graden for alle kvantifisert proteiner av genet symbol for de to serum eksperimenter plottet (horisontale og vertikale akse reflektere SOC versus HA og SOC versus BST, henholdsvis). Legg merke til at alle forhold er orientert slik at en positiv verdi innebærer en protein-forhold høyere i SOC. Proteiner som ikke ble observert i ett eksperiment er representert ved en pseudo-forhold på «1» (log2 = 0) for dette eksperimentet.
grønne punkter representerer proteiner oppregulert i begge forsøk. Blå punkter representerer proteiner oppregulert i ett eksperiment og ikke observert i den andre. * Benchmark markør validert av ELISA-analysen; ** Ny markør validert av ELISA-analysen
Figur 1 viser et lovende mønster som man kan forvente å se i et eksperiment som sammenligner to komplekse blandinger og der enkelte differensial proteiner er observert.: de fleste proteiner faller nær opprinnelse og varierer i et ukorrelert måte siden ingen systematiske endringene skjer, men en rekke av dem i øvre høyre kvadrant trend bort fra bulk. For det formål å karakterisere våre resultater, merk vi et protein som oppregulert hvis dens konsensus-forholdet tilfredsstiller eller overskrider en to-gangers endring (dvs. log2 (SOC /HA) + log2 (SOC /BST) ≥1 som antydet ved linje i figur 1). Alle 54 proteiner møte dette kriteriet vises i grønt hvis observert i begge sammenligninger eller blå hvis observert i bare ett. Disse proteinene er også oppført i tabell S1 (i tilleggsinformasjon).
De proteiner som tilsvarer vår «benchmark» proteiner fra tabell 1 er merket med en stjerne. Det ble observert totalt syv referanse proteiner i serum inkludert seks som tidligere ble validert, samt en ekstra markør, IGFBP1, vises med en dobbelt stjerne, som vi validert her basert på disse eksperimentene. Alle sju av de observerte referanse proteiner var oppregulert etter våre kriterier. Den observerte anrikning (7 av 7) er svært signifikant (p-verdi = 1e-6), som viser at vår serum proteomikk analyser finner høyt samsvar med validerte analyser.
peritonealvæsken eksperimenter
peritonealvæsken eksperimenter er sammenlignet ved hjelp av en etikett-fri metode som tillater oss å kvantifisere alle observerte proteiner, ikke bare de som inneholder en isotopisk merket cystein aminosyre. Etter å ha kollapset av genet symbol, er 2950 proteiner observert i begge forsøkene. Sammenligningen av log2 (peptid spektrale tellinger) mellom SOC til BST er plottet i figur 2. For enkelthets skyld, proteiner med spektral telling = 0 i en væske, men det observeres i det andre fluid er satt til 0,5. Vi definerer et protein som oppregulert hvis den har en SOC peptid telle minst to ganger høyere enn den tilsvarende BST peptidet teller. Fra 2950 identifiserte proteiner ved genet symbol, er 358 valgt som potensielt oppregulert basert på dette kriteriet (se tabell S1). Proteiner som ble også funnet oppregulert i serum eksperimentene er vist i rødt. Vi har også kommentere disse proteinene rapportert av Kuk
et al product: [34] som vurderes SOC ascitesvæske. I våre eksperimenter, er 73 av de Kuk kandidatene observert, er vist i blått på figur 2, og fordeles mye mellom SOC og BST teller med bare 37 oppregulert. Kuk
et al
ikke vurdere materialet fra BST. Som i serum eksperimenter, fant vi en betydelig berikelse av validerte biomarkører blant oppregulert proteiner i ascitesvæske. Av de 19 referanse proteiner observert i enten peritonealvæsken (merket i figur 2), alle unntatt to, MIF og MSLN, var oppregulert (p-verdi = 2e-16). Merk at MIF oppregulering er muligens forbundet med prøve konstatering skjevhet [9]. Dataene her er i tråd med konklusjonene fra Kuk
et al.
At kreft ascitesvæske kan være en verdifull ressurs for å identifisere biomarkører kandidater, selv om våre resultater fra BST tyder på at mange av dem ikke vil være kreft bestemt.
Røde punkter er oppregulert i SOC serum. Blå punkter er proteiner observert i eggstokkreft ascitesvæske ved Kuk et al [34]. Benchmark proteiner er merket. Punktene ovenfor grønn stiplet linje anses oppregulert i peritonealvæsken.
Sammenligning av serum versus peritonealvæsken
For å sammenligne to forskjellige typer væske, konsensus log2 forholdstall enn både serum~~POS=TRUNC eksperimenter ble plottet mot log2 forholdet mellom SOC ascitesvæske spissen BST peritoneal væske, som vist i figur 3. på grunn bare proteiner observert i både materialer kan plottes, omfatter denne sammenligningen bare de 358-proteiner observert i både serum og peritoneal væske. I alt 17 av disse proteiner ble betegnet som oppregulert i begge sett. Den samlede overensstemmelse mellom alle proteiner, som målt ved korrelasjon i de forhold som er ikke sterk, men dette er ikke uventet, siden de fleste proteiner som ikke endrer seg mellom de to kildene og for de eksperimentelle kilder variasjon bør dominerer. Bare blant proteiner som systematisk varierer mellom sak og kontroll skal vi finne samstemmighet. De 17 proteiner som er oppregulert i begge forsøk (oppført i tabell 3 og vist i blått i figur 3) er sterkt anriket for de validerte biomarkører som er oppført i tabell 1. Alle de syv observerte referanseproteiner, målt i begge forsøk ble det funnet oppregulert (p-verdi = 2E-16). Men den største fordel vi observere ved hjelp av overlappingen av de to forsøk er en vesentlig økning i prosentandelen av gyldige markører blant alle oppregulert markører. I serum, 15% av oppregulert proteiner var referanse proteiner og i ascitesvæske kandidatlisten, 5% var referanse proteiner. Hvis vi bruker overlapping av de to eksperimenter, hvor mange prosent av kandidat proteiner fra validerte referanseliste øker til 7 av 17 (41%).
Proteiner oppregulert i begge væskene er farget blå. * Benchmark markør validert av ELISA-analysen; ** Ny markør validert av ELISA-analysen.
I tillegg til eksperimentelle data, Tabell 3 inneholder også annotering for to GO kategorier, ekstracellulære region og provoserende eller respons på såret der et «ja» indikerer at proteinet blir annotert for dette ordet enten på blad eller en foreldrenoden. Den «ekstracellulær region» term indikerer at proteinet er lokalisert utenfor plasmamembranen, og kan bli utskilt i blodet. Av de 17 proteinene, 14 (82%) av dem er kommentert som ekstracellulære sammenlignet med 17% av alle proteiner observert i forsøkene. Dette misforhold støtter hypotesen om at ved å kombinere data fra sirkulerende og proksimale væsker kan vi være mer sannsynlig å oppdage protein biomarkører utskilt eller kaste fra svulsten i stedet for å utlede andre steder i verten. Vi har også inkludert GO vilkår knyttet til betennelse i denne tabellen for å utelukke proteiner som kanskje ikke er kreft-spesifikke. Bare to av de 17 overlapper proteiner er kjent for å være involvert i betennelsen.
ELISA validering av IGFBP1
validering status for alle 17 kandidat proteiner er angitt i Tabell 3. Commercial ELISA-analyser er tilgjengelige for 8 av de 17 proteinene. Av disse seks ble validert i tidligere studier (se tabell 1). De resterende to proteiner fra denne studien, MMP9 og IGFBP1, ble analysert i denne studien.
Valideringen ble utført i tre etapper. I det første trinnet, ble markørene testet i en serie av blandinger med varierende forhold av samlet sera fra pasienter OC og samlet sera fra HA kontrollene fra filtrerings sett av prøver (50 OC, 9 HA kontroller) som er beskrevet i Methods. Begge proteiner hadde høye konsentrasjoner i høy OC bassenget, men bare IGFBP1 viste en konsentrasjon avhengighet med forholdet mellom eggstokkreft sera å kontrollere. Begge proteiner ble deretter testet mot enkeltprøver fra filtrering sett (12 OC, 12 HA kontroller) beskrevet i metodene. IGFBP1 nivåene var signifikant høyere hos kreft serum (p-verdi = 0,0097), mens MMP9-nivåer var ikke (p-verdi = 0,20). Et tredje sett av prøver som var begrenset til serøse eggstokkkrefttilfeller (44 SOC, 78 HA kontroller) ble anvendt for å bekrefte heving av IGFBP1. I dette datasettet, betydningen av saken for å kontrollere forskjellen økt til 5.0e-4 og ROC-kurven hadde en AUC på 0.860. ROC-kurven for disse prøver er vist i figur 4 viser evnen til å klassifisere IGFBP1 OC versus HA og BST-kontroller, og viser resultater i samsvar med virkemåten i proteomics forsøkene.
SOC vs HA er vist i sort og SOC vs BST i blått
Diskusjoner
proteomikk profilering av serum eller plasma til å oppdage kreft biomarkører har ennå ikke møtt med mye demonstrert suksess [19] -. [26] hvor proteinene var validert i uavhengige utvalg eller ved hjelp av uavhengige plattformer. Ett unntak er en kreft i bukspyttkjertelen studie ved hjelp av en musemodell og grundig fraksjonering av intakte proteiner [30]. I dette manuskriptet har vi brukt en lignende tilnærming for tandem MS proteomikk profilering av serum i kombinasjon med profilering av peritoneal væske som proksimale svulst væske. Vi har produsert en kort liste over 17 biomarkører funnet opp regulert i både serum og proksimale væske – som består av 7 proteiner som er validert ved hjelp av eksisterende ELISA-analyser, inkludert en ny SOC biomarkør (IGFBP1). De resterende 10 markører i denne gruppen kan representere høy kvalitet kandidater.
Vår suksess i å identifisere mange validerte markører kan ha resultert fra en rekke funksjoner i den eksperimentelle design. Prøve skjevhet ble eliminert ved forsiktig prøvetaking og tett matchende tilfeller til kontroller. I tillegg sams basert på alder, rase og familiehistorie med OC, ble kontroller også matches på HRT bruk og antall dager før kirurgi ved blodprøvetaking. HRT har vist seg å dramatisk påvirke nivåene av mange serumproteiner [35], [36]. Thorpe
et al product: [37] har vist at blod trekkes operasjonsdagen er forbundet med heving av flere serumproteiner. Denne skjevheten ble unngått her ved forsiktig prøve matching basert på case /kontroll samling tilstand. Et annet viktig aspekt ved denne analysen var bruken av omfattende prøvefraksjonering før MS. Denne konstruksjon, som har vist seg å skaffe sensitiviteter på 10 ng /ml konsentrasjon [35], [36], tillates større dybde av proteom- dekning ved tandem-MS for å identifisere potensielt relevante endringer.
Et viktig trekk ved utformingen av serum forsøkene ble ved bruk av tre forskjellige typer objekter: eggstokkkreftpasienter, friske asymptomatiske frivillige og pasienter med benigne tumorer. Proteiner oppregulert i SOC i forhold til HA, men ikke i forhold til BST er ikke sannsynlig å være kreft-spesifikke og ble eliminert fra betraktning. Det samme var tilfelle med proteiner oppregulert i forhold til BST men ikke til HA. Bare ved hjelp av SOC vs BST sammenligning, ville vi ha funnet 5 av 7 kvantifiseres validerte markører i motsetning til 7 av 7 (TIMP1 og SLPI vil bli fjernet).
Kombinere serum data med data fra proteomikk profilering av peritoneal ascitesvæske tillot oss å identifisere en gruppe av proteiner som har en stor andel av de sanne positive proteiner; eliminere proteiner som ikke finnes også i peritonealvæsken redusert våre potensielle kandidater 54-17 og samtidig beholde alle de syv referanse proteiner kvantifiseres i serum. Dette resultatet understøtter hypotesen om at proteiner identifisert i et fluid proksimalt til tumoren og også i en sirkulerende væske vil identifisere effektive biomarkører. Kuk
et al product: [34] viste at ascitesvæske fra pasienter med eggstokkreft inneholdt et stort antall høykvalitets markører, og våre resultater er konkordant med disse funnene. Imidlertid, fordi antallet av referanse proteiner som finnes i peritoneal væske er høyere enn det som finnes i serum, kan man ikke gjøre påstanden om at flere markører kan bli identifisert ved å kreve observasjoner i både serum og proksimale væske. Faktisk våre data, og at fra Kuk
et al.
Tyder på at ascitesvæske proteomikk data kan inneholde større antall høykvalitets markører. Våre funn tyder bare på at krever proteiner for å bli observert i begge prøvene kan føre til en større andel av høykvalitets markører. Denne hypotesen kan ikke bekreftes, men uten også systematisk evaluering sant negative markører samt sanne positive. Dessuten, ikke identifisere alle kjente markører angir ikke at markøren ikke er av høy kvalitet og heller ikke at prosessen er nødvendigvis feil. For eksempel, vår plattform var ikke i stand til å identifisere CA 125 eller tre andre markører som vi i utgangspunktet valgt som referanse proteiner, muligens på grunn av følsomhet begrensninger på massespektrometri. Men gitt at en plattform er i stand til å kvantifisere eksisterende validerte markører, ville man finne samsvar mellom de to plattformene betryggende, som vi fant her.
I deres kombinerte data fra fire ulike fraksjoneringsmetoder Kruk
m.fl. .
identifisert 445 proteiner totalt, en rekke betydelig lavere enn de tusenvis av protein grupper vi observert i våre eksperimenter. Denne forskjellen er delvis på grunn av sitt fokus på subproteome av proteiner mindre enn 100 kDa som vår sett inneholder 490 proteiner større enn 100kDa. Men bruken av intensive fraksjonering kan utgjøre den resterende ulikhet. Til tross for disse forskjellene, konklusjonene i studiet er svært konsistent med våre funn; etter bruk av noen data mining teknikker, de reduserte kandidatlisten til 77 proteiner (inkludert 25 kjente OC markører), 73 av disse ble observert i vår studie. Som det fremgår i figur 2, de relative Forekomsten av Kuk proteiner omfatter noen som er opp så vel som nedover; bare halvparten av disse er opp av to ganger i forhold til den benign peritoneal væske. Av de 19 referanse proteiner observert i enten pool av peritoneal væske, 17 har spektrale teller to ganger høyere i SOC enn BST. Dette tyder på at selv om Kuk
et al
var riktig i sin påstand om at ascitesvæske er en rik kilde til potensielle markører, tyder vårt arbeid at inkluderingen av et kontrollmateriale kan være nyttig for å redusere falske positiver. En av styrkene til denne studien er bruken av relative Forekomsten av SOC til BST å finne proteiner spesifikke for ondartet sykdom.
Spørsmålet om konfunderende inflammatoriske proteiner (nylig behandlet av Checlinska
et al
[38]) er minimert på flere måter i vår studie. Først våre depletion og fraksjoneringsmetoder gi oss tilgang til proteiner utover bare de svært rike de som ofte inkluderer mange proteiner knyttet til betennelse. I tillegg kan hotellets sammenligninger mellom kreft og godartet sykdom filtrere ut mange proteiner som øker på grunn av tilstedeværelsen av en godartet svulst; inflammatoriske proteiner som deles av begge betingelsene er eliminert. Også, siden vi er rettet mot utskilte proteiner ved å se etter overlapping mellom proteiner i den proksimale fluidet og de som er forhøyet i serum, vil vi redusere muligheten av å observere serumproteiner syntetisert i leveren som en inflammatorisk respons. Likevel Tabell 3 inneholder to proteiner (ORM1, SERPINA3) av 17 biomarkør kandidater som har roller i betennelse. Mens vi har kraftig forbedret andelen av biomarkører knyttet til betennelse i forhold til tidligere profileringsforsøk [39], [40], kan vi ikke fjerne alle konfunderende faktorer, og må stole på merknaden når det er tilgjengelig for å fremme filtrering.
I dette arbeidet har vi også oppdaget og validert en ny biomarkør for symptomatisk serøs eggstokkreft, insulin growth factor bindende protein 1. som IGFBP2, er IGFBP1 medlem av insulin-like growth factor bindende protein familie og binder både insulin-lignende vekstfaktorer, IGF1 og IGF2. Som de andre IGFBP er IGFBP1 uttrykt i lokale vev, inkludert eggstokk, og er tilstede i normalt plasma. Serumnivåer av IGFBP1 er betydelig redusert hos postmenopausale kvinner som tar hormonbehandling [35]. Skjønt forhøyede serumnivåer av IGFBP2 er blitt vist i en rekke kreftformer, inkludert ovarial [10], er dette det første bevis på at IGFBP1 nivåene øker i serum eller plasma fra pasienter med kreft i eggstokkene. En annen studie viste forhøyede nivåer av IGFBP1 (og IGFBP2) i plasma fra pasienter med hode og nakke kreft [41].
Til slutt, vi også oppmerksom på at blant de 17 markørene vist seg å være oppregulert i serum og ascitesvæske av SOC, alle unntatt tre utskilles proteiner. Selv om det er rutinemessig hevdet at utskilte proteiner bør foretrekkes som kandidater på grunn av deres evne til å utskille i blodet, er dette kravet ikke støttes ofte empirisk. Våre data gir en sterk støtte for denne allment akseptert hypotese.
Som beskrevet i innledningen av dette manuskriptet, men flere serum biomarkører for ovarian cancer er blitt oppdaget, og validert, alle markørene har vist dårlig ytelse i pre -diagnostic prøver. I denne studien har vi satt ut for å etablere mulighet for proteomikk profilering av serum for å oppdage eggstokkreft biomarkører når det brukes sammen med annet profilering av proksimale væske. Etter å ha demonstrert suksess for denne tilnærmingen, kan vi nå trygt bruke disse metodene til mer krevende pre-symptoma prøver.
Materialer og metoder
Rekruttering og innsamling av humant blod og peritoneal væske for oppdagelsen
All forskning for denne studien ble spesielt gjennomført under Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board godkjent protokoller, IR # 6045 og IR # 6094. Alle humane prøver ble hentet fra personer som har gitt skriftlig samtykke. Data ble analysert anonymt.
Serum fra kvinner med serøs eggstokkreft (SOC), godartede serøs tumorer (BST), og fra friske asymptomatiske (HA) kontroller ble brukt i våre proteomikk oppdagelse og valideringsforsøk. Prøvetaking protokoller, har tidligere blitt beskrevet i detalj andre steder [32], [37]. I korte trekk, serum og peritoneal væske fra kvinner med SOC og BST ble samlet før operasjonen og kjemoterapi som en del av en Eggstokkreft Specialized Program for fremragende forskning (SPORE) finansiert av National Cancer Institute. Diagnostisering av SOC og BST ble bekreftet av sentrale patologi gjennomgang. Alder og hormonbehandling (HRT) matchet HA kontroller ble rekruttert gjennom en eggstokkreft screening-program, der alle pasientene representerer asymptomatiske kontroller. Alle serumprøver, uavhengig av samlingen kilde, ble behandlet med den samme protokoll; blod ble oppsamlet i 10cc Vacutainer Serum Separator rør (SST) og tillatt å stå i 30 minutter til 4 timer ved værelsestemperatur. Rørene ble sentrifugert ved 1200 x g i 10 minutter, deretter delt opp i flere 1-ml porsjoner av serum og lagret ved -80 grader Celsius. Før bruk, hver 1 ml ampulle av serum ble tint på is, delt opp i flere 110-mikroliter subaliquots, og lagret tilbake ved -80 grader Celsius.
peritoneal væske ble oppsamlet i en steril vakuumforseglet beholder i operasjonsstuen ved kirurgisk ansatte. Ved hjelp av en steril sprøyte 1cc, 20.000 enheter heparin (ampuller inneholder 10.000 enheter per ml) ble tilsatt til hver liter væske for å forhindre dannelse av blodpropper. I laboratoriet ble fluidet overført til koniske sentrifugerør (50cc eller 250cc i forhold til væskevolum) og spunnet i en balansert sentrifuge ved 2000 rpm i 5 minutter for å pelletere cellekomponenten. Cell-free supernatant ble overført til en 50cc konisk rør og fem 1,5 ml mikrosentrifugerør for oppbevaring ved -80 fryser grader Celsius.
Valg av prøver for oppdagelse eksperimenter
Bare postmenopausale kvinner ha gjennomsnittlig risiko for eggstokkreft eller brystkreft ble inkludert (gjennomsnittlig risiko innebærer ingen signifikant familiehistorie med brystkreft eller eggstokkreft og ingen tidligere kreftdiagnose) i oppdagelsen eksperimenter. De første serum funn eksperiment sammenlignet kvinner med sent stadium SOC til HA-kontroller og andre i forhold til kvinner med BST. SOC bassenger av størrelse 4 (med friske kontroller) og størrelse 5 (til BST) ble valgt til å være tett matchet med kontroller basert på alder (+/- 2 år), utvalgets lagringstid (+/- 1 år) og HRT [35 ]. Videre fordi samlingen miljø har en kjent effekt på serum proteom- [37], saker og kontroller ble også matchet basert på om blodprøvetaking skjedde samme dag som inngrepet (for SOC versus BST kontroller) eller om de ble samlet tre eller flere dager før kirurgi (for SOC versus HA kontroller). For peritonealvæsken eksperimenter, ble en pool av størrelse 10 SOC prøvene sammenlignet med en pool av størrelse 4 BST prøver. Bassenget størrelse for BST er mindre fordi, mens en stor andel av SOC pasienter utvikler ascites, noen BST pasienter produsere sammenlign ascitesvæske.
Valg av serumprøver for valideringsforsøk
Forsøk å validere proteiner ble utført for to markører i tre tidligere er beskrevet [32], [33] sett av serumprøver. Disse settene inkluderte to filtrerings sett. Det første settet var sammensatt av samleprøver fra 50 OC pasienter (sak basseng) serielt fortynnet med serum fra 9 HA kontroller (kontroll basseng). Det andre sett var sammensatt av individuelle prøver fra 12 pasienter og 12 OC HA kontroller. En tredje større sett av individuelle prøver ble anvendt for å bekrefte proteiner som viste betydelig økning i det andre settet. Fordøyelse ble utført over natten ved 37 ° C.
