Abstract
Survivin er en komponent av det kromosomale passasjer kompleks (CPC) som er nødvendig for nøyaktig kromosom segregering. Forstyrre funksjonen til Survivin i mitosen fører til kromosom segregering feil og defekte cytokinese. Survivin inneholder en Baculovirus IAP Repeat (BIR) og ble derfor opprinnelig klassifisert som hemmer av apopotosis protein (IAP), men dens rolle i apoptose etter cellulært stress fortsatt i stor grad ukjent. Vi viser her at Survivin overveiende undertrykker anoikis, en form for programmert celledød indusert ved tap av cellulær adhesjon til ekstracellulær matriks. Interessant, celler ectopically overekspresjon EGFP-Survivin viste etter tap av celle-matrix-interaksjon en redusert uttrykk av IkB-α. Etterfølgende subcellulære protein fraksjonering og immunoutfellingsstudier eksperimenter viste at XIAP samhandler med vaskemiddel-oppløselige Survivin som er kjent for å samarbeide aktivere NF-kB signalering. Undersøkelse av uttrykket nivåer av vaskemiddel løselig Survivin i kolorektal kreft cellelinjer og i kolorektal kreft vev avdekket at vaskemiddel løselig cytoplasmatiske Survivin nivåer korrelerte inverst med anoikis mottakelighet tykktarmskreft. Derfor kan det hende at vaskemiddel løselig cytoplasmatiske Survivin være en lovende prediktiv biomarkør for lymfeknute og fjernmetastaser av tykk- og endetarmskreft. Vi konkluderer med at en anti-apoptotisk funksjon av vaskemiddel-løselig Survivin i interfase celler opplever anoikis formidles minst via XIAP /IkB-α /NF-kB signale
Citation. Hori M, Miki T, Okamoto M , Yazama F, Konishi H, H Kaneko et al. (2013) Den vaskemiddel-Løselig Cytoplasmatiske Pool of Survivin undertrykker Anoikis og dens uttrykk er assosiert med metastatisk sykdom of Human tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (2): e55710. doi: 10,1371 /journal.pone.0055710
Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, India
mottatt: 20 juli 2012; Godkjent: 29 desember 2012; Publisert: 06.02.2013
Copyright: © 2013 Hori et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Japan Society for Promotion of Science (KAKENHI nr 21591730 for Masaaki Tatsuka) og Prefectural University of Hiroshima (Viktig Research Project, GAKUNAI KYODO KENKYU H-24 for Masaaki Tatsuka, Hiroaki Konishi, og Fumio Shimamoto), og Prefectural University of Hiroshima Graduate School of omfattende vitenskapelige til Mayumi Okamoto og Guangying Qi (Research Associate Grant H-24). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av kreftutvikling, metastatiske celler løsner fra nabokreftceller, erverve cellemotilitet, invadere og skriv lymfesystemet eller blodsirkulasjon, overleve og danne metastatiske lesjoner. Disse trinnene involvere mange gener og stier, og likevel disse biologiske prosessene er dårlig forstått til tross for mange vitenskapelige tilnærminger [1]. Identifiseringen av metastatisk tumor målretting molekyler for diagnostiske og terapeutiske prosedyrer er fortsatt nødvendig.
Survivin er medlem av kromosom passasjer protein kompleks (CPC), som er en viktig regulator av mitose. Survivin og andre CPC komponenter, Aurora-B, indre cent protein (INCENP), og Borealin (Dasra B) er avgjørende for CPC-funksjoner, inkludert kinetochore festefeilrettinger og gjennomføring av cytokinese [2]. Survivin bidrar til den mitotiske lokalisering av CPC og har blitt beskrevet for å forbedre Aurora-B-kinase-aktivitet som vist i
Xenopus laevis
og
S. pombe product: [3], [4]. Tidlig i mitose, fosforylering av Histone H3 på treonin 3 formidlet av Haspin og påfølgende binding av Survivin til dette området er viktig for montering CPC på kinetochores [5], [6], [7].
Survivin er periodisk uttrykt i cellesyklusen hevings i mitose [8]. Previou studier har vist at Survivin ekspresjon er svekket av p53, og tap av p53-funksjon, som ofte er observert i kreftceller, øker dens transkripsjon [9], [10]. Faktisk de fleste kreftceller analysert så langt opp-regulerer Survivin [11], [12] sammenlignet med normale celler eller tilstøtende vev. I tillegg, i mange humane krefttilfeller, Survivin er blitt påvist selv under mellomfase [13], [14]. Overekspresjon av Survivin er ofte funnet i tykk- og endetarmskreft [15], [16], [17]. Her økte nivåer av Survivin har blitt beskrevet å korrelere med en dårlig prognose [18], [19], men motstridende data har blitt publisert om dette [20]. Foruten sin CPC funksjoner Survivin er tenkt å ha flere roller i apoptotiske regulering [21], [22], [23]. Imidlertid, i den N-terminale ende av Survivin, er det bare én baculoviral inhibitor av apoptose gjenta (BIR) domene. Også Survivin inneholder ingen C-terminal RING finger domene som er vanlig for medlemmer av IAP familie [11], [24]. Selv om Survivin ble opprinnelig klassifisert som hemmer av apoptose (BIR) er det nå anerkjent at hoved molekylære funksjonene er koblet til spindelenheten sjekkpunktet og cytokinese. I dag er den anti-apoptotiske funksjoner av Survivin utspurt siden de fleste eksperimenter som blokkerte Survivin funksjon førte til utviklingen av mitotiske defekter som kan forstyrre en nøyaktig analyse av IAP funksjon [25], [26], [27], [28 ]. I en tidligere studie ablasjon av Survivin i kylling B-lymfocytt DT40 var dødelig på grunn av mangel på både CPC funksjoner og flere andre celle proliferative egenskaper [29]. Men disse cellene viste normal følsomhet for etoposid-indusert apoptose sammenlignet med kontrollceller.
I vår studie viser vi for første gang at vaskemiddel-oppløselige Survivin undertrykker anoikis i forankringsavhengige celler, en form for programmert celledød indusert ved tap av vedheft fra det omgivende ekstracellulære matriks. Subcellulære fraksjone eksperimenter gitt bevis for at vaskemiddel løselig Survivin av cytosol var ansvarlig for å undertrykke anoikis. Mekanismen for anoikis undertrykkelse innebærer aktivering av XIAP /IkB-α /NF-kB signalering og inaktivering av c-juni En annen viktig funn i denne studien er at vaskemiddel løselig Survivin er korrelert til invasiv fenotype av kolorektal kreft celler. Derfor kan vaskemiddel-løselig Survivin være av klinisk verdi siden det sannsynlig spår lymfeknute og fjernmetastaser i pasienter med kolorektal kreft.
Resultater
Overuttrykte Survivin beskytter celler fra anoikis
i innledende studier søkte vi å analysere effekten av survivin overekspresjon i p53-mangelfull kinesisk hamster embryonale diploide fibroblaster (CHE celler) og isogene CHE celler som villtype p53. For å overvåke transfeksjon vi brukte en forbedret grønn fluorescens protein-merket Survivin (EGFP-Survivin). Likevel, ektopisk overekspresjon av EGFP-Survivin hadde noen virkning på apoptose i CHE-p53 + /+ celler behandlet med DNA-ødeleggende ioniserende stråling (IR) og UV-C i forhold til CHE-p53 + /+ – EGFP-celler (figur 1A) som målt ved hjelp av annexin V-farging og terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) -mediert dUTP Nick ende merking (TUNEL) assay. Da vi snudde oppmerksomheten mot CHE celler med defekt p53 status (CHE-p53 – /- celler). Påfallende, CHE-p53 – /- celler med ektopisk overekspresjon av EGFP-Survivin produsert metastatisk lungesvulster når injisert subkutant i immuno-mangelfull mus mens det ikke lungemetastaser ble observert etter xenografting CHE-p53 – /- celler som uttrykker EGFP (tabell S1). Testing av apoptose-induksjon etter IR- eller UV-C avslørte at CHE-p53 – /- celler som har hatt betydelig større fraksjon av apoptose-positive celler når sammenlignet med CHE-celler med villtype p53 [30], [31], [32] (figur 1A ). Denne observasjonen er i tråd med rapporter ved hjelp av gnagere embryoniske fibroblaster som viser en mindre følsomhet overfor IR- og UV-C enn de celler som mangler funksjonell p53, cellesyklus kontrollpunkt kontroll. Interessant, vi også ikke finne en beskyttende effekt av overexpressed Survivin i CHE-p53 – /- celler sammenlignet med CHE celler med ektopisk uttrykk for EGFP (figur 1A)
A.. Frekvens av apoptose i CHE celler (med p53 + /+ og p53 – /-) transfektert med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin etter behandling med X-bestråling (10 Gy) og UV-C (10 J /m
2) . De transfekterte celler ble utsatt for IR- eller UV-C ved 24 timer etter transfeksjon. Transfeksjon frekvenser var 80-90%, og EGFP-positive celler ble telt for Annexin V-positive eller -negative celler (
øvre panel
) og tunel analyse-positive eller -negative celler (
nedre panel
). X-bestrålte CHE-p53 – /- celler som har hatt betydelig større fraksjon av apoptose-positive celler når sammenlignet med X-bestrålte CHE-p53 + /+ celler (
P
0,03 for Annexin V-farging og
P
0,08 for TUNEL assay), og UV-C bestrålte CHE-p53 – /- celler som har hatt betydelig større fraksjon av apoptose-positive celler i forhold til UV-C bestrålt CHE-p53 + /+ celler (
P
0,001 for Annexin V farging og
P
0,02 for TUNEL analyse). Apoptose-positive celler ble ikke signifikant redusert i pEGFP-Survivin-transfekterte celler sammenlignet med pEGFP-transfekterte celler i hvert enkelt tilfelle (
P
0,4 for Annexin V farging og
P
0.4 for TUNEL analyse). Verdier indikerer middelverdi ± standardavvik (N = 3). B. Økning av oppbevaring i lungene etter intravenøs injeksjon av EGFP- eller EGFP-Survivin-uttrykke celler. Antallet overlevende CHE-p53 – /- celler i lungen ble signifikant øket når sammenlignet med antallet overlevende kontrollceller som uttrykker EGFP. Verdier indikerer middelverdi ± standardavvik av seks mus. * Signifikant forskjell (
P
0,005). C. Caspase-3-aktivering i CHE-p53 – /- celler transfektert med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin etter anoikis induksjon. De transfekterte celler ble løsnet fra ekstracellulære matriks og samtidig serum-sultet for å indusere anoikis ved 24 timer etter transfeksjon. Cellene ble suspendert i serumfritt medium i 6-36 timer, høstet, og lysert i Laemmli SDS-prøvebuffer for immunoblotanalyse med anti-aktivert kaspase-3 antistoff. Transfeksjon frekvenser ble sjekket ved hjelp av fluorescens mikroskopi og bekreftet å være 80-90%. D. Caspase-3-aktivering i CHE-p53 – /- celler transfektert med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin etter behandling med UV-C (10 J /m
2). De transfekterte celler ble eksponert for UV-C ved 24 timer etter transfeksjon. Celler ble dyrket i 24 timer, høstet, og lysert i Laemmli SDS-prøvebuffer for immunoblotanalyse med anti-aktivert kaspase-3 antistoff. Transfeksjon frekvenser ble sjekket ved hjelp av fluorescens mikroskopi og bekreftet å være 80-90%.
Så langt transfeksjon av pEGFP-Survivin hemmer ikke stråling-indusert apoptose i CHE-celler, uavhengig av p53 status og uttrykk nivåer av survivin men på den annen side bare CHE-p53 – /- celler som overuttrykker EGFP-survivin forårsaket metastatisk sykdom hos mus. Vi har derfor antatt at overekspresjon av Survivin kan øke overlevelsen av CHE-p53 – /- -EGFP-Survivin celler under stress forhold som sannsynligvis mer ligner på
in vivo
fysiologiske betingelser for å spre kreftceller som forankringsuavhengig situasjon og nærings sult
Faktisk, ved å anvende
iv
injeksjon av tumorceller i mus vi viste at antallet overlevende CHE-p53 -. /- celler i lungen ble signifikant øket når sammenlignet til antall overlevende kontrollceller uttrykker EGFP (figur 1B).
for ytterligere å utforske vår hypotese, testet vi om overekspresjon av EGFP-survivin konferert redusert anoikis-følsomhet, nemlig motstand mot serum starvation- og suspensjon kultur- indusert apoptose, i CHE celler. Som vist i figur 2A ble det klart at overekspresjon av EGFP-Survivin undertrykte betydelig anoikis sammenlignet med den CHE-p53 – /- kontrollceller, som målt med annexin V-farging og også ved TUNEL assay, i CHE-p53 – /- celler . Tilleggs immunoblot analyse for påvisning av prosessert byrder caspase-3 bekreftet at uttrykt EGFP-Survivin beskyttet mot anoikis (figur 1C) siden CHE-p53 – /- celler med ektopisk uttrykk for EGFP-Survivin viste en svakere gradvis økning av bearbeidet caspase-3 i løpet av den observerte tidsrom. På den annen side, har overekspresjon av EGFP-Survivin ikke undertrykke kaspase-3 aktivering i UV-C-indusert apoptose (figur 1D).
A. Frekvens av anoikis i CHE-p53 – /- celler transfektert med pEGFP-tom og pEGFP-Survivin. De transfekterte celler ble løsnet fra ekstracellulære matriks og samtidig serum-sultet for å indusere anoikis ved 24 timer etter transfeksjon. Transfeksjon frekvenser var 80-90%, og EGFP-positive celler ble regnet for anoikis-positive eller -negative celler. Overekspresjon av EGFP-Survivin undertrykte betydelig anoikis sammenlignet med den CHE-p53 – /- kontrollceller. Verdier indikerer middelverdi ± standardavvik (N = 3). * Signifikant forskjell (
P
0,08). ** Signifikant forskjell (
P
0,04). B. Caspase-3-aktivering i EGFP- og EGFP-Survivin-uttrykker celler etter serum sult henhold hengt eller frittliggende dyrkningsforhold. Den eksperimentelle protokollen ble illustrert i figur S1. Transfeksjon frekvenser ble sjekket ved hjelp av fluorescens mikroskopi og bekreftet å være 80-90%. Celler ble holdt i serumfritt medium i 24-72 timer, høstet, og lysert i Laemmli SDS-prøvebuffer for immunoblotanalyse med anti-GFP, anti-Survivin, anti-aktivert kaspase-3-antistoff, anti-LC3B, og anti -α-tubulin. C. Survivin-indusert apoptose undertrykkelse hastighet i forhold mellom EGFP-uttrykkende celler og EGFP-Survivin-uttrykkende celler. Nivåer av aktivert kaspase-3-protein ble estimert ved immunblotanalyse. Undertrykkelsen Hastighetene ble uttrykt i et forhold på aktivert kaspase-3 proteinnivå i EGFP-Survivin-uttrykkende celler til nivået i EGFP-uttrykkende celler. Verdier indikerer middelverdi ± standardavvik (N = 3). * Signifikant forskjell (
P
0,04). ** Signifikant forskjell (
P
0,02). *** Signifikant forskjell (
P
0,007). D. DNA fragmentering analyse i EGFP-uttrykkende celler og EGFP-Survivin-uttrykkende celler. De transfekterte celler ble løsnet fra ekstracellulære matriks og samtidig serum-sultet for å indusere anoikis ved 24 timer etter transfeksjon. Cellene ble suspendert i 24 timer og høstet. Genomisk DNA ble ekstrahert og underkastet elektroforese på agarosegeler. E. Representative bilder av EGFP-uttrykkende celler og EGFP-Survivin-uttrykkende celler, ved hjelp av laser konfokalmikroskopi. Transfekterte celler ble suspendert i serumfritt medium i 24, og avbildes ved Nomarski differensialinterferenskontrast (
lane DIC
), ved rodamin phalloidin farging (
lane F-aktin
), ved EGFP fluorescens (
kjørefelt EGFP
), og ved DAPI farging (
kjørefelt DAPI
). Rhodamine phalloidin farging og DAPI flekker vanligvis angitt som EGFP-uttrykkende celler gikk anoikis, men EGFP-Survivin-uttrykker cellene ikke. F. Bestemmelse av cellelevedyktigheten av WST-1-assay. Transfekterte celler ble suspendert i serumfritt medium i 24 timer, og deretter cellelevedyktigheten av EGFP-uttrykkende celler og EGFP-Survivin-uttrykkende celler ble vurdert. Verdier indikerer middelverdi ± standardavvik (N = 3). * Signifikant forskjell (
P
0,04).
Neste, vi avgjort om den beskyttende effekten av overuttrykt EGFP-Survivin på caspase-3-aktivering var anoikis spesifikke, ved hjelp en anoikis analyseprotokollen (skjematisk illustrert på figur S1). Immunoblotanalyse analyser viste at den undertrykkende effekten var mer potente i frittliggende kultur tilstand enn i vedlagte kultur tilstand (figur 2B). Verdt å merke seg, autofagi, en annen type celledød forårsaket av en katabolsk prosess for nedbrytning av cellulære komponenter av lysosome, var ikke involvert i effekt (figur 2B,
IB: anti-LC3B
). De kvantitative data demonstrerte effektiv undertrykkelse av henge kultur-indusert anoikis i EGFP-Survivin-uttrykkende celler i forhold til å kontrollere celler som uttrykker EGFP (figur 2C). I tråd med denne observasjonen, overekspresjon av EGFP-Survivin undertrykte DNA-fragmentering (figur 2D og E) og bevart celle levedyktighet (figur 2F) i frittliggende kultur tilstand.
Overuttrykte Survivin regulerer apoptose-relatert transkripsjonsfaktorer
Vi neste spurt om hvilke signalveier kan være involvert i anoikis-undertrykkelse i EGFP-survivin-uttrykke CHE-p53 – /- celler. Survivin har blitt beskrevet å inhibere pro-apoptotiske Bcl-2-assosiert protein X (BAX) indusert apoptose [33]. Ennå ekspresjonsnivåene av BAX ikke ble forandret etter induksjon av anoikis i EGFP-Survivin- samt EGFP-uttrykk CHE-p53 – /- celler (figur 3,
Bax
). Vi så fokusert på den andre mitokondriene-avledet aktivator av caspase /direkte hemmer av apoptose-bindende protein med lavt pI (Smac /DIABLO) som har blitt vist å binde til Survivin [34], [35]. Men Smac /DIABLO var umulig å oppdage i frittliggende kultur tilstand (figur 3,
Smac /DIABLO
). Et annet IAP familiemedlem, en X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) har blitt rapportert til å danne heterodimerer med Survivin [36]. Enkelte linjer av bevis tyder på at denne heterodimer er i stand til å aktivere en anti-apoptotiske NF-kB signalisering, via fosforylering og etterfølgende nedbrytning av molekyl inhibitor av kappa B-α (IkB-α) [37]. Interessant, ble det registrert en oppregulering av IkB-a-proteinnivåer i frittliggende kultur tilstand av kontroll CHE-p53 – /- celler, mens IkB-a ekspresjonsnivåer holdt seg svært lav i EGFP-Survivin-uttrykkende celler (figur 3,
XIAP, IkB-α, og NF-kB
). Samtidig, styrking av fosforylering av pro-apoptotisk transkripsjonsfaktor, c-Jun, ble undertrykt av overekspresjon av EGFP-Survivin i frittliggende kultur tilstand (figur 3,
JNK, c-Jun-P (S73), og c-Jun
). Disse data antyder at overekspresjon av EGFP-Survivin reduserer IkB-α nivået i frittliggende celler og senere føre til aktivering NF-kB og på samme tid til en undertrykkelse av c-Jun-mediert transkripsjon. Men vi kunne ikke funnet et bidrag av fokal vedheft kinase (FAK) til anoikis undertrykkelse i denne cellen systemet selv om FAK auto-fosforylering nettsted på Y397 har blitt rapportert å være viktig for anti-apoptotiske aktivitet av FAK [38], [39] .
Den eksperimentelle protokollen ble illustrert i figur S1. Transfeksjon frekvenser ble sjekket ved hjelp av fluorescens mikroskopi og bekreftet å være 80-90%. Celler ble holdt i serumfritt medium i 24-72 timer, høstet, og lysert i Laemmli SDS-prøvebuffer for immunoblotanalyse med anti-β-aktin, anti-Bax, anti-Smac /DIABLO, anti-XIAP, anti- IkB-α, anti-NF-kB, anti-JNK, anti-c-Jun-P (S73), anti-c-Jun, anti-FAK-P (Y397), og anti-FAK.
CPC komponenter, inkludert survivin har en tendens til å assosiere med kromatin og derfor er ofte funnet i kjernen og er for det meste vaskemiddel-uløselig. Likevel har andre intracellulære lageret av Survivin blitt beskrevet i cytosol eller assosiert med mitokondrier [40], [41]. Det var spesielt interessant hvordan Survivin forbinder med XIAP i en celle. Fra tid-retters eksperimenter, ble caspase-3-aktivering funnet 6 timer etter anoikis induksjon (figur 1C). Følgelig ble cellene ved tid 0, 3 og 6 timer etter induksjon anoikis anvendt for subcellulære fraksjoneringseksperimenter for å unngå feiltolkninger som kan oppstå fra ved hjelp av døde celler indusert av anoikis. Immunoblot analyser følgende subcellulære fraksjonering viste at XIAP ble stort sett funnet i vaskemiddel-løselige fraksjon av cytosol (figur 4A,
IB: anti-XIAP
). Men de fleste av EGFP-Survivin ble funnet i vaskemiddel-uoppløselige pellet fraksjonen inneholdende kromatin, men ble også funnet i mindre strekker seg i detergentløselige nukleære og cytosoliske fraksjoner (figur 4A,
IB: anti-Survivin og IB : anti-EGFP
). Det er således et samspill av XIAP og Survivin tydeligvis var begrenset til vaskemiddeloppløselige fraksjonen av cytosol. Faktisk har vi funnet en stabil protein-protein interaksjon mellom XIAP og Survivin ved å bruke immunoutfellingsstudier eksperimenter med vaskemiddel løselige cytoplasmafraksjonen av CHE-p53 – /- celler med ektopisk uttrykk for EGFP-Survivin (figur 4B). I tillegg ble ikke-merket Survivin mindre effektivt fraksjonert i vaskemiddelløselige cytoplasmiske fraksjonen og anoikis og kaspase-3 aktivering ble også mindre effektivt undertrykket i ikke-taggede Survivin-overexpressed CHE-p53 – /- celler. På den annen side, en Discosoma rød fluorescerende protein-merket Survivin (Survivin-DsRed) ble mer effektivt fraksjonert i vaskemiddelløselige cytoplasmiske fraksjonen og anoikis og caspase-3, ble også mer effektivt undertrykkes i Survivin-DsRed-overexpressed CHE-p53- /- celler (våre upubliserte data)
a.. Subcellulære fraksjonering og immunoblotanalyse av aktivert kaspase-3, Survivin, og XIAP. Transfeksjon frekvenser ble sjekket ved hjelp av fluorescens mikroskopi og bekreftet å være 80-90%. Celler ble holdt i serumfritt medium i 3-6 timer, høstet, og lysert. Cellelysatet ble fraksjonert i vaskemiddelløselige cytoplasma (
C
), og kjernekraft (
N
) fraksjoner og vaskemiddel-uløselig pellet (
P
) fraksjon for immunoblot-analyse med anti-aktivert kaspase-3, anti-survivin, anti-GFP, anti-XIAP, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-aktin. B. Protein-protein interaksjoner mellom EGFP-Survivn og XIAP. Cellelysat fra vaskemiddel-løselige cytoplasmiske fraksjonen ble immunopresipitert med anti-XIAP-antistoff og anti-GFP-antistoff og deretter immunoblottet med anti-GFP-antistoff (
nedre panel
) og anti-XIAP antistoff (
øvre panel
), henholdsvis. EGFP-Survivin og XIAP var co-imunoprecipitated bare i celle lysat skjema EGFP-Survivin-uttrykkende celler (
kjørefelt 2
).
Den vaskemiddel løselige Cytoplasmatiske Survivin er involvert i metastatisk progresjon av menneskelig tykktarmskreft
Vi endelig tok opp spørsmålet om vaskemiddel løselige cytoplasma survivin, er funnet i human kreft og er en eller annen måte knyttet til utviklingen av metastatisk sykdom. Vi analyserte åtte kolorektal kreft-cellelinjer, HeLa cervix carcinoma-cellelinjen, og 8505C throid carcinoma cellelinje ved cellulær fraksjonering og immunblotting. Som kontroll vi inkludert normal embryo diploid fibroblast (NHDF). Blant de kolorektal kreft cellelinjer, ble Survivin funnet i vaskemiddelløselige fraksjoner selv om uttrykket nivåer variert betydelig (figur 5A). Deretter ble anoikis-følsomhet undersøkt i alle kreftcellelinjer (figur 5B). Selv om størrelsen av bidraget fra Survivin til anoikis resistent fenotype i kolorektal kreftceller er udefinert, er det en direkte sammenheng mellom høyere ekspresjonsnivåer av det vaskemiddel oppløselige cytoplasmiske Survivin og anoikis motstand særlig for HCT116 og HT29-celler med høy ekspresjon av vaskemiddel løselige fraksjon av cytoplasmaet. Bemerkelsesverdig, NHDF, LoVo og SW480 celler, der vaskemiddel løselige Survivin var ikke oppdages, viste massiv celledød etter induksjon av anoikis.
A. Subcellulære fraksjonering og immunoblotanalyse av Survivin. Cellelysatet fra eksponentielt voksende celler ble fraksjonert i vaskemiddelløselige cytoplasma (
C
), og kjernekraft (
N
) fraksjoner og vaskemiddel-uløselig pellet (
P
) fraksjon for immunoblot analyse med anti-survivin, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-aktin. Vaskemiddelet oppløselige cytoplasmiske Survivin nivået ble beregnet ved immunoblotanalyse, og uttrykt som en prosentdel av nivået av 8505C, som er udifferensiert thyroideakarsinom viser anoikis motstand (+++, 80%, ++, 40-80%; +, 10-40%, -, 10%). B. Anoikis mottakelighet i kolorektal kreftceller. Cellene ble suspendert i serumfritt medium i 72 timer. Celleviabilitet ble bestemt av WST-1-analysen.
Hvilke biologiske atferd i kolorektal kreft er knyttet til vaskemiddel løselige cytoplasma Survivin er viktig for sine diagnostiske eller terapeutiske ledige plasser. I våre tidligere immunhistokjemiske analyser av kolorektal kreft vev, har fraværet av atom Survivin og eksistensen av cytoplasmatiske Survivin funnet å være signifikant prediktor for dødelighet i pasienter med kolorektal kreft [42]. Likevel, analysen av immunhistokjemisk lokalisering og subcellulære fraksjonedeteksjons er ikke det samme. Fem prøver av normal og tilsvarende primære cancervev fra de samme pasienter ble undersøkt ved hjelp av subcellulære fraksjoneringseksperimenter, men uavhengig av innholdet av Survivin overekspresjon, tilfeller positive for påvisning av vaskemiddel-oppløselige cytoplasmiske Survivin var pasienter med lymfeknute og andre fjernt metastaser. Her ble andre førti tilfeller undersøkt. Omrisset av deteksjonsfremgangsmåten ble illustrert i figur S2. Figur 6 viser et typisk resultat fra to pasienter med eller uten vaskemiddel oppløselige cytoplasmisk Survivin i primær cancervev (tilfelle A er en pasient uten metastase og tilfelle B er en pasient med metastase). Clinicopathological betydning av vaskemiddeloppløselige cytoplasmisk Survivin ekspresjon ble bestemt for de førti tilfeller. De positive saker ble betydelig økt i tumorstørrelse ( 0,005), primær kolorektal kreft med lymfeknutemetastase ( 0,001), og primær tykktarmskreft med fjernmetastaser ( 0,01), sammenlignet med de negative tilfellene (tabell 1) .
oultline av metoden ble illustrert i figur S6. Normal og Kreft vev fra menneskelige pasienter med kolorektal kreft uten metastaser (
Case A
) eller med metastaser (
Case B
) ble lysert. Cellelysatet ble fraksjonert i vaskemiddelløselige cytoplasma (
C
), og kjernekraft (
N
) fraksjoner og vaskemiddel-uløselig pellet (
P
) fraksjon for immunoblot analyse med anti-survivin, anti-α-tubulin, anti-H3-histon, og anti-β-aktin.
Diskusjoner
I dag er det enstemmig akseptert at survivin er en viktig del av CPC regulere chromomal segregering og cytokinese [2] selv om de nøyaktige rollene survivin i mitose er fortsatt ikke fullt ut forstått. Celler med svekket funksjon av Survivin eller av en av partnerne på grunn av RNAi-mediert inhibering eller ekspresjon av dominant-negative mutanter viste sammenlign fenotyper (dvs. forstyrret segregasjon av kromosomer og defekte cytokinese) [25], [26], [28] , [43], [44], [45]. Videre fenotyper av Survivin knock-out mutanter i gjær [46], [47] og
C. elegans product: [48], [49] bekreftet rolle Survivin som CPP. I virveldyr, har den avgjørende rollen Survivin under mitose blitt vist i
Xenopus laevis product: [3] og mus [50]. På den annen side er forskjellige studier viste en anti-apoptotiske funksjon av Survivin i forskjellige arter og cellelinjer. Anti-apoptotiske virkninger av Survivin og av Survivin-lignende protein Deterin ble rapportert i gjær [51] og
D. melanogaster product: [52], henholdsvis. Likevel, kanskje overekspresjon av survivin fungere som en anti-apoptotiske faktor selv i ikke-virveldyr under visse forhold, men det ser ut til å tenke seg at de Survivin-knockout fenotyper som ble tolket som tap av anti-apoptotisk funksjon kan være primært knyttet til deregulerte mitotiske prosesser .
i dyrkede cellesystemer, økt apoptotisk mottakelighet, som dukket opp spontant eller ved apoptotiske midler, er gitt av tap-av-funksjon eller knock-down av survivin. Survivin knock-out i en T-celle avstamning indusert p53-avhengig fenotyper, som resulterer i thymocytt utviklingsdefekt [53]. Denne fenotype kan ikke bli reddet ved inaktivering av p53, noe som tyder på at Survivin er sannsynlig å være en anti-apoptotiske faktor, uavhengig av p53 status. I normale humane fibroblaster, Survivin knock-down også indusert p53 induksjon, noe som utløste cellesyklus arrest uten umiddelbar apoptose [54]. Denne fenotype ble reddet ved inaktivering av p53, noe som tyder på at Survivin er egnet til å fungere via p53 henhold heftende dyrkingsbetingelser. Disse forskjellige resultater er å skjule informasjon for å forstå Survivin-indusert beskyttelse mot apoptose. De forskjellige celletyper, adherente celler og ikke-adherente celler, er forskjellige i p53-induserte fenotyper. Ikke-adherente celler med normal p53 disponere til cellulært stress-indusert apoptose umiddelbar [55], såkalt inter celledød, sammenlignet med adherente celler, mens adherente celler med p53 primært stanse cellesyklus [56], [57]. Survivin knock-out induserer p53 i både adherente og ikke-adherente celler, som uttrykker følgelig fenotypene for hver type av cellene. I vår hypotese som er støttet av vår studie, er Survivin fortrinnsvis hemme anoikis i celler som utsettes for forankringsavhengig overlevelse og vekst uavhengig av p53 status.
Når utsatt for DNA-ødeleggende middel etoposid, Survivin banket ut DT40 celler viste normal følsomhet for denne agenten [29]. Dataene antydet at Survivin er ikke en universell inhibitor for DNA-ødeleggende middel-fremkalt apoptose. Her observerte vi normale følelser for IR og UV-C i Survivin-overekspresjon CHE-p53 – /- celler. Etter vårt syn vil Survivin ha viktige roller i anoikis undertrykkelse for kreftutvikling (se nedenfor).
I tråd med tidligere rapporter, vi viser her at Survivin regulerer caspase-3-aktivitet. Det har blitt rapportert at Survivin hemmer kaspase-3 aktivering i fysiologiske situasjoner i løpet av apoptose, men denne effekten er sannsynligvis ikke på grunn av direkte hemming av caspase-3 [58], [59], [60]. Derav nøyaktig anti-apoptotisk mekanisme av Survivin forblir fortsatt en utfordring. To mekanismer har blitt foreslått for å ta hensyn til inhibering av mitokondriene regulert apoptose som resulterer i kaspase-3 aktivering. Den mest studerte molekylet for dette er en pro-apoptotisk protein Smac /DIABLO, hvortil Survivin binder direkte [34]. En Smac /DIABLO-mediert interaksjon med survivin å undertrykke anoikis synes usannsynlig siden i vår eksperimentelle innstillingen eneste liten eller ingen uttrykk for Smac /DIABLO under anoikis av CHE-celler ble påvist (figur 3). Den andre mekanismen hvordan Survivin oppfyller sin IAP funksjon er en direkte binding til XIAP [36].
