Abstract
En rekke kreftformer viser økt uttrykk av nikotinamid fosforibosyl transferase (Nampt). Imidlertid er mekanismen ved hvilken Nampt oppreguleres uklart. I vår studie fant vi at Nampt-spesifikke kjemiske hemmer FK866 betydelig hemmet celle overlevelse og redusert nikotinamidadenindinukleotid (NAD) nivåer i LoVo og SW480 cellelinjer. Bioinformatikk analyser antydet at Mir-26b rettet Nampt mRNA. Vi identifiserte Nampt som et nytt mål på MIR-26b og viste at MIR-26b inhiberer Nampt ekspresjon på protein og mRNA-nivåer ved å binde til den Nampt 3′-UTR. Videre fant vi at Mir-26b ble nedregulert i kreftvev i forhold til at det i tilstøtende normalt vev i 18 pasienter med kolorektal kreft. En statistisk signifikant invers korrelasjon mellom Mir-26b og Nampt uttrykk ble observert i prøver fra pasienter med kolorektal kreft og i 5 kolorektal cellelinjer (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, og HCT116). I tillegg, i løpet av ekspresjon av MIR-26b sterkt inhibert LoVo celleoverlevelse og invasjon, en effekt som delvis opphevet ved tilsetning av NAD. Som konklusjon, denne studien viste at NAD-hevingen biosyntesebanen involverer Nampt kan spille en rolle i kolorektal kreft celle overlevelse. MiR-26b kan tjene som en tumor suppressor ved å målrette Nampt
Citation. Zhang C, Tong J, Huang G (2013) nikotinamid fosforibosyltransferase (Nampt) er et mål på mikroRNA-26b i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10,1371 /journal.pone.0069963
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 27 februar 2013; Akseptert: 13. juni 2013, Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av forskningsmidler fra National Natural Science Foundation of China (tall 30830038, 30970842, 81071180, 81000929); «973» Project (2012CB932604); New Drug Discovery Project (2012ZX09506-001-005); Key Prosjekt of Science and Technology Commission av Shanghai kommune (antall 10JC1410000); og Shanghai Leading akademisk disiplin Project (antall S30203). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
protein~~POS=TRUNC nikotinamid fosforibosyl transferase (Nampt) har flere funksjoner. Det eksisterer i inter (iNAMPT) og ekstracellulære (eNAMPT) former [1]. I celler, fungerer den som et hastighetsbegrensende enzym i bergingsveien for syntese av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD), som er involvert i celle metabolisme og proliferasjon [2]. Ekstracellulær Nampt ble først identifisert som pre-B-cellekolonifremmende faktor (PBEF), et cytokin-lignende protein som stimulerte tidlig B-celledannelse [3]. Det ble omdøpt nylig som visfatin av Fukuhara et al., Som identifiserte det som en visceralt fett-avledet adipokin som antas å etterligne insulin funksjon [4]. Nampt har trukket betydelig interesse, ikke bare på områdene metabolisme og immunrespons, men også innen kreft. En rekke kreftformer viser økt ekspresjon av Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], og inhibitorer av Nampt gi lovende terapeutisk anvendelse i kreft [12] , [13], [14], [15]. Men den mekanisme som Nampt blir oppregulert uklart.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA. Identifisert som en ny klasse av genekspresjon regulatorer, målrette de mRNA for translasjonell undertrykkelse eller degradering [16]. En rekke studier har vist at mirnas kan regulere ekspresjonen av en rekke gener, inkludert de som er viktig for tumor proliferasjon, invasjon eller metastase [17], [18], [19]. Nytten av mirnas ved behandling av cancer er blitt demonstrert [20], [21], [22].
I denne studien demonstrerte vi at NAD-innsamling biosyntesebanen involverer Nampt spiller en rolle i kolorektal kreft celle overlevelse. Vi viste for første gang at Nampt er et mål på MIR-26b. Dessuten ble uttrykket av MIR-26b og Nampt analysert i humane prøver av pasienter med kolorektal kreft og 5 kolorektal kreft celler. Rollene som Mir-26b og Nampt i menneskelig utvikling kreft blir diskutert.
Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien er godkjent av etikkomiteen av Ren Ji Hospital, Skole medisin, Shanghai Jiao Tong University. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av humane prøver fra Ren Ji Hospital.
Cellelinjer og vevsprøver
tykktarmskreft cellelinjer SW480, SW1116 HT-29, ble LoVo, og HCT116 brukt i denne studien (hentet fra Shanghai Institute of gastrointestinale sykdommer, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C.
Vevsprøver fra human tykk- og tilstøtende normal kolorektal vev ble oppnådd fra 18 pasienter som gjennomgikk kirurgi i Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller radioterapi før kirurgi. Prøver ble samlet og lagret ved -80 ° C. De histopatologiske diagnoser ble evaluert av sykehusets patolog ved hjelp av både morfologiske kriterier og immunocytochemistry. Alle pasientene har gitt sitt skriftlige samtykke (som beskrevet i PLoS samtykkeskjema) før vev samling, og studien ble godkjent av etikkomiteer i Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.
CCK-8 analysen
celle~~POS=TRUNC overlevelse ble undersøkt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5000 celler /brønn i komplett medium og dyrket i 24 timer. Mediet ble deretter erstattet med RPMI-1640 inneholdende 10% FBS, med eller uten behandling. Etter inkubering ble 10 ul av CCK-8 tilsatt til hver brønn, og platene ble ytterligere inkubert i 4 timer i en inkubator. Absorbansen ved 490 nm ble avlest spektrofotometrisk ved anvendelse av en mikroplateleser.
Apoptose-analysen
celle apoptose ble bestemt ved Vybrant apoptose analysesett # 2 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Hver prøve ble evaluert ved flow cytometri med et Coulter Epics XL strømningscytometer (Beckman-Coulter). Data ble behandlet med Expo 32 cytometer programvare (Beckman-Coulter). Forsøkene ble gjort tre ganger i duplikat.
NAD + og NADH Kvantifisering
Konsentrasjonene av NAD
+ og NADH i celler ble oppdaget ved hjelp av en NAD
+ /NADH Kvantifisering Kit ( Bio Vision) i henhold til bruksanvisningen. Mengden av NAD
+ i hver prøve ble normalisert til proteininnholdet for hver testprøve
Prediksjon av miRNA Targets
Databasert TargetScan (http:. //www.targetscan .org /) ble brukt til å forutsi mirnas som er rettet mot Nampt mRNA.
knockdown eller Overuttrykte Mir-26b
Expression of Mir-26b i celler ble slått ned av transfeksjon med Mir-26b inhibitor (GenePharma) eller økt med transfeksjon med Mir-26b ligner (GenePharma). Cellene ble platet ut på kulturskåler eller 24-brønners plater i 24 timer og deretter transfektert med inhibitor eller imiterer ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i 24 timer. Etter transfeksjon ble cellene utsatt for ytterligere analyser eller RNA /protein utvinning.
RNA Utvinning og Real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og kolorektal kreft prøvene bruker TRIzol (Invitrogen). Nivåene av Nampt mRNA og Mir-26b ble målt ved real-time RT-PCR. For påvisning av Nampt mRNA, revers transkripsjon ble utført ved hjelp av M-MuLV revers transkriptase System, og real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn (Takara) med ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt for normalisering. For å måle Mir-26b nivåer, ble kvantitativ real-time RT-PCR-analyse utført ved hjelp av TaqMan Reverse Transcription Kit og TAQMAN mikroRNA Analyser Kit (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Et menneske U6 liten kjerne RNA TaqMan®-probe ble anvendt for normalisering. Primer sekvenser (forover og bakover) er oppført i tabell 1.
Western blotting
Et likt antall pelleterte celler ble vasket med iskald fosfat-bufret saltvann (PBS), igjen pelletert og resuspendert i RIPA-buffer. Deretter ble cellene inkubert ved 95 ° C i 5 minutter og sentrifugert i en mikrosentrifuge i 5 min. Like mengder av totalt protein ble lastet for elektroforese i natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% TBS-T i 1 time ved romtemperatur og inkubert med primært antistoff i TBS-T i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Etter vasking 4 ganger i 5 minutter hver i TBS-T, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Kangchen Technology) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking 4 ganger i 5 min, ble proteinbåndene visualisert ved kjemiluminescens reaksjon og eksponert for røntgenfilm. Det primære antistoff, anti-Nampt antistoff (katalog nummer AP9010c), var fra Abgent. Data ble behandlet ved hjelp av to-ΔΔCT metoden.
Reporter Konstruerer
De antatte miRNA26b-anerkjennelse elementer fra Nampt genet og tilsvarende mutantene ble klonet inn i 3′-utranslaterte område (UTR) av luciferasegenet i pEZX-MT01 luciferase vektor (GeneCopoeia Inc.). Dette uttrykket klon inneholdt Nampt (Accession: NM_005746.2) 3′-UTR-sekvens settes inn i pEZX-MT01 vektor nedstrøms for en ildflue luciferase-gen under kontroll av en SV40 promotor. Den pEZX-MT01 vektor inneholdt også den Renilla luciferase-genet under kontroll av en CMV-promoter. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. De muterte kloner for Nampt ble konstruert. Frøet bindende region (5′-UACUUGAA-3 «) ble endret til 5′-UACUUACA-3» (2-bp erstatning). Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse.
Luciferase Assay Reporter
SW480 celler ble dyrket i 24-brønners plater og transfektert med negativ kontroll etterligner (NC) eller MIR-26b etterligner (30 nM eller 60 nM; GenePharma) bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter en andre transfeksjon med en MIR-26b reporter-konstruksjonen eller dets mutant (50 ng) ble SW480-celler inkubert i 24 timer. Luciferase analysene ble utført ved hjelp av Dual-Light Kombinert Reporter Gene analysesystem (Promega) og Promega Turner TD-20/20 luminometer.
Transwell analysen
Cell migrasjon ble utført av transwell assay (BD biovitenskap) i henhold til produsentens instruksjoner. Kontroll miRNA eller etterligner av Mir-26b transfekterte cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon. Da 3,0 x 10
5 transfekterte celler eller ubehandlede celler i serumfritt medium ble tilsatt til hver øvre innsatsforhåndsbelagt med Matrigel matrise. Til den samsvarende nedre kammer, ble 500 ul av 10% FBS medium tilsatt. Etter inkubasjon ble ikke-invasive celler fjernes fra den øvre overflaten av transwell membran med en bomullsdott, og de invaderende celler på den nedre membranoverflate ble fiksert i metanol, farget med 0,1% krystallfiolett, fotografert, og telles.
Statistical Analysis
forsøkene ble gjentatt 3 ganger. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. For sammenligning av 2 grupper, ble en to-halet, uparet t-test anvendt. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistiske tester ble utført ved hjelp av State Programvare 12,0 (Stata Corp).
Resultater
Nampt spesifikke Kjemisk Inhibitor FK866 hemmer NAD Syntese og Cell Survival
Økt Nampt uttrykk har blitt rapportert i primære kolorektal kreft [5], [6], [7]. FK866 er et Nampt-spesifikk kjemisk hemmer som hemmer NAD-hevingen biosyntesebanen ved å binde på nikotinamid-bindingssetet av Nampt, og dermed tappe celler av NAD [23], [24]. Angivelig, FK866 er godt tolerert, og det hemmer cellevekst i noen type svulster [13], [15] betraktelig. Imidlertid har effekten av FK866 i kolorektal cancer ikke blitt dokumentert.
Vi analyserte virkningen av FK866 på celleoverlevelsesgrad av human kolorektal kreft SW480 og LoVo-celler av CCK-8-analysen og flowcytometri. Resultatene viste at FK866 vesentlig fremmet apoptose av SW480 og LoVo-celler på en doseavhengig måte. IC
50 av FK866 ble 14,3 nM for SW480 celler og 32,7 nM for LoVo-celler, i henhold til CCK-8-analysen (figur 1A). Flowcytometri studier viste at å utsette SW480 og LoVo celler til forskjellig konsentrasjon av FK866 i 3 dager økte andelen av tidlig stadium apoptotiske celler fra 3,37 ± 0,83% til 27,27 ± 1,49% (SW480) og 3,00 ± 0,37% til 21,53 ± 1,76% (LoVo) (figur 1B).
A. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FK866 i 72 timer og deretter evalueres ved å benytte celletellingsleder-8. IC
50 verdiene ble beregnet. Hvert forsøk ble gjentatt minst 3 ganger. B. Kvantifiseringen av apoptotiske celler indusert av FK866 ble bekreftet ved strømningscytometri-analyse. De sub-G1 innholdet ble utpekt apoptotiske celler. *: Versus negativ kontrollgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgruppene. C. NAD nivåer i kolorektal kreft celler ble målt etter eksponering for FK866. Hver vertikale linjen representerer gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser. For sammenligning av 2 grupper, ble en to-tailed, uparet t-test benyttet.
Vi bestemmes ved effekten av FK866 på NAD biosyntesen i cellene ved hjelp av NAD
+ /NADH Kvantifisering Kit . FK866 eksponering i 3 dager reduserte nivået av NAD fra 5,33 ± 0,96 til 1,17 ± 0,31 nM /ug (SW480) og 6,63 ± 1,16 til 2,33 ± 0,85 nM /ug (LoVo) (figur 1C). Disse resultatene antydet at Nampt-mediert NAD-hevingen biosyntese spiller en avgjørende rolle i kolorektal kreft celle overlevelse og at FK866 har anti-kreftfremkallende egenskaper i kolorektal kreftceller.
MiR-26b Hemmer Expression of Nampt via binding til sin 3′-UTR
Ved databasert sekvensanalyse ved hjelp TargetScans deteksjon programvare (https://www.targetscan.org/), ble Nampt spådd å være et potensielt mål fra Mir-26b. Frøet sekvens av modent Mir-26b ble konservert blant menneske, sjimpanse, rhesus, og bush baby arter, blant andre. Derfor MIR-26b ble valgt for videre biologisk karakterisering.
Etter Mir-26b etterligner, overekspresjon av MIR-26b trykkes Nampt mRNA (Figur 2A venstre) og protein (figur 2B) nivåer i SW480 celler, som oppdaget med henholdsvis RT-PCR og western blot analyse. I mellomtiden, MIR-26b ligner også undertrykket ekspresjon nivået av NAD +, som ble målt ved hjelp av NAD
+ /NADH Quantification Kit (figur 2D venstre). På den annen side, transfeksjon med MIR-26b-inhibitor økes Nampt mRNA (figur 2A til høyre) og protein (figur 2C) nivåer, og MIR-26b-inhibitor også økt ekspresjon nivået av NAD + (figur 2D høyre).
A. Kvantitativ real-time PCR av Nampt i SW480 cellelinjer etter transfeksjon med ulike konsentrasjoner av Mir-26b etterligner eller hemmere. B og C. Western blotting av Nampt i SW480 cellelinjer etter transfeksjon med ulike konsentrasjoner av Mir-26b etterligner eller hemmere. D. De relative nivåene av NAD i SW480 cellelinjer etter transfeksjon med forskjellige konsentrasjoner av MIR-26b etterligner eller inhibitorer. E. luciferaserapportørplasmid analyser som validerer direkte interaksjon av MIR-26b med 3′-UTR av Nampt. Nampt-3′-UTR-pEZX (eller Nampt-3′-UTR-mut-pEZX) ble transfektert med Mir-26b etterligne eller negativ kontroll i SW480 celler. *: Versus negativ kontrollgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgruppene. Hver vertikale linjen representerer gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser. For sammenligning av 2 grupper, ble en to-tailed, uparet t-test benyttet.
For å bekrefte at Nampt er målet for MIR-26b, effekten av transfeksjon med Mir-26b ligner på reporter aktivitet av lang type og muterte pEZX-Nampt ble undersøkt. pEZX-Nampt er en dual-luciferase reporter konstruksjon inneholdende et bredt type eller mutert segment av Nampt 3′-UTR med MIR-26b gjenkjennelsessekvens umiddelbart nedstrøms for ildflue luciferase reporter (figur S1A). Et diagram av Nampt med villtype eller muterte sekvenser i potensialet MIR-26b bindingssete er vist i figur S1B. Sekvens kartene over villtype og muterte Nampt oppnådd ved sekvensering genet er vist i figur S1C. Som vist i figur 2E, transfeksjon med forskjellig konsentrasjon av MIR-26b ligner redusert ildflue luciferase reporter aktivitet av villtype-pEZX Nampt med ca. 51,7% ± 3,2% og 64,3% ± 4,0%, henholdsvis. Induksjon av rapportøraktivitet, ved overekspresjon av MIR-26b av MIR-26b ligner ble imidlertid ikke registrert da MIR-26b gjenkjenningssekvensen i det 3′-UTR av Nampt mRNA ble mutert (figur 2E). Derfor resultatene fra figurene 2 bekrefter at Nampt er et mål på MIR-26b.
uttrykket nivåer av Mir-26b og Nampt i tykktarmskreft vev og cellelinjer
De basale uttrykk nivåer av MIR-26b og Nampt mRNA ble målt ved QRT-PCR i kolorektale cancercellelinjer (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, og HCT116), og basal ekspresjonsnivåene av NAD + ble også målt ved hjelp av NAD
+ /NADH Kvantifisering Kit i cellelinjer. SW480 celler hadde lavest Nampt uttrykk og NAD + nivå, og det høyeste Mir-26b nivå, etterfulgt av HT-29, HCT116, LoVo og SW116 celler (figur 3A venstre). En signifikant invers korrelasjon mellom uttrykket av MIR-26b og Nampt mRNA ble observert, og en signifikant positiv korrelasjon mellom NAD + og Nampt mRNA ble også observert (figur 3A høyre).
A. MIR-26b, Nampt mRNA og NAD + nivåene ble analysert i kolorektal kreft cellelinjer. Uttrykket av MIR-26b ble omvendt korrelert med Nampt uttrykk i kolorektal kreft cellelinjer; uttrykket av NAD + var positivt korrelert med Nampt uttrykk i kolorektal kreft cellelinjer (A høyre). B. MIR-26b og Nampt mRNA nivåer ble analysert i 18 kirurgiske prøver av menneskelige kolorektal kreft vev og tilstøtende normale kolorektal vev. Betydelig oppregulert Nampt nivåer i kolorektal kreft vev er vist i forhold til Nampt nivåer i tilstøtende normale kolorektal vev (fold endringer 6); signifikant nedregulert MIR-26b nivåer i kolorektal kreft vev er vist i forhold til Mir-26b nivåer i tilstøtende normale kolorektal vev (fold endringer 2). C. Ekspresjon av MIR-26b er omvendt korrelert med Nampt ekspresjon i kolorektal kreft vev (C venstre), og tilstøtende normale vev kolorektal (C høyre). Nampt mRNA-nivåene ble analysert ved sanntids RT-PCR og normalisert til GAPDH. Mir-26b nivåer ble analysert ved real-time RT-PCR og normalisert til U6. Hver vertikale linjen representerer gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser. For sammenligning av 2 grupper, ble en to-tailed, uparet t-test benyttet.
I tillegg har vi utvidet vår undersøkelse for å prøver fra pasienter med kolorektal kreft. Våre resultater viste at Nampt ekspresjon ble betydelig økt i kreftvev (6,3-ganger) sammenlignet med den i de sammenkoblede tilstøtende normale vev i panelet av 18 pasienter med kolorektal kreft (figur 3B til høyre), som var sammenfallende med andres funn [5 ], [6], [7]. I tillegg fant vi kreftvev viste en bemerkelsesverdig tap av MIR-26b (~45.45%) sammenlignet med de tilstøtende normale kolorektal kreft vev i panelet av 18 pasienter med kolorektal kreft (Figur 3B venstre), som ikke har blitt rapportert før . Vi observerte en invers korrelasjon mellom MIR-26b og Nampt ekspresjon i cancervev (figur 3C venstre) og tilstøtende normale vev (figur 3C høyre).
MiR-26b hemmer celleoverlevelse og Invasion, og dette kan delvis opphevet ved tilsetning av NAD
Nampt er kjent for å regulere et utvalg av biologiske aktiviteter, inkludert celleoverlevelse og invasjon. Siden MIR-26b er antatt å målrette Nampt, effekten av MIR-26b på celle overlevelse og invasjon ble undersøkt. Videre har vi co-transfekterte celler med Mir-26b etterligne, deretter 1,0 mm /L NAD + (maksimalt effektiv) ble satt til å avgjøre om effektene av Mir-26b er mediert av Nampt-mediert NAD biosyntesen.
Bruk den CKK-8-analysen, celler behandlet med Mir-26b inhibitor hadde høyest celleproliferasjon, etterfulgt av celler behandlet med negativ kontroll, Mir-26b ligner pluss NAD, og Mir-26b ligner alene (Figur 4A). En 21,1% økning i cellevekst ble observert i LoVo-celler 4 dager etter transfeksjon med MIR-26b-inhibitor, når sammenlignet med vekst i den negative kontroll. Imidlertid transfeksjon med MIR-26b ligner undertrykkes veksten av LoVo-celler med 31,48% i forhold til den negative kontroll. Transfeksjon med MIR-26b ligner pluss NAD økt vekst av LoVo celler ved 26,85% sammenlignet med gruppen tilført med bare Mir-26b etterligner.
A. LoVo-celler ble behandlet med MIR-26b etterligner et al., Og cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av celletellingsleder-8. B. Kvantifiseringen av apoptotiske celler indusert av MIR-26b etterligner (med og uten NAD) eller MIR-26b-inhibitor ble bekreftet ved strømningscytometri-analyse. De sub-G1 innholdet ble utpekt apoptotiske celler. C. Representative mikrografer av celle invasjon analyser (til venstre) og kvantifisering (til høyre) fra forskjellige behandlinger (* p 0,01). De fargede invasive Cellene ble fotografert under en invertert lysmikroskop (100 x forstørrelse). *: Versus negativ kontrollgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgruppene. Hver vertikale linjen representerer gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser. For sammenligning av 2 grupper, ble en to-halet, uparet t-test anvendt.
flowcytometri analyseresultatene er vist i Figur 4B. Utsette LoVo-celler til MIR-26b-inhibitorer i 4 dager redusert betraktelig prosentandel av tidlig stadium apoptotiske celler (3,03 ± 0,72% sammenlignet med 7,33 ± 0,60% i den negative kontrollgruppen). Transfeksjon med MIR-26b ligner og NAD bemerkelsesverdig redusert tidlig stadium apoptotiske rate (12,23 ± 0,35% sammenlignet med 24,2 ± 0,79% i gruppen transfektert bare med Mir-26b etterligner).
Av interesse, speil 26b undertrykkelse påvirkes ikke bare celleoverlevelse, men også invasjon (figur 4C). Transfeksjon med MIR-26b-inhibitor merkbart øket invasjonen effektiviteten av LoVo-celler (1,7-fold) i henhold til den Transwell analysen. Transfeksjon med MIR-26b ligner imidlertid redusert invasjonen effektiviteten av LoVo-celler til 34,53%, og dette ble delvis reddet ved tilsetning av NAD (økes til 66,10%). Resultater fra Figur 4 derfor tyde på at Mir-26b hemmet celle overlevelse og invasjonen i LoVo celler. Tillegg av NAD delvis motvirket denne effekten.
Diskusjoner
Studier har vist at Nampt er betydelig økt i primære kolorektal kreft [5], [6], [7] og andre kreftformer [8 ], [9], [10], [11]. Således kan Nampt være en god biomarkør av maligne potensial og trinn progresjon [1], [8], [25], [26]. Nampt-mediert NAD biosyntesen spiller en avgjørende rolle i celle metabolisme, overlevelsesfunksjoner, og stress motstand gjennom sirtuins og andre NAD krevende regulatorer [1]. Den Nampt-spesifikke kjemiske hemmer FK866 utarmer celler av intracellulær NAD ved å binde på nikotinamid-bindingssete for Nampt og hemme NAD berging vei [23], [24]. I kreftceller, viser FK866 anti-tumor [27], anti-metastatisk [15], og anti-angiogene aktiviteter [28] og et kjemo-sensibiliserende effekt [27]. I kontrast til noen studier viste ikke-tumorigene celler var upåvirket av FK866 [29], [30]. Dette kan forklares ved det faktum at kreftceller krever høyere NAD + nivåer for å imøtekomme med høy metabolsk hastighet enn normale celler. Følgelig er det en forskjell i dose-respons mellom maligne og normale celler som til nivået av celle NAD + innhold. Derfor FK866 er godt tolerert, og det hemmer tumorvekst betydelig in vitro og in vivo. Disse resultatene er støttet av mange forskere [12], [13], [14], [15]. I denne studien vi først viste at FK866 signifikant inhiberte celleoverlevelse og redusert NAD nivåer i SW480 og LoVo-celler, noe som antyder at den Nampt-mediert NAD biosyntetiske mekanisme er aktiv i kolorektal kreftceller. Interessant, var det liten sammenheng mellom nedgangen i NAD + og økningen i apoptose ved hjelp FK866 i henhold til våre resultater (r = -0,8544,
p
= 0.3479). Det kan være to forskjellige antagelser som for resultatet. For det første kan det være en terskeleffekt på grunn av den høye konsentrasjonen av FK866. For det andre, Thakur, B. K. rapportert FK866 er i stand til å indusere apoptose i leukemiceller ved indirekte aktivering av tumor-suppressor protein p53 [13], og denne veien kan også fungere i kolorektal kreftceller. Selv om det var liten sammenheng mellom NAD + og apoptose i henhold til våre resultater, vil dette ikke påvirke det faktum at FK866 kan være en lovende agent for kolorektal kreft. Og de molekylære mekanismer som er ansvarlig for den høye ekspresjon av Nampt i kolorektal cancer ikke er fullt ut forstått.
Nylig ble det rapportert at upassende ekspresjon av mirnas bidrar til patogenesen av kreft. Reduserte nivåer av MIR-26b er observert i et bredt spekter av tumorer [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. I våre studier, viste vi at uttrykket av MIR-26b ble betydelig nedregulert i 18 kreftprøver av pasienter med kolorektal kreft. I pasienter med kolorektal kreft, Mir-26b var 2,2 ganger høyere i tilstøtende normalt vev enn i kreftvevet (p 0,0001). Vi opprinnelig identifisert Nampt som et mål av MIR-26b av bioinformatikk analyser, luciferaserapportørplasmid analyser, og fraksjonen analysen av transfeksjon av MIR-26 etterligner eller hemmere. Overekspresjon av MIR-26b ved transfeksjon av MIR-26 ligner betydelig redusert Nampt mRNA og proteinnivåer in vitro. Vår studie fant at Mir-26b ligner er mer effektive i apoptose enn i spredningsanalyser. Resultatene i samsvar med andre studier at inhibering av Nampt forårsaket generell cytotoksisitet [13]. Knockdown of Mir-26b ved transfeksjon av Mir-26b hemmere betydelig økt Nampt mRNA og proteinnivåer. Dette indikerer at Mir-26b regulerer Nampt primært gjennom translasjonell undertrykkelse. I mellomtiden, i våre resultater de regulatoriske veier av Mir-26b ble assosiert med invasivitet og metastase i kolorektal kreft celler. Ma et al. viste at overekspresjon av MIR-26b hemmet in vivo-tumorvekst i mus injisert med LoVo-celler [38]. Videre fant vi at hemming av celleoverlevelse og invasjon av overekspresjon av Mir-26b kan være delvis reddet av tillegg av NAD. Dette resultatet indikerer at Mir-26b hemming av tumorcelleoverlevelse og invasjon innebærer Nampt-mediert NAD biosyntesen. Derfor våre funn gi innsikt i funksjon av MIR-26b i å regulere kolorektal tumorigenesis. I tillegg, gitt at Nampt funksjoner i stoffskiftet og immunresponser, kan Mir-26b også påvirke disse prosessene ved å dempe oversettelsen av Nampt. Dette tyder på en mekanistisk forklaring på nedregulering av MIR-26b i diabetisk mus [39].
Men den mekanismen som Mir-26b og Nampt regulere tumorigenesis kan ikke være så enkelt. Når konsentrasjonen av NAD + var maksimalt effektiv, ble rednings ikke fullt ut gjenopprettes. Alternativet veien kan være mulig involvering. Først nyere studier indikerer at MIR-26b har mange andre direkte mål, slik som EphA2 [40], SLC7A11 [32], Lef-1 [41], pRb protein [42], og COX-2 [36]. For det andre, kan andre enn Mir-26b mirnas målrette Nampt uttrykk. For eksempel, MIR-182 downregulated Nampt uttrykk i Tat-indusert HIV-1 lang terminal gjentagelse (LTR) trans [43]. For det tredje, selv om det rapportert at reguleringen av glukosestimulert insulinsekresjon og mTORC1 og ERK1 /2-signal pathway er involvert i Nampt-media NAD berging syntese [12], [44], andre signalveier som involverer Nampt, så som PI3K /Akt [45] og STAT3 [46], [47], også delta i tumordannelse, transformasjon, og angiogenese. I sum bidrar Mir-26b-Nampt-NAD signalveien til kolorektal kreft celle overlevelse og invasjon, men det er ikke den eneste veien.
Konklusjon
I sammendraget, tyder vår nåværende studie at MIR-26b regulerer negativt Nampt uttrykk på posttranskripsjonelt nivå ved å binde seg til sin 3′-UTR. I tillegg MIR-26b inhiberte tumorvekst og invasjon, og denne effekten ble delvis opphevet ved tilsetning av NAD. Vi fant også at nivåene av Mir-26b i pasient kolorektale tumorvev var mye lavere enn i tilstøtende normalt vev, og at MIR-26b uttrykk omvendt korrelert med uttrykk for Nampt mRNA i 5 kolorektal kreft cellelinjer og pasientprøver. Disse resultatene tyder på at våre resultater er klinisk relevant: Mir-26b overekspresjon og hemming av Nampt-NAD signalveien kan være en begrunnelse for terapeutiske intervensjoner i kolorektal kreft i fremtiden
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. .
luciferaserapportørplasmid analyser validerer samspillet mellom MIR-26b og Nampt. A. Bygging av pEZX-MT01 luciferase reporter (Luc-Nampt 3′-UTR). hLuc, ildflue luciferasereportergenet; hRLuc, Renilla luciferasereportergenet. Ildflue luciferase-ekspresjon er regulert av binding av miRNA til det 3′-UTR-målsekvensen. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. B. Diagram av Nampt med villtype og muterte sekvenser i den potensielle Mir-26b bindingssetet. C. Sequence kart villtype og mutert Nampt sekvenser etablert av gensekvensering
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069963.s001 plakater (TIF)
