Abstract
Bakgrunn
Småcellet lungekreft (SCLC) er preget av rask progresjon og lav overlevelse. Derfor er nye terapeutiske midler stort behov for denne sykdommen. Capsaicin, den aktive ingrediensen i chilipepper, viser anti-proliferativ aktivitet i prostata og epidermoid kreft
in vitro
. Imidlertid har anti-proliferativ aktivitet av kapsaicin ikke blitt studert hos mennesker SCLCs. Den nåværende manuskriptet fyller dette tomrommet av kunnskap og utforsker anti-proliferativ effekt av capsaicin i SCLC
in vitro Hotell og
in vivo
.
metodikk /hovedfunnene
BrdU analyser og PCNA ELISA viste at capsaicin viser robust anti-proliferativ aktivitet i fire humane SCLC cellelinjer. Videre capsaicin potent undertrykte veksten av H69 humane SCLC svulster
in vivo
som konstatert ved CAM analyser og nakne mus-modeller. Den andre delen av vår studie forsøkt å gi innsikt i molekylære mekanismene bak anti-proliferativ aktivitet av capsaicin. Vi fant at den anti-proliferative aktivitet av capsaicin er korrelert med en nedgang i ekspresjon av E2F-responsive formerende gener som cyclin E, tymidylatsyntase, cdc25A og cdc6, både på mRNA og proteinnivå. Transkripsjonsfaktor E2F4 mediert anti-proliferativ aktivitet av kapsaicin. Ablasjon av E2F4 nivåer av siRNA metodikk trykt capsaicin-indusert G1 arrest. Chip analyser vist at capsaicin forårsaket rekruttering av E2F4 og p130 på E2F-responsive proliferative arrangører, og dermed begrenser celledeling.
Konklusjon /Betydning
Våre funn tyder på at anti-proliferative effekter av capsaicin kan være nyttig i behandlingen av menneskelige SCLCs
Citation. Brown KC, Witte TR, Hardman WE, Luo H, Chen YC, Carpenter AB, et al. (2010) Capsaicin Viser Anti-proliferativ aktivitet mot human småcellet lungekreft i cellekultur og hårløse mus modeller via E2F Pathway. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10,1371 /journal.pone.0010243
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 08.01.2010; Godkjent: 24 mars 2010; Publisert: 20 april 2010
Copyright: © 2010 Brown et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Center of Biochemical Forskning Excellence Pilot stipend fra National Institutes of Health (tilskudd nummer 5P20RR020180); Den farmasøytiske Manufacturers Association Foundation Forskning Starter Grant; Marshall-universitetet ADVANCE fellesskap; en Grant-in-Aid lavere forskningsstipend fra National Aeronautics and Space Administration; og en ung Clinical Scientist Award fra Flight Attendant Medical Research Institute (tilskudd nummer 82115). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er en aggressiv kreft som representerer 13% av alle lungekreft tilfellene, med en samlet 5-års overlevelse på mindre enn 5% [1], [2]. Slik statistikk understreker behovet for nye behandlingsstrategier for denne sykdommen. Nylige fremskritt i grunnleggende forståelse av molekylære hendelser som er involvert i SCLC progresjon har ført til identifisering av potensielle agenter for terapeutiske intervensjoner [2], [3], [4], [5]. Disse strategiene omfatter vekstfaktor /reseptor-spesifikke hemmere, protein kinase inhibitorer og næringsmidler. Identifiseringen av næringsmidler som viser anti-proliferativ aktivitet kan representere en ny terapeutisk avenue i humane SCLC.
capsaicin, den viktigste aktive ingrediensen i chilipepper, brukes lokalt for å behandle smerte og inflammasjon assosiert med en rekke sykdommer [6], [7]. Chemoprevention studier viser at capsaicin kan undertrykke karsinogenese i hud, tarm, lunge, prostata tunge og [8], [9], [10], [11], [12]. Selv om disse studiene har adressert chemopreventative potensialet av kapsaicin, bare noen få har adressert sitt potensial som et anti-cancer middel. For eksempel har capsaicin blitt vist å indusere apoptose i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), T-celle-leukemi, esophageal karsinom, astroglioma, prostata, tykktarm og magekreftceller i cellekulturmodeller [13], [14], [15], [16], [17]. I tillegg har administrering av kapsaicin blitt vist å undertrykke prostatakreft tumorvekst i nakne mus modeller [10], [18].
I tillegg til å forårsake apoptose, og capsaicin blitt funnet å indusere cellesyklusarrest i human cancer celler. Flere konvergerende studier har vist at capsaicin-indusert G1 arrest i CE 81T /VGH humane epidermoid carcinoma celler og prostatakreftceller oppnås via induksjon av p53 og den cyklin-avhengig kinase (CDK) inhibitor p21 [10], [17], [19 ], [20], [21]. Behandlingen av HL-60 humane leukemiceller med kapsaicin forårsaket G1 rest via inhibisjon av CDK2-aktivitet. Den anti-angiogene aktivitet av capsaicin er tilskrevet dets evne til å forårsake G1 arrest i endotelceller. Capsaicin-indusert G1 arrest er korrelert med undertrykkelse av cyklin D1 nivåer, hemning av CDK4 aktivitet og Rb-fosforylering i endotelceller og brystkreftceller [21], [22]. Disse data øke muligheten for at den anti-proliferative aktivitet av capsaicin er mediert av dens virkninger på E2F-Rb veien.
E2F-familien av transkripsjonsfaktorer, som består av åtte medlems gener (E2F1-E2F8), spiller en sentral rolle i regulering av cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon [23], [24], [25], [26]. Disse E2Fs har blitt ytterligere underklassifiseres i to grupper basert på deres transkripsjonsregulerende egenskaper på genet arrangører. E2F1, E2F2 og E2F3 blir ofte referert til som «aktivator» E2Fs fordi de transkripsjonelt aktiverer E2F pulsformerende gener som for eksempel cyclin E, cdc25A og cdc6 [25], [27], [28], [29]. Disse målgener deretter indusere innføring av celler i S-fase, for derved å fremme cellesyklusprogresjon. Den andre underklasse, E2F4 og E2F5, er referert til som «repressor» E2Fs fordi de undertrykker transkripsjonen av E2F rettet mot proliferative gener. E2F familiemedlemmer E2F6, E2F7 og E2F8 er også repressors. E2F7 og E2F8 er de mest nylig identifiserte medlemmer av denne familien, og mye mindre er kjent om deres funksjon og regulering [25]. Til tross for det faktum at alle transkripsjonelt aktive E2Fs bindes til det samme DNA-gjenkjenningssetet på mål-promotorer, de har forskjellige funksjonelle roller i cellen [26], [29].
Studier i de senere år har vist at aktiviteten av E2Fs er strengt regulert av lommen protein familien, nemlig Rb, p130 og p107. E2Fs 1-3 kan binde seg til Rb-proteinet, men E2Fs 4 og 5 fortrinnsvis bindes til P107 og P130-proteiner [24], [25], [26], [29], [30]. De Rb familie proteiner bindes til en gruppe innenfor den transkripsjonelle aktivering regionen E2Fs, effektivt undertrykke deres aktivitet. Dermed hvilende celler inneholder høye nivåer av E2F proteiner bundet til RB, p130 og p107. Utbruddet av mitogen stimuli fører til fosforylering av RB, p130 og p107 av cyclin D og E og tilhørende kinaser. Fosforylering av Rb, p107 og P130 resultater i deres inaktivering og dissosiasjon fra E2F proteiner [25]. Disse gratis E2Fs deretter binde til målet proliferativ arrangører som cyclin E, tymidylatsyntase (TS), cdc25A og cdc6 som regulerer cellesyklusprogresjon [31], [32]. Av disse E2F1-3 stimulere transkripsjon av de nevnte gener, mens E2F4 og E2F5 undertrykke transkripsjon [25]. Et flertall av humane SCLC er mangelfull i Rb-proteinet [3]. Derfor er det sannsynlig at de andre to lomme proteiner, p107 og p130, spiller en viktig rolle i E2F regulering og celleproliferasjon i menneskelige SCLCs.
Den anti-proliferativ aktivitet av capsaicin er ikke undersøkt i menneskelige SCLCs . Den nåværende manuskriptet fyller dette gapet av kunnskap, og viser for første gang at capsaicin kan potent hemme proliferasjonen av humane SCLCs bruker flere cellekultur og
in vivo
modeller. Tidligere studier har vist at et flertall av humane SCLCs har mutasjoner i Rb og p53, samt en feilregulering i den E2F-Rb veien [3], [4], [5]. Data innhentet fra mikromatriser, vevsprøver fra lungekreftpasienter og humane lungekreftcellelinjer tyder på at cellesyklusregulerende molekyler, som E2F1-5, p130, Skp2, cyclin D1 og p16, bidra til vekst og progresjon av lungesvulster [33] . Derfor har vi antatt at capsaicin viser anti-proliferativ aktivitet i humane SCLCs ved å regulere aktiviteten av E2F-familien av transkripsjonsfaktorer.
Den foreliggende manuskriptet er en innledende studie for å undersøke anti-proliferativ aktivitet av kapsaicin i humane SCLC både i cellekultur og dyremodeller. Her demonstrerer vi for første gang at capsaicin viser potent anti-proliferativ aktivitet i fire humane SCLC cellelinjer
in vitro
. Videre viser våre resultater at capsaicin undertrykker vekst av humane SCLC svulster i CAM og nakne mus modeller. Vi har også undersøkt bidraget av E2F-familien av transkripsjonsfaktorer i vekst-inhiberende virkninger av kapsaicin i SCLC-celler. Vi har observert at capsaicin hemmer proliferasjonen av humane SCLCs via et bestemt medlem av E2F-familien, nemlig E2F4. Ablasjon av E2F4 nivåer av to uavhengige siRNA ble funnet å reversere den anti-proliferative effekt av kapsaicin. Videre ble capsaicin-indusert veksthemming assosiert med en reduksjon i ekspresjonen av E2F målgener cyclin E, TS, cdc25A og cdc6. Endelig kromatin IP (chip) analyse av humane SCLC celler viste at behandling av capsaicin redusert rekruttering av aktivator E2Fs, nemlig E2F2 og E2F3, til proliferativ arrangører som cyclin E, TS, cdc25A og cdc6. På den annen side ble rekruttering av repressor E2F4 forsterkes av capsaicin behandling. Tatt sammen, våre data at capsaicin viser potent anti-proliferativ aktivitet i humane SCLC-celler ved forskjellig regulering av E2F-familien av transkripsjonsfaktorer. Videre våre resultater øke muligheten for at næringsmidler som capsaicin kan være nyttig for behandling av human SCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Nude mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories og akklimatisert i en uke. De ble plassert i autoklav bur med
ad libitum
tilgang til mat og vann i HEPA-filtrert stativer og overvåkes nøye av dyr anlegget ansatte. Alle prosedyrer som involverer nakne mus ble utført i henhold til Animal Care og bruk retningslinjene i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University (protokoll # 371).
Cell Kultur og Transfeksjon
Den menneskelige SCLC cellelinjer NCI-H69, NCI-H82 (heretter kalt H69 og H82, henholdsvis), ble DMS53 og DMS114 innhentet fra American Type Culture Collection, Rockville, MD. Disse cellelinjer ble valgt fordi de har blitt omfattende studert, og deres fysiske og molekylære karakteristika ligner SCLC hos pasienter. Gazdar et al., (1985), opprinnelig isolert og karakterisert i H69 og H82-cellelinjer [34], [35]. De fant at morfologien og vekstegenskaper av H69 og H82-celler var typisk for SCLC tumorceller som finnes hos pasienter. Videre ble den biokjemiske Profilen til disse celler (tilstedeværelse av L-dopa-dekarboksylase, nevroendokrine markører, bombesin-lignende immunoreaktivitet, neuron-spesifikk enolase og høye konsentrasjoner av hjerne isoenzymet av kreatinkinase) funnet å være identisk med humane SCLC-svulster observert hos pasienter . Tilsvarende, DMS53 og DMS114 celler ble først isolert fra humane SCLC-biopsier og karakterisert ved Pettengill et al., (1980). De fant at både DMS53 og DMS114 beholdt den fysiske, morfologiske og biokjemiske profilen til menneske SCLC svulster ble observert i klinikken [36].
H69 og H82 ble opprettholdt i RPMI-1640 supplert med 2 mM glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). DMS53 humane SCLC-celler ble dyrket i Waymouth MB752 /1 «s medium inneholdende 2 mM glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% FBS. Dyrkningsmedier for DMS114 humane SCLC-celler var identisk med DMS53, bortsett fra at mediet inneholdt ytterligere 2% natriumbikarbonat.
Primære normale humane bronkiale epitelceller (NHBE) og små luftveis-epitelceller (SAEC) ble oppnådd fra Lonza Technologies, Sveits. NHBEs ble opprettholdt i BEBM medier som inneholder vekstfaktorer. Tilsvar SAECs ble opprettholdt i SABM media supplert med vekstfaktorer. Både BEMB og SABM media ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner. Alle eksperimenter ved hjelp av NHBEs og SAECs ble utført mellom passasjene 3-8 [31].
MTT-analysen
MTT-analyser ble utført som beskrevet av Heo et al., (1990). H69 og H82-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 50.000 celler /brønn. DMS53 og DMS114 celler ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 5000 celler /brønn. Platene ble inkubert i 24 timer for å tillate fullstendig reattachment av cellene. Deretter ble cellene behandlet med 50 uM kapsaicin i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Etter de angitte tidspunkter ble 50 ul av MTT-løsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C [37]. Deretter ble mediet aspirert, og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn for å oppløse formazankrystaller. Absorbansen av platene ble målt på en ELISA-leser (referansenivå, BioRad) ved en bølgelengde på 540 nm. Hver prøve ble utført in triplo, og det hele forsøket ble gjentatt to ganger.
BrdU og PCNA proliferasjonsanalyser
bromdeoksyuridin (BrdU) merking enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) sett ble oppnådd fra Roche Biochemicals og ble anvendt for å undersøke effekten av capsaicin på proliferasjonen av fire humane SCLC-cellelinjer, H69, H82, DMS53 og DMS114. BrdU er en tymidin-nukleotid-analog som er innlemmet i S-fase (i stedet for tymidin) bare i DNA av prolifererende celler [31], [32], [38].
H69 og H82-celler ble sådd ut i 96-brønns plater ved en tetthet på 50.000 celler /brønn. DMS53, DMS114, SAEC og NHBE celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 10.000 celler /brønn. DMS53 og DMS114 ble inkubert med serumfritt medium i 36 timer for å fjerne effekten av endogene vekstfaktorer. Etter 36 timer, disse cellene ble deretter re-stimulert med 10% FBS i nærvær eller fravær av indikerte konsentrasjoner av kapsaicin i 18 timer, som er den tid som kreves for S-fase oppføring [31], [32], [38] . Den NHBEs og SAECs ble gjengitt i hvile basale medier som inneholder ¼ mengden (v /v) av vekstfaktorer i 24 timer (cit). Deretter ble cellene stimulert med fullstendig medium som inneholder hele volumet av vekstfaktorer i 18 timer som beskrevet tidligere. Frekvensen av BrdU-inkorporering ble målt ved hjelp av ELISA-teknikken, og prosentandelen av celler i S-fase kvantifisert ved kolorimetrisk vurdering (λ = 405 nm). Absorbansen av celler behandlet med 10% FBS eller fullstendig medium ble antatt å være 100%, og capsaicin-indusert reduksjon i S-fase ble beregnet som en prosentandel av kontroll FBS behandlede celler. Hver prøve ble testet i triplikat, og analysen ble gjentatt to ganger.
Celleproliferasjon ble også vurdert ved å måle nivåene av prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) ved hjelp av en PCNA ELISA-kit fra Calbiochem. H69, H82, DMS53 og DMS114 ble sådd ut i 96-brønners plater, og behandlet på en identisk måte som den BrdU-analysen beskrevet ovenfor. Deretter ble mediet fjernet, og re-suspensjon buffer (50 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatin, 0,5 ug /ml leupeptin) ble tilsatt til cellene. Nivået av PCNA i cellene ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 405 nm, i henhold til produsentens protokoll. Hver prøve ble testet i duplikat, og analysen ble gjentatt to ganger for hver celletype.
Cellesyklusanalyse
H69 SCLC-celler ble benyttet for cellesyklusanalyse, ved anvendelse av en modifikasjon av propidiumjodid teknikken [15], [39]. Kort fortalt ble 5 × 10
5 celler brukes per prøve. Hver prøve ble inkubert med serum-fritt medium i 36 timer for å fjerne effekten av endogene vekstfaktorer. Etter 36 timer, ble cellene deretter re-stimulert med 10% FBS i nærvær eller fravær av 50 pM kapsaicin i 18 timer, som er den tid som kreves for S-fase oppføring [30]. Cellene ble høstet, vasket to ganger i buffer (1 mM EDTA i DPBS uten kalsium og magnesium, supplementert med 1% ultra low IgG FBS, Invitrogen Corporation), fiksert i iskald 70% etanol og resuspendert i propidium jod fargeløsning (50 ug /ml propidiumjodid, 25 pg /ml RNase A i DPBS /EDTA-buffer) i 30 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble analysert ved hjelp av en BD FACS Aria II strømningscytometer (BD Biosciences).
Lysater og Western blotting
Lysater for hver cellelinje ble foretatt ved bruk av NP-40-baserte lyseringsprotokoll [ ,,,0],31], [38], [40]. DMS114 celler ble dyrket i 100 cm retter til ca 70% samløpet. Cellene ble gjengitt hvile ved inkubering i serumfritt medium i 36 timer. Deretter ble cellene på nytt stimulert med 10% FBS i nærvær eller fravær av angitte doser av kapsaicin i 18 timer. Celler ble høstet og vasket tre ganger med iskald PBS. Cellene ble deretter lysert med M2 lyseringsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA, 3 mM EDTA, 4 mM DTT, 5 mM PMSF, 1 mM natriumfluorid, 1 mM natrium -ortovanadat, 25 ug /ml leupeptin, 5 ug /ml pepstatin, 5 ug /ml aprotinin, 25 ug /ml trypsin-chymotrypsin inhibitor). Sytti mikroliter av lyseringsbuffer ble tilsatt til hver 20 pl av hematokrit. Lysatet ble rotert ved 4 ° C i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 15000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet for videre analyse. Proteinkonsentrasjonen av løsningen ble målt ved hjelp av en Bradford-reagens (Bio-Rad Labs). Ett hundre og femti mikrogram prøve av protein ble kjørt på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad Labs).
Den relative ekspresjon av de angitte proteiner ble analysert ved western blotting. E2F1 monoklonale og polyklonale antistoffer E2F2-6 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonale antistoffer mot TS, cdc25A og cdc6 ble også oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonalt antistoff til cyclin E ble oppnådd fra BD Biosciences. Monoklonale β-aktin-antistoff ble erholdt fra Sigma Chemical Company, USA. Polyklonale GAPDH antistoff ble hentet fra Trevigen, ble Inc. De sekundære antistoffer hentet fra Pierce Bioteknologi. Den oppnådde i de vestlige blot eksperimenter signal ble oppdaget av SuperSignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Pierce Bioteknologi). Resultatene av den vestlige blotting analysene ble kvantifisert ved densitometrisk analyse (BioRad Gel Dokumentasjon System) ved hjelp av analyseprogrammet Antall 4.5.2.
Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane (CAM) Analyse
Spesifikk pathogen- gratis (SPF) frukt kylling egg (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) ble inkubert ved 37,5 ° C med 75% relativ fuktighet, og kontinuerlig roteres sakte av en automatisk egg turner (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). På Dag 9, ble egg candled og vinduer åpnes på skallet for å avdekke CAM [41]. H69 celler (3 x 10
6) ble suspendert i 100 mL kaldt serumfritt medium, blandet med 100 pl kald BD Matrigel Matrix (BD Biosciences, San Jose, California) og 50 mikrometer capsaicin. Disse cellene ble påført på CAM av hver kylling embryo. Eggene ble inkubert ved 37 ° C i 4 dager før tumorimplantater ble fjernet, fotografert og veies. I alt 12 egg ble analysert for hver gruppe [41].
Antitumor Studier i hårløse mus
Åtte fire ukers gamle mannlige nakne mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories og akklimatisert for en uke. De ble plassert i autoklav bur med
ad libitum
tilgang til mat og vann i HEPA-filtrert stativer og overvåkes nøye av dyr anlegget ansatte. Alle prosedyrer ble utført i henhold til Animal Care og bruk retningslinjene i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Joan C. Edwards school of Medicine, Marshall University (protokoll # 371).
H69 cellene ble høstet og re-suspendert i en 01:01 (v /v) løsning av serum-frie medier og Matrigel matrise (BD Biosciences). To millioner celler i 100 ul ble injisert subkutant mellom scapulae av hver mus [42]. Etter at tumorene nådde 100 mm
3, ble musene byttet til å styre AIN-76A diett inneholdende 10% maisolje inntil tumorene nådde 800 mm
3. Deretter ble musene delt i to grupper. Behandlingsgruppen (n = 4) ble endret til en diett inneholdende 50 mg kapsaicin /kg næringsmiddel (som er ca. 10 mg kapsaicin /kg kroppsvekt av mus per dag). Kontrollgruppen (N = 4) ble fortsatt i kontrolldietten. Musene ble veid en gang per uke. Deres matforbruk ble overvåket ved å veie matrestene en gang per uke. Administrasjonen av capsaicin forårsaket ingen ubehag eller vekttap hos mus. I tillegg matinntak var lik mellom kontroll og kapsaicinbehandlede mus.
medikamentell behandling ble videreført til svulster i kontrollgruppen nådde 2000 mm
3. Tumor lengder (l), bredder (B) og høyden (h) ble målt daglig (for 6 dager av en uke) for hver mus. Tumorvolumer ble beregnet som (L x B x H) /2 [43], [44]. Etter euthanizing musene, ble tumorene skåret ut. Halvparten av tumoren ble hurtigfrosset i flytende nitrogen, og brukes til å lage lysater. Tumor lysater ble fremstilt ved anvendelse av T-Pr lyseringsbuffer (Pierce Bioteknologi), i henhold til produsentens protokoll [38]. Den andre halvparten av tumoren ble fiksert i formalin og anvendt for immunhistokjemi.
Caspase Spalting Assay
caspase spaltning Analysen ble utført med tumor lysater fremstilt fra kontrollmus og capsaicin-behandlede mus ved hjelp av caspase -3 cleavage kit (Chemicon, Temecula). Tumor lysater ble fremstilt ved anvendelse av T-Pr lysebuffer som beskrevet ovenfor. En alikvot av 60 ul lysat ble anvendt for hver reaksjon. I tillegg, ble 60 ul av cisplatin-behandlede H69-lysat (laget av behandling av H69-celler med 30 pM av cisplatin i 72 timer) ble anvendt som den positive kontroll, i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Hver prøve ble testet i duplikat, og analysen ble gjentatt to ganger for hver celletype.
Immunhistokjemi
Immunfarging ble utført ved anvendelse av M.O.M. farging kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Parafininnstøpte H69 xenograft mus vevssnitt (4 mikrometer) ble avvokset i xylen og senere rehydrert i etanol. Snittene ble utsatt for antigen gjenfinning behandling ved hjelp av Antigen retrival kit (BioGenex Inc.), ifølge produsentens protokoll. Seksjonene ble deretter behandlet med proteinase K-behandling (20 ug /ml) i 15 minutter og stanset av endogene peroksidaser i 0,3% H
2o
2-oppløsning i metanol i 30 minutter. Seksjonene ble blokkert ved å bruke avidin-biotin blokkerende kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Snittene ble inkubert med anti-PCNA (BioGenex Inc.) monoklonalt primære antistoff (1:100 fortynning) i en time ved romtemperatur. Seksjonene ble skylt i PBS for å fjerne overskudd av antistoff, og utviklet ved hjelp av M.O.M. og peroksydase DAB settet, oppnådd fra Vector Laboratories (Burlingame, CA). Seksjoner ble kontra med hematoxylin, dehydrert, montert i Permount Mounting Medium (Fisher Biotech) og fotografert i henhold til Olympus BX41 lyse feltet mikroskop. Hemotoxylin og eosin (H og E) Bildene ble fotografert på 40X forstørrelse. PCNA farging ble fotografert på 1000x forstørrelse ved hjelp av olje. PCNA positive celler, som er de prolifererende celler, ble kvantifisert ved å telle 5 felt av 100 celler. Data presentert som prosentandelen av PCNA positive celler.
siRNA Transfeksjon og Analyser
kjemisk syntetisert, dobbelttrådet siRNA for E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 og E2F6 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. De transfeksjon ble utført i H69 og DMS114 celler [31], [45]. Asynkrone ble cellene høstet og sådd ut på nytt i 96-brønners plater ved ca. 40% konfluens i vekstmedium som inneholdt 10% FBS i fravær av antibiotika. Transfeksjon av de ovenfor nevnte siRNA ble utført ved hjelp av Oligofectamine reagens (Invitrogen Corporation), i henhold til produsentens protokoll. Atten timer etter transfeksjon, ble cellene gjengitt hvilende i 36 timer med inkubasjon i serumfritt medium. Deretter ble cellene behandlet med 10% FBS i nærvær av 50 uM kapsaicin i 18 timer. Den capsaicin ble tilsatt 30 minutter før tilsetning av media inneholdende 10% FBS. Etter 18 timer, ble prosentandelen av celler i S-fase målt ved hjelp av BrdU ELISA-sett (Roche Laboratories). En ikke-målsøkende sekvens siRNA (Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt som en negativ kontroll for transfeksjon eksperimenter. Hver transfeksjon ble utført i duplikat, og hele analysen ble gjentatt to ganger.
Resultatene av E2F4 transfeksjon eksperimentene ble verifisert ved hjelp av et andre sett av uavhengig siRNA oppnådd fra Ambion Biotechnologies [31], [45]. Protokollen for transfeksjon var samme som tidligere beskrevet. En ikke-målsøkende kontroll-siRNA ble anvendt som negativ kontroll i alle forsøkene. Hver transfeksjon ble utført i duplikat, og hele analysen ble gjentatt to ganger.
Western blotting eksperimenter ble utført for å vurdere ekspresjonen av proteiner etter siRNA transfeksjon [31], [45] i både H69 og DMS114 celler. Hver transfeksjon i H69 cellene ble gjort ved hjelp av 5 × 10
5 celler seeded i T-10 kolber (Vesten Scientific) i RPMI som inneholdt 10% FBS uten antibiotika. I tilfelle av DMS114 celler, ble transfeksjon utført i 6-brønners plater ved anvendelse av 5 x 10
5-celler /brønn. I begge de H69-celler og DMS114 celler ble hver transfeksjon utført i duplikat, og hele eksperimentet ble gjentatt to ganger. Transfeksjon av den angitte siRNA ble utført ved anvendelse av Oligofectamine reagens (Invitrogen Corporation), i henhold til produsentens protokoll. En ikke-målsøkende kontroll-siRNA ble anvendt som den negative kontroll. Etter 36 timers transfeksjon, ble lysater fremstilt som beskrevet ovenfor, og ekspresjon av E2F familie av proteiner ble bestemt ved Western-blotting-analyse.
real-time PCR
H69-celler ble utsatt for serum sult i 36 timer og deretter stimulert med 10% FBS i 8 timer, [46]. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy miniprep-kit fra QIAGEN. Ett mikrogram RNA ble DNase-behandlet ved hjelp av RQ1 DNase (Promega), etterfulgt av første-tråd cDNA-syntese ved hjelp av iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad). En fraksjon (1/20) av den endelige cDNA reaksjonsvolum ble anvendt i hvert PCR [46]. Primer sekvenser [46], [47] er som følger:
Cyclin E (forover primer): 5’TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 «.
Cyclin E (revers primer): 5’TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3′.
TS (forover primer): 5’CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 «
TS (revers primer):. 5’ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3 «.
Cdc6 (forover primer): 5’CCCCATGATTGTGTTGGTAT3′.
Cdc6 (reverse primer): 5’TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 «
18S (forover primer). 5’CTCAACACGGGAAACCTCAC3′
18S (revers primer). 5’AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 « .
real-time PCR ble utført på en Bio-Rad iCycler.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
H69 var serum-sultet i 36 timer ved å inkubere dem i serumfritt RPMI-1640 [31], [32], [40], [48]. Deretter ble disse hvilende H69-celler ble re-stimulert med 10% FBS i nærvær eller fravær av 50 pM kapsaicin i 8 timer. Tjuefem millioner celler ble anvendt pr IP reaksjon. Celler ble behandlet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur for å kryssbinde proteiner og DNA. Tverrbinding ble avsluttet ved tilsetning av 0,125 M glycin. Kanin-anti-muse-sekundært antistoff ble brukt som kontroll for alle reaksjoner. PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av 5 ul av DNA fra immunoutfellingen reaksjoner eller 1 ul DNA fra inngangs reaksjon som templat. PCR sykkelforholdene for TS og cdc6 var som følger: 94 ° C i 2 minutter; deretter 35 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s og 65 ° C i 30 s; etterfulgt av 65 ° C i 2 min. PCR sykkel betingelser for cyclin E var som følger: 94 ° C i 2 minutter; deretter 35 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 66 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; etterfulgt av 72 ° C i 2 min. Primeren for cyclin E omfattet to av tre E2F-bindingsseter på promoteren som beskrevet i Nevins et al., (1994). Disse bindingssetene omfatter høyaffinitets E2F-bindingsseter på det humane Cyclin E-promotoren [49]. PCR for c-Fos-promoteren (som ikke er regulert av E2F) ble anvendt som en negativ kontroll for alle eksperimenter. Sekvensene til de PCR-primere anvendt i PCR var som følger:
Cyclin E (forover primer): 5’CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 «.
Cyclin E promoter (revers primer): 5’CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3′ .
Cdc6 promoter (forover primer): 5’GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 «.
Cdc6 promoter (revers primer): 5’CTCGGACTCACCACAAGC3′
TS promoter (forover primer).: 5’TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 «.
TS promoter (reverse primer): 5’GACGGAGGCAGGCCAAGTG3′
cdc25A, c-fos primere og PCR-forhold er beskrevet i [29]
Statistisk analyse
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM og er representert ved hjelp av Graph Pad Prism 5. Forskjeller mellom kontroll og behandlede prøver ble analysert ved variansanalyse (ANOVA), fulgt av en Dunnetfs multiple sammenligningstest . Svulsten vekstrater i atymiske mus ble analysert ved ANOVA etterfulgt av Neuman-Keuls test. I immunhistokjemi eksperimenter, ble alle PCNA positive kjerner telles i fem uavhengige felt av to uavhengige observatører i en randomisert dobbel blind mote.
