Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er en aggressiv svulst og prognosen er fortsatt dårlig. Derfor er utvikling av mer effektive behandling er nødvendig. Vi har tidligere rapportert at høye nivåer av et anti-c-kit antistoff (12A8) akkumulert i SCLC-xenotransplantater. I denne studien, vurderte vi effekten av to antistoffer (12A8 og 67A2) for radioimmunterapi (RIT) av en SCLC musemodell ved merking med
90Y isotop.
Metoder
111In- eller
125I-merkede antistoffer ble evaluert
in vitro
av cellebinding, kompetitiv hemming og cellulær internalise analyser i c-kit-uttrykke SY celler og
in vivo
ved biodistribusjon i SY-bærende mus. Terapeutisk effekt av
90Y-merket antistoffer ble evaluert i SY-bærende mus opp til dag 28 og histologiske analyser ble utført på dag 7.
Resultater
[
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 spesifikt bundet til SY celler med høy affinitet (8,0 og 1,9 nM). 67A2 ble internalisert lik 12A8. Høye nivåer av [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 akkumuleres i tumorer, men ikke i hovedorganene. [
111In] 67A2 opptak av svulsten var 1,7 ganger høyere enn for [
111In] 12A8. [
90Y] 12A8, men ikke [
90Y] 67A2, undertrykket tumorvekst i en doseavhengig måte. Svulster behandlet med 3,7 MBq av [
90Y] 12A8, og 1,85 og 3,7 MBq av [
90Y] 67A2 (absorberte doser var 21,0, 18,0 og 35,9 Gy, henholdsvis) nesten helt forsvunnet ca 2 uker etter injeksjon, og Etterveksten ble ikke observert bortsett fra i ett muse behandlet med 1,85 MBq [
90Y] 67A2. Arealet av nekrose og fibrose økes avhengig av RIT virkning. Apoptotiske celle tall økte med økte doser av [
90Y] 12A8, mens ingen doseavhengig økning ble observert etter [
90Y] 67A2 behandling. Kroppsvekt ble midlertidig redusert, men alle mus tolerert de RIT eksperimenter godt.
Konklusjon
Behandling med [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2 oppnådde en komplett terapeutisk respons når SY svulster mottatt en absorbert dose som er større enn 18 Gy og dermed er lovende RIT agenter for metastatiske SCLC celler i fjerne områder
Citation. Yoshida C, Tsuji AB, Sudo H, Sugyo A, Kikuchi T, Koizumi M, et al. (2013) Terapeutisk effekt av C-Kit-målrettet radioimmunterapi Bruke 90Y-merket anti-C-Kit Antistoffer i en musemodell av småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (3): e59248. doi: 10,1371 /journal.pone.0059248
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 2 september 2012; Godkjent: 13 februar 2013; Publisert: 14 mars 2013
Copyright: © 2013 Yoshida et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Institute of Radiologisk Sciences til TS. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Småcellet lungekreft (SCLC) er et tydelig clinicopathologic enhet som utgjør opptil 20% av alle lungekrefttilfellene og skiller seg fra ikke-småcellet lungekreft med sin raske svulst dobling tid, høy vekst brøk og tidlig utvikling av utbredt metastaser [ ,,,0],2]. Selv SCLC er svært følsomme for cellegift og strålebehandling, forblir den generelle prognosen dårlig på grunn av høy tilbakefall eller metastaserende priser, og dårlig respons av ildfast SCLC [2], [3]. Median overlevelse for pasienter med residiverende SCLC er ca seks måneder [3].
I det siste har mange molekylære målrettede medikamenter blitt utviklet som bidrar til økt overlevelse for pasienter med flere kreftformer [4]. SCLC sterkt uttrykker flere molekyler slik som c-kit, c-Met, og vaskulær endotelial vekstfaktor [4]. C-kit proto-onkogenet koder for et 145-kDa transmembrane tyrosinkinasereseptor bestående av en ekstracellulær del med fem immunoglobulin-lignende domener: de første tre inneholde en ligand bindingssete og den fjerde og femte domenene er forbundet med reseptordimerisering, det transmembrane porsjon, og den intracellulære del med kinase-enzymatiske aktivitet [5], [6], [7]. Stamcellefaktor er en ligand for c-kit og dets bindings fører til reseptoraktivering og utløser aktivering av nedstrøms signalveier som er involvert i cellevekst, differensiering og utvikling. C-kit er innblandet i den raske cellevekst observert i SCLC og dermed regnes som en kandidat målmolekyl for diagnostikk og terapi av SCLC [8]. Imatinib, en inhibitor for c-kit-tyrosin-kinase-aktivitet, er meget effektiv mot kjemoterapi-resistente gastrointestinal stromal tumor (GIST) [9], [10]. Selv om flere prekliniske studier har rapportert at undertrykkelse av c-kit signale hemmer SCLC cellevekst [4], [11], fase II imatinib studier hos pasienter med residiverende c-kit-positive SCLC rapporterte ingen objektive svar eller vedvarende sykdomsstabilisering [12], [13], [14]. Dette tyder på at progresjonen ikke kan avhenge av c-kit på grunn av en mangel på aktiverende mutasjoner i motsetning GIST, til tross for høy c-kit-ekspresjon i SCLC [15], [16]. Selv om blokkering av c-kit banen ikke kan ha en terapeutisk effekt på SCLC, kan c-kit være et lovende mål for selektiv levering av terapeutiske midler slik som toksiner og radioisotoper til c-kit positive SCLC tumorceller ved hjelp av bærere slike som antistoffer.
Vi har tidligere rapportert at høye nivåer av
111In-merket anti-c-kit antistoff, 12A8, akkumulert i c-kit-uttrykk SCLC xenotransplantater, mens dets akkumulering var lav i normale organer [ ,,,0],17], [18]. Derfor har 12A8 potensiale til å bli brukt for radioimmunterapi (RIT) ved å erstatte γ mitterende
111In med β- eller a-emitterende radionuklider med egnede kjernefysiske egenskaper. Begrepet RIT har blitt realisert i klinikker for behandling av non-Hodgkin lymfom B-celle, ved anvendelse av anti-CD20-antistoff merket med
90Y eller
131I [19].
90Y er en ren β-emitter med høy energi (maksimal energi 2,3 MeV), lang partikkelområde (maksimal rekkevidde i vann, 11,3 mm), et passende halveringstid (64,1 timer) for RIT med IgG og egnet for RIT med en internalise antistoff [19], [20]. I denne studien har vi evaluert og sammenlignet
in vitro Hotell og
in vivo
egenskapene til to radiomerket anti-c-kit monoklonale antistoffer, 12A8 og 67A2, og deres bruk i eksperimentell RIT av SCLC bruker
90Y-merket antistoff.
Materialer og metoder
Cells
Et menneske SCLC cellelinje SY (Immuno-Biological Laboratories (IBL), Takasaki, Japan ) med høy c-kit-ekspresjon ble opprettholdt i RPMI1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA) inneholdende 5% føtalt bovint serum (Sigma, St. Louis, MO, USA) i en fuktet inkubator holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
antistoffer
To anti-c-kit mus monoklonale antistoffer (12A8 [17] og 67A2) ble kjøpt fra IBL. Hvert antistoff binder seg til en annen epitope på den ekstracellulære delen av c-kit: 12A8 binder seg til det femte domene nærmest til det transmembrane domenet og 67A2 binder seg til det andre domenet. Likevekts-dissosiasjonskonstanten (Kd) av 12A8 og 67A2 er 1,06 og 0,26 nM, henholdsvis, som målt ved hjelp av en overflate-plasmonresonans assay. 12A8 har sterke nøytralisering og moderate antitumor aktiviteter, men ikke induserer antistoffavhengig celle cytotoksisitet (ADCC) eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). 67A2 ikke har noen av de ovennevnte aktiviteter (informasjon levert fra produsent).
Radiomerking av antistoffer
Antistoffer (12A8 og 67A2) ble konjugert med
p
-SCN-Bz-CHX-A » – DTPA (DTPA; Macrocyclics, Dallas, TX, USA) som tidligere beskrevet [17], [18], og deretter DTPA-konjugerte antistoffer ble renset ved hjelp av en Sephadex G-50 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) kolonne. Disse DTPA-konjugerte antistoffer (20 mikrogram) ble blandet med 1,2 MBq av [
111In] Cl
3 eller 9,25 MBq av [
90Y] Cl
3 i 0,5 M acetat buffer (pH 6,0) , og blandingen ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Radiomerkede antistoffer ble separert fra fri
111In eller
90Y ved anvendelse av en Sephadex G-50 kolonne. Den konjugering forholdet mellom DTPA til begge antistoffer ble anslått til å være 1,1, som bestemmes av celluloseacetat elektroforese, og de spesifikke aktivitetene til [
111In] 12A8, [
111In] 67A2, [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2 var ca 50, 50, 300 og 450 kBq /ug, henholdsvis. Merkingen Utbyttet var omtrent 80% for
111In merking og 65% til 97% for
90Y merking, og den radiokjemiske renheten oversteg 96%. 67A2 ble også merket med
125I ved bruk av kloramin-T for internalise assay som tidligere beskrevet [17]. Den spesifikke aktiviteten av [
125I] 67A2 var ca 500 kBq /ug.
In vitro
analysen
Cell binding, kompetitiv hemming og internalisering analysene ble gjennomført som tidligere beskrevet [17]. I korthet, i en cellebindingsanalyse, i serie-fortynnet SY-celler i PBS ble inkubert med den
111In-merket antistoff på is i 60 min. Etter vasking, ble radioaktiviteten bundet til cellene ble målt. Immunreaktiviteten av
111In-merkede antistoffer ble beregnet i henhold til metoden til Lindmo
et al product: [21]. I et konkurrerende inhiberingsanalyse ble
111In-merket antistoff inkubert med SY-celler i nærvær av varierende konsentrasjoner av umerket antistoff på is i 60 min. Etter vasking, ble radioaktiviteten bundet til cellene telles. Data ble analysert og Kd ble estimert ved hjelp GraphPad Prism programvare (Graphpad Software, La Jolla, CA, USA). I en internalise analysen ble SY-celler preinkubert i kulturmedium med
125I- eller
111In-merket antistoff på is i 60 min. Etter vasking oppsamlede celler ble ytterligere dyrket ved 37 ° C eller på is i ferskt medium uten radiomerkede antistoffer. På forskjellige tidspunkter, ble supernatanten og cellene separert ved sentrifugering. Trikloreddiksyre ble tilsatt til supernatanten på is og deretter separert ved sentrifugering for å bestemme den ikke-proteinbundet fraksjon (supernatant) og proteinbundet fraksjon (pellet). Cellene ble vasket med sur buffer og deretter separert ved sentrifugering for å bestemme både den membranbundne (supernatant) og internalisert fraksjon (pellet).
Biofordeling av
111In-merket antistoff
BALB /c-nu /nu-mus (5 uker gamle, Clea Japan, Tokyo, Japan) ble inokulert subkutant med 2 x 10
6 SY celler i venstre lår. Mus (19 til 23 g i kroppsvekt) bærende SY-tumorer ble injisert intravenøst med 37 kBq av
111In-merket antistoff. Den injiserte proteindose ble justert til 20 ug per mus. Ved 1, 2, 4, 7 og 10 dager etter injeksjon av
111In-merket antistoff, fem mus ved hvert tidspunkt ble avlivet, og blod ble erholdt fra hjertet. Svulsten og viktige organer ble fjernet og veid, og radioaktivitets-tellinger ble målt ved anvendelse av en gammateller. Dataene ble uttrykt som prosent av injisert dose pr gram vev (% ID /g) forråtnelse-korrigert og normalisert til en 20-g kroppsvekt mus.
tumor absorberte dosen for
90Y- merkede antistoffer ble beregnet fra dataene i biofordelingsstudier
111In-merkede antistoffer.
90Y avgir en β-partikkel med en midlere energi som utsendes fra 0,9331 MeV, og dermed den midlere energi som utsendes pr overgang ble beregnet som 1,495 x 10
-13 Gy kg (Bq r)
-1 basert på ett eV er lik to1.60218 × 10
-19 J [22]. Tumoropptak ved forskjellige tidspunkter ble plottet mot tiden, hvorfra arealet under kurven (AUC) ble beregnet. Den absorberes av tumor opp til 10 dager etter injeksjon ble beregnet ved hjelp av AUC og bety energi som utsendes pr overgang som følger dose: AUC x 1,495 x 10
-13 x injisert aktivitet. Den absorberte dosen til den røde marg i en 70-kg henvisning mann ble estimert fra våre biofordelingsstudier data ved hjelp OLINDA /EXM versjon 1.0 software (Vanderbilt-universitetet, Nashville, TN, USA) som tidligere beskrevet [23].
radioimmunterapi
To uker etter inokulering av SY-celler, mottok musene en intravenøs injeksjon av 0,74, 1,85 eller 3,7 MBq av
90Y-merkede antistoff (n = 5 i hver gruppe). Tumorstørrelse var 4,4 ± 3,2 mm
3 på tidspunktet for administrering. Proteinet dosen ble justert til 20 pg av hvert preparat ved tilsetning av umerket antistoff. Som negative kontroller ble mus injisert intravenøst med den umerkede antistoff (20 ug protein /mus) eller PBS alene (definert som ubehandlet), henholdsvis. Kroppsvekt og tumorvekst ble bestemt to ganger i uken. Tumor volum (mm
3) ble beregnet som bredde x høyde x dybde (mm) /2. Mus ble avlivet da xenopodet tumorvolumet nådd mer enn 200 mm
3. Dette eksperimentelle protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i National Institute of Radiologisk Sciences, og alle dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer angående dyr omsorg og behandling.
Histologisk analyse
Tumorprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble fjernet 1 uke etter injeksjon og fiksert i 10% (v /v) nøytral bufret formalin og innstøpt i parafin for snitting (n = 5 i hver gruppe). Seksjoner (3 mikrometer tykkelse) ble farget med hematoxylin og eosin (H E). Apoptotiske celler i svulsten ble oppdaget av terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert deoxyuridine trifosfat nick-end merking (TUNEL) flekker ved hjelp av en ApopTag Plus Peroxidase
In Situ
apoptose Detection kit (Chemicon International, Temecula, CA) som tidligere beskrevet [24]. Vi kvantifisert TUNEL-farget celler i minst fem tilfeldig utvalgte felt på 400 × forstørrelse.
Statistisk analyse
tumorvekst data ble analysert ved toveisgjentatt tiltak ANOVA med Student-Newman -Keuls metode multiple sammenligningstest. Apoptotiske celler data ble analysert ved Student
t
-test. En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
In vitro
karakterisering av
111In-merkede antistoffer
fra cellebindingsanalyse, binding av [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 bruker 1 x 10
7 SY celler var 50 og 76%, henholdsvis (fig 1A.). Binding av [
111In] 67A2 til SY-celler var høyere sammenlignet med den for [
111In] 12A8, spesielt ved lave cellulære konsentrasjoner. Den immunoreactive brøkdel av [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 var 83 og 88%, henholdsvis. Fra den konkurrerende inhibering analysen ble det Kd for [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 estimert til å være 8,0 og 1,9 nM henholdsvis (fig. 1B). Vi undersøkte tidsmessige endringen av radioaktivitet fra [
111In] 67A2 og [
125I] 67A2 i subcellulære fraksjonen (Fig. 1C og D). Radioaktivitet i cellemembranbundne fraksjon av [
111In] 67A2 og [
125I] 67A2 raskt redusert med tiden. I tilfelle av [
111In] 67A2, radioaktiviteten av internalisert fraksjonen økte med tiden, og nådde ca 55% etter en 20-timers inkubasjon ved 37 ° C (Fig. 1C). I kontrast, internalisert radioaktivitet av [
125I] 67A2 økt midlertidig inntil tre timer, men deretter redusert gradvis. Radioaktivitet av det ikke-proteinbundet fraksjon i kulturmediet øker med tiden, noe som reflekterer dehalogenering av
125I-merket antistoff på cellene (Fig. 1D). Når celler ble inkubert på is, fikk den membranbundne fraksjon ikke endres og internalisering ble ikke observert i minst 3 timer (data ikke vist). Disse resultatene av internalise assay var lik de med 12A8 i vårt tidligere studium [18].
(A) Cellebindingsanalysen for [
111In] 12A8 (fylte sirkler) og [
111In ] 67A2 (åpne sirkler). (B) Konkurranse hemming analysen for [
111In] 12A8 (lukkede sirkler) og [
111In] 67A2 (åpne sirkler). Intern analyse for [
111In] 67A2 (C) og [
125I] 67A2 (D). Endring i% av total radioaktivitet for hver fraksjon er plottet mot inkubasjonstid ved 37 ° C (lukkede sirkler, internalisert fraksjon; åpne sirkler, membran-bundet fraksjon; lukkede trekanter, protein-bundet fraksjon i kulturmediet, kryssmerkene, ikke- proteinbundet fraksjon i kulturmediet).
Biofordeling av [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2
Langsiktige biofordelingsstudier eksperimenter [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 ble utført i nakne mus som bærer SY tumorer fra dager 1 til 10 etter injeksjon (tabell 1 og 2). [
111In] 12A8 akkumuleres i svulstceller ved 7,3 ± 1,3% ID /g på dag 1, og en toppverdi på 18,9 ± 2,9% ID /g ble oppnådd ved dag 4 (tabell 1). Den tumoropptak av [
111In] 67A2 var 15,7 ± 0,9% ID /g på dag 1, og en toppverdi på 31,5 ± 7,7% ID /g ble oppnådd ved dag 4 (tabell 2). AUC for [
111In] 67A2 var 1,7 ganger høyere enn for [
111In] 12A8. Opptaket av radiomerkede antistoffer i store organer var lav og nedsettes gradvis med tiden, lik den som er rapportert i tidligere studier for radioaktivt merkede IgG spesifikke for andre antigener [25], [26]. Den tumor-til-blod-forhold på [
111In] 12A8 og [
111In] 67A2 på dag 1 var 0,6 og 0,9, respektivt, og nådde toppverdier av 3,6 og 4,0, respektivt, ved dag 10.
dose absorberes av svulster ble estimert basert på AUC av hvert
111In-merket antistoff fra biofordelingsstudier data. Dosen absorbert av tumorer behandlet med 0,74, 1,85 og 3,7 MBq av [
90Y] 12A8 ble estimert til å være 4,2, 10,5 og 21,0 Gy, henholdsvis, og at av [
90Y] 67A2 var 7,2, 18,0 og 35,9 gy, respektivt. Den absorberte dosen til rød marg ble estimert fra våre biofordelingsstudier data til å være 0,5 mGy /MBq i en 70-kg henvisning mann for begge
90Y-merket antistoff.
radioimmunterapi
Etter [ ,,,0],
90Y] 12A8 behandling, tumorvolumet i alle grupper økes til dag 3 etter injeksjon, men deretter gikk ned i 3,7-MBq behandlingsgruppe og helt forsvunnet rundt 2 uker etter injeksjon (fig. 2A). Administrasjonen på 1,85 MBq av [
90Y] 12A8 også tumorveksten til rundt 2 uker etter injeksjon, men deretter tumorvolumer begynte å øke igjen (fig. 2A). I gruppene som ble behandlet med umerket IgG alene og 0,74 MBq av [
90Y] 12A8, observerte vi tumorvekstforsinkelse sammenlignet med den ubehandlede (PBS) gruppe (
P
0,05) (Fig. 2A). [
90Y] 67A2 behandling viste en høyere terapeutisk effekt sammenlignet med [
90Y] 12A8 på middels til høy dosenivåer. Administrasjonen på 1,85 og 3,7 MBq av [
90Y] 67A2 markert trykkes tumorvekst, og svulster helt forsvunnet rundt 2 uker etter injeksjon med unntak av et enkelt muse behandlet med 1,85 MBq av [
90Y] 67A2. Selv om vi har observert tumorvekstforsinkelse i behandlingsgruppen med 0,74 MBq av [
90Y] 67A2 sammenlignet med den ubehandlede (PBS) gruppe (
P
0,05), var det ingen signifikant forskjell i tumorvekst sammenlignet med umerket IgG behandlingsgruppen (fig. 2C). Den kroppsvekt av mus behandlet med [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2 midlertidig redusert med omtrent 15%, men begynte å øke i løpet av den første uken etter behandling (Fig. 2B og D), og alle mus tolerert RIT eksperimentet opp til dag 28 (siste dag observert).
Tumorvekst vekst~~POS=HEADCOMP kurven (A) og kroppsvekt (B) for mus behandlet med [
90Y] 12A8. Tumorvekst kurve (C) og kroppsvekt (D) for mus behandlet med [
90Y] 67A2 (lukkede sirkler, ubehandlet (PBS); åpne sirkler, umerket IgG alene, lukkede triangler, 0,74 MBq, åpne diamanter, 1,85 MBq ; svarte firkantene, 3,7 MBq)
Histologisk analyse
det ble observert Høyt antall mitotiske celler i H . E-farget deler av SY svulster fra den ubehandlede gruppen (PBS), reflekterer en høy aktivitet spredning (fig. 3A). Tumorsnitt oppnådd på dag 7 etter injeksjon av [
90Y] 12A8 avdekket områder av nekrose og fibrose som økte på en doseavhengig måte (fig. 3A). Nekrose og fibrose ble også observert i tumorer behandlet med 1,85 og 3,7 MBq av [
90Y] 67A2, men ikke med umerket IgG alene og 0,74 MBq av [
90Y] 67A2 (Fig. 3A). På TUNEL-fargede seksjoner ble apoptotiske celler sjelden observert i henhold til ubehandlede betingelser (Fig. 3A og B). I tumorer behandlet med [
90Y] 12A8, andelen av apoptotiske celler hadde en tendens til å øke med en økning i dosen av radioaktivitet (Fig. 3A og B). I kontrast i tumorer behandlet med [
90Y] 67A2, det samme nivået av apoptotiske celler ble observert for 0,74 til 3,7 MBq uten en doseavhengig økning (fig. 3A og B).
(A ) H E og TUNEL farget tumorsnitt en uke etter injeksjon av [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2. (B) Kvantifisering av apoptotiske celler i svulster behandlet med [
90Y] 12A8 (svarte striper) og [
90Y] 67A2 (hvite søyler). *
P
0,01 (Student
t
-test)
Diskusjoner
SCLC er en aggressiv svulst og 2-årig. overlevelse for pasienter med begrenset stadium og omfattende-trinns sykdommer er mellom 20 til 40% og 2-5%, henholdsvis [27], [28], [29]. Derfor blir ytterligere effektiv anticancerterapi kreves, spesielt for pasienter med omfattende stadium sykdommen. SCLC uttrykker høye nivåer av c-kit som muliggjør rask cellevekst og således er en viktig kandidat molekyl for diagnose og terapi i SCLC [30], [31], [32]. Vi har tidligere vist at høye nivåer av anti-c-kit antistoff [
111In] 12A8 akkumulert i c-kit-uttrykkende tumorer, men ikke i normale organer [17], [18]. Siden SCLC er følsom for stråling, RIT ved hjelp av 12A8 merket med cytotoksiske radionuklider så som
90Y eller
131I har potensiale til å være en mer effektiv behandling av SCLC enn de nåværende behandlinger. I denne studien benyttet vi et ekstra antistoff 67A2 som har en høyere affinitet for c-kit sammenlignet med 12A8, og evaluert den terapeutiske effekten av
90Y-merket 12A8 og 67A2 i en SCLC musemodell.
In vitro
karakterisering av
111In-merket 12A8 og 67A2 vist at [
111In] 67A2 hadde fire ganger høyere binding affinitet enn [
111In] 12A8, som forventet. Selv om den epitop som gjenkjennes av 67A2 er forskjellig fra den til 12A8, internalisering analysen viste at 67A2 ble raskt internalisert etter binding til c-kit lik den som ses for 12A8 [17]. Som rapportert for 12A8, etter c-kit bindende og internalisering, ble radiomerket 67A2 metabolisert og
125I aktivitet ble fjernet fra cellene, mens
111In aktivitet forble, indikerer metall radionuklider er egnet for imaging (
111In) og terapi (
90Y) bruker 67A2 å målrette kreftceller.
for å fastslå om antistoffene kan brukes for RIT av c-kit-uttrykke svulster, vurderte vi det langsiktige biodistribusjon av
111In-merkede antistoffer, hvorfra tumoren absorberte dosen ble beregnet for
90Y-merket tilsvarende antistoffer. [
111In] 67A2, har fire ganger høyere binding affinitet enn [
111In] 12A8, viste en høyere tumoropptak ved hvert tidspunkt studert. AUC for svulst tid aktivitet kurven var 1,7 ganger større for [
111In] 67A2 enn for [
111In] 12A8, viser en høyere svulst absorbert dose med [
90Y] 67A2.
Neste , merket vi begge antistoffer med
90Y og utført eksperimentell RIT i mus med SY svulster. Administrasjon av 3,7 MBq av [
90Y] 12A8 eller 1,85 og 3,7 MBq av [
90Y] 67A2 nesten helt redusert tumorvekst. Sammenligning av absorbert dose beregning indikerte at svulster som fikk en absorbert dose som er større enn 18 Gy oppnådde en komplett respons i SY svulster. RIT ble tolerert hos mus, hvor det utvikles transiente vekttap. Disse funnene tyder på at
90Y-merket antistoffer har potensial til å levere en dødelig dose av strålebehandling til c-kit-uttrykke SCLC. Den dosebegrensende organ for RIT med IgG er vanligvis den røde margen, og vurdering av den absorberte dosen til den røde margen er viktig for å bestemme den terapeutiske stråledose hos pasienter [33]. I denne studien, den absorberte dosen beregnes ut fra vår biodistribusjon data var 0,5 mGy /MBq i en 70-kg henvisning mann for begge
90Y-merket antistoff, ≤2 Gy er ofte anses å være en trygg stråledose [33] Dette indikerer at den beregnede maksimale terapeutiske dose er 4 GBq. Men Tolvanen
et al
. rapportert at det var avvik mellom de absorberte doser beregnet fra verdighet og menneske avledet data [23]. I tillegg til de anti-c-kit antistoff 12A8 og 67A2 binder seg til menneskelig c-kit, men ikke murine c-kit. Derfor trenger vi en fremtidig klinisk studie med
111In-merket 12A8 og 67A2 hos pasienter å anslå nøyaktig dosimetri. 38% til 78% av SCLC prøver og 42% til 52% av SCLC-cellelinjer har høy ekspresjon av c-kit [30], [34]; derfor kan mer enn ca 40% av SCLC pasienter potensielt ha nytte av c-kit målrettet radioimmunterapi. Dette bør videre validert i fremtidige kliniske studier.
Interessant, [
90Y] 12A8 undertrykket tumorvekst i en doseavhengig måte, mens [
90Y] 67A2 oppførte seg som om det kreves en terskel dose for å være effektive. Ingen signifikant forskjell i tumorvekst ble funnet mellom umerket IgG alene og 0,74 MBq [
90Y] 67A2 behandlingsgruppene, selv om 0,74 MBq [
90Y] 67A2 ga en svulst absorbert dose på 7,2 Gy, som var 1,7 ganger høyere enn i 0,74 MBq [
90Y] 12A8. Histologisk analyse viste at arealet av nekrose og fibrose reflekterte RIT virkning. I motsetning til dette mønster induksjon av apoptose var forskjellig mellom de to
90Y-merkede antistoffer. Selv om det ikke klart hvorvidt forskjellen i apoptose-induksjon er relatert til det annet mønster av RIT effekt, kan forskjellene i de biologiske egenskapene til de antistoffer har forårsaket dette avviket. Ifølge produsentens informasjon, har 12A8 en sterk nøytralisering aktivitet og mild anti-tumor aktivitet, mens 67A2 har ingen av delene, og begge antistoffene ikke har ADCC og CDC aktiviteter. Selv om det ikke er noe direkte bevis på at c-kit er involvert i apoptose vei, c-kit knockdown ved hjelp av korte hårnål RNA-indusert apoptose i brystkreftceller [35] og c-kit tømming av nøytraliserende antistoff resulterte i sterkt økt apoptose i differensierende spermatogoniene hos mus [36]. Disse funnene øke muligheten for at kombin c-kit uttømming med strålebehandling kan indusere synergistiske effekter, noe som resulterer i undertrykkelse av tumorvekst ved anvendelse av en lav dose av [
90Y] 12A8 til tross for sin lavere absorberte dosen sammenlignet med [
90Y] 67A2 . Som pasienter generelt får høye doser i radikal RIT, våre funn tyder på at høy affinitet er en svært viktig egenskap for antistoff som brukes i RIT i en klinisk setting, selv om vi ikke kan utelukke at andre egenskaper kan påvirke RIT effekt. Det ville være interessant å vurdere muligheten for at terapeutiske virkninger kan forsterkes ved andre biologisk karakter (er) av antistoffet i fremtidige studier.
Selv RIT har potensial for å forsterke effekten av antistoffterapi i mange typer av svulster, i klinisk bruk radioimmunterapi hittil har vært effektive bare for hematologiske maligniteter, men ikke for ikke-hematologiske maligniteter [19], [37], [38]. Siden det er vanskelig for antistoffer til å trenge inn i hele solide svulster, kan radiomerkede antistoffer ikke levere en dødelig dose for alle tumorcellene i en fast tumor. Men siden radiomerkede antistoffer kan levere systemisk cytotoksiske radionuklider til kreft nettsteder, RIT for solide svulster er generelt ansett egnet til å behandle små store metastatiske svulster (mindre enn flere cm i diameter), men ikke klumpete primære svulster (flere enn flere cm i diameter) . I denne forbindelse, SCLC, som har en høy risiko for omfattende metastaser, men som er forholdsvis radiosensitive, kan være en god kandidat for RIT. Selv om pasienter med omfattende-scenen SCLC tradisjonelt ikke har fått strålebehandling, Slotman
et al
. rapporterte at profylaktisk kranial bestråling hos pasienter med omfattende trinns SCLC resulterte i en betydelig reduksjon av hjernemetastaser forekomst og forbedring av overlevelse [39]. Derfor [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2 kan være effektive for behandling av metastatisk kreft celler i fjerne områder og kan ha potensial til å redusere forekomsten av metastaser i tillegg hjernen i SCLC, spesielt under den omfattende stadium av sykdommen.
Konklusjon
Vi har evaluert to radiomerket anti-c-kit antistoff 12A8 og 67A2 for deres mulige søknad om RIT av SCLC. Affiniteten av [
111In] 67A2 var fire ganger høyere enn for [
111In] 12A8, og tumoropptak av [
111In] 67A2 var 1,7 ganger høyere enn for [
111In] 12A8 . På midten av høye doser av
90Y-merket antistoffer, tumorkontroll reflekterte ganske enkelt svulst absorbert dose, hvor en svulst absorbert dose som er større enn 18 Gy kan indusere nesten komplett tilbakegang av SCLC xenograft. Dette tyder på at SCLC kan være et godt mål på RIT med
90Y-merket anti-c-kit antistoffer. [
90Y] 12A8 og [
90Y] 67A2 er lovende RIT agenter for omfattende-scenen SCLC.
Takk
Vi takker Maki Okada for tekniske råd og nyttige forslag på dosimetri .
