Abstract
Co-kultur modellene er å bygge bro over gapet mellom klassiske kulturer og
in vivo
dyremodeller. Utforsker denne romanen tilnærmingen låser muligheten for å etterligne svulsten mikromiljøet
in vitro
, gjennom etablering av kreft-stroma synergis interaksjoner. Spesielt disse organotypiske modellene har en perfekt plattform for utvikling og pre-klinisk evaluering av kandidat nanocarriers lastet med anti-tumor narkotika i en høy gjennomstrømning screening-modus, med lavere kostnader og fravær av etiske problemstillinger. Men denne evalueringen var til nå begrenset til co-kultur som er etablert med presise celleforhold, ikke ta opp den naturlige celle heterogenitet som vanligvis finnes i ulike svulster. Derfor heri det multifunksjonelle nanocarriers effektivitet ble karakterisert ved forskjellige fibroblast-MCF-7 ko-kultur-systemer inneholdende forskjellige celleforhold, for å løse viktige konstruksjonsparametere som påvirker nanocarrier ytelse og det terapeutiske resultat. Den vellykkede etablering av ko-kulturmodeller ble bekreftet av vev-lignende fordeling av de forskjellige celler i kultur. Nanopartikler inkubering i de forskjellige ko-kultursystemer viser at disse nanocarriers besitter målretting spesifisitet for kreftceller, noe som indikerer de er egnet til å bli brukt i denne sykdommen terapi. I tillegg, ved bruk av forskjellige ko-kulturforhold, ble forskjellige nanopartikkel opptaksprofiler erholdt. Disse funnene er av avgjørende betydning for den fremtidige utformingen og optimalisering av nye stoffet leveringssystemer, siden deres virkelige målretting kapasitet må rettes i heterogene cellepopulasjoner, slik som de som finnes i svulster
Citation. Costa EC, Gaspar VM, Marques JG, Coutinho P, Correia IJ (2013) Evaluering av partikler Opptak i Co-kultur Kreft Models. PLoS ONE 8 (7): e70072. doi: 10,1371 /journal.pone.0070072
Redaktør: Michiya Matsusaki, Osaka University, Japan
mottatt: 25 januar 2013; Godkjent: 15 juni 2013; Publisert: 26.07.2013
Copyright: © 2013 Costa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT), SFRH /BD /80402/2011, PTDC /EME-TME /103375/2008, PTDC /EBB-BIO /114320/2009 og Pest-OE /EGE /UI4056 /2011. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i det siste tiåret den nye utviklingen av nanomedisin har oppmuntret sin raske program i utviklingen av en rekke strategier for å behandle svekker sykdommer, som fortsatt er uhelbredelig [1]. Foreløpig har de enorme teknologiske fremskritt oppnådd innen design og produksjon av nanoparticulated systemer for kreftbehandling oppsto utfallet av all evighet dyktige og målet spesifikke nanocarriers, som reduserer bivirkninger forbundet med klassiske anti-kreft terapi og også øke overlevelsesfrekvens [ ,,,0],2]. Ofte består av biokompatible uorganiske eller organiske materialer, nanocarriers er også i stand til å øke biofordeling og biotilgjengelighet av medikamenter, som ellers ville være dårlig tilgjengelige ved deres målse [3]. Den fleksible natur av nanopartikler er nært korrelert med de forskjellige materialer som brukes for deres syntese, så som metaller (sølv og gull), keramikk (hydroksyapatitt), lipider (kolesterol og ikke-toksiske, fosfolipider) og polymerer (alginat, kitosan, PEG,) [4]. Blant disse, er kitosan har vært et av de mest utstrakt anvendt for syntese av en rekke nanoparticulated medikamentleveringssystemer, på grunn av sin unike egenskaper som bioforenlighet, stabilitet, enkel å bli kjemisk modifisert og lav immunogenisitet [5]. Disse unike egenskaper kan videre skreddersys ved funksjonalisering av partikkel-overflaten med celle-spesifikke molekyler slik som antistoffer, folsyre, biotin, eller aptamerer [6], [7], som i betydelig grad øker nanocarrier spesifisitet mot målceller, beskytter normale celler mot medikament avledede giftige bivirkninger [8].
Likevel, før den mengde nanodevices for tiden under etterforskning bli egnet for klinisk bruk, må de overgå strenge tester fastsatt av offentlige instanser som Food and Drug Administration (FDA ) og European Medicines Agency (EMEA). Inkludert i de forskjellige evalueringstrinn som nanocarriers må overvinne, biologisk sikkerhet og aktivitetsanalyser anta kritisk betydning i nanopartikkel rørledning utvikling [9], [10].
Særlig for disse testformål, oppstår cellekulturer som en eksepsjonelt kraftig og økonomisk verktøy, i forhold til
in vivo
modeller. Faktisk, de tilbyr en unik test plattform for å undersøke effektene av ulike narkotika formuleringer og nanopartikkel design under svært kontrollerte og reproduserbare forhold [11]. Videre cellekulturer gir en enkel måte å manipulere en rekke eksperimentelle variabler for å gjengi noen av de
in vivo
forhold, mens unngå etiske og juridiske problemstillinger knyttet til dyr behandling [12]. Men til nå den romlige organiseringen av vev og celle-celle interaksjoner ble ofte ignorert i de fleste av de tilgjengelige
in vitro
modeller [12]. For å overvinne slike begrensninger en ny kategori av cellekulturer, kalles co-kulturer, er for tiden under utvikling [13]. Dette nye konseptet er designet med det formål å dekke manglende samsvar mellom klassisk cellekulturer og
in vivo
systemer (Figur 1) [12]. Ved hjelp av ko-kulturer, er det mulig å gjenskape noen av de
in vivo
vev nisjer [14], siden celle-celle interaksjoner er etablert i nær kontakt. Denne kritiske parameter er viktig for etablering av cellemorfologi, fenotype, metabolisme og proliferasjon, funksjoner som er til stede
in vivo product: [15], [16], [17], [18]. I tillegg co-kulturer er også et perfekt verktøy for å analysere målretting spesifisitet av stoffet leveringssystemer for tumorceller [19].
Cellekulturer er i stand til å etterligne
in vivo
vev uten de etiske og pris problemer forbundet med dyreforsøk.
for tiden er en av de mest undersøkte malignitet [13] brystkreft. Denne sykdommen er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos kvinner over hele verden [20], [21]. Brystkreft mikromiljøet består ikke bare av kreftcellene, men også av fibroblaster, adipocytter, blodkapillærer, endotelceller, immunsystemceller og ekstracellulære matriks (ECM) proteiner [13], som kollagen og elastin. Til tross for å bli akseptert at kreft kan vanligvis oppstå fra genetiske mutasjoner [22], vekst, invasjon og metastasering er ikke bare avhengig av disse mutagene hendelser. Egentlig er det anerkjent at alle cellene som er tilstede i tumoren mikromiljøet virker synergistisk for å fremme tumor proliferasjon og sprer [23], [24]. Videre har det nylig blitt rapportert av Straussman et al., 2012, er at stromale celler rekruttert av kreftceller til å be tumor Resistens og spredning [25].
Nylig, flere kreftbehandlingen som er rettet mot også fibroblaster har vist seg å hindre denne sykdommen progresjon [26]. Disse spesielle celler er beskrevet som å ha en avgjørende rolle i tumoren nisje [27], med heterogene populasjoner og forskjellig relativ sammensetning som forekommer i mange tumorer [26]. Disse celler er involvert i metabolismen av ECM, ved å fremme integrin signalering [28], [29]. Fibroblaster også skiller ut og samhandle med flere vekstfaktorer [25], [29], som hepatocytt-vekstfaktor (HGF), fibroblast vekstfaktor (FGF), insulinlignende vekstfaktor (IGF) og epitelial vekstfaktor (EGF), som befinner ansvarlig for aktivering av mekanismer som bidrar til apoptoseresistens [30], [31], og fremmer proliferasjon av maligne celler [32]. Alle disse skadelige egenskaper, har tiltrukket seg oppmerksomhet forskere for å utvikle ko-kulturer som inkluderer disse celletyper i et forsøk på å etterligne selve svulsten mikromiljøet [19], [33].
Fra dette stå punkt, den foreliggende studien karakteriserer cellen opptaket av funksjon nanocarriers i co-kultur-modeller, for å ivareta deres selektivitet og biologisk aktivitet til kreftceller.
Materialer og metoder
Material
østrogen- avhengig human bryst adenocarcinoma (MCF-7) ble erholdt fra ATCC (Middlesex, UK) og primære normale humane dermale fibroblaster (hFIB) fra Promocell (Heidelberg, Tyskland). Cellekultur T-kolber ble hentet fra Orange Scientific (Braine-l’Alleud, Belgia). Cell bildebehandling plater ble kjøpt fra Ibidi GmbH (Ibidi, München, Tyskland). Rhodamine B isothiocianate (RITC), Trypsin, cellekultur Dulbeccos modifiserte Eagles Medium F-12 (DMEM-F12), kollagen type I, L-histidin, L-arginin,
N
– hydroksysuccinimid (NHS),
N Anmeldelser – (3-Dimethylaminopropyl) –
N
etylkarbodiimidhydroklorid (EDC) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sintra, Portugal). Hoescht 33342® og CellLight 2.0® BacMam ble levert av Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ultra kitosan hydroklorid (CH) (Protasan UP CL 113) ble hentet fra Novamatrix (Sandvika, Norge). Føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Biochrom AG (Berlin, Tyskland). (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre) ble innkjøpt fra Tokyo Chemical Industry (TCI) (Tokyo, Japan). Alle andre reagenser ble brukt uten ytterligere rensing.
Co-kultur Modeller
For å etablere ulike samarbeidskultur modeller MCF-7 og hFIB cellene ble dyrket i 75 cm
2 celle T- kolber med DMEM-F12-medium supplert med 10% (v /v) FBS, og 1% streptomycin og gentamycin. Alle celler ble inkubert ved 37 ° C, i en fuktig atmosfære med 5% CO
2. Ved å oppnå samløpet ble begge cellene høstet ved hjelp av 0,18% trypsin og 5 mM EDTA for å få to enkle cellesuspensjoner. Celler ble farget med trypanblått 4% og tellet ved å benytte et hemocytometer. Deretter ble ko-kulturer sådd med 1:01, 1:03, 1:05 og 3:01 MCF-7 til hFIB forhold, på 6-brønners plater, med et totalt antall på 2 x 10
4 celle per brønn. Kontrollhomotypisk kulturer av hFIB og MCF-7-celler ble sådd ut ved hjelp av det samme totale antall celler per brønn i separate brønner. Ko-kulturer og homotypisk kulturene ble opprettholdt i DMEM-F12 komplett medium gjennom alle forsøk. Utviklingen av co-kulturer i form av cellefordeling og morfologi ble analysert ved hjelp av et Olympus CX41 optisk mikroskop utstyrt med et Olympus SP-500 UZ digitalkamera.
Syntese og karakterisering av Chitosan-histidin-Arginine
for syntesen av det multifunksjonelle polymeren, CH ble kjemisk modifisert med arginin (R) og histidin (H) gjennom EDC /NHS koblingen [34], [35]. For dette formål ble chitosan oppløst (10 mM TEMED /HCL-buffer, pH 6,0) til en konsentrasjon på 1% (w /v). Deretter NHS, EDC (0,6 mol: 1,5 mol) og L-Histidin (0,7 mol: 1,0 mol glukosamin) ble deretter tilsatt til kitosan løsning. Reaksjonen ble utført i løpet av 24 timer, ved romtemperatur. Den funksjonaliserte polymer ble deretter dialysert mot deionisert vann (MWCO 12 000 til 14 000 Da). Den rensede kitosan-H polymer ble deretter utvunnet ved frysetørking. CH-H polymerryggraden ble senere modifisert med L-arginin som tidligere nevnte, for å gi CH-HR.
Inkluderingen av aminosyrer i det kitosan ryggraden ble analysert ved proton-kjernemagnetisk resonans (
1 H NMR ) spektroskopi ved bruk av et Bruker Avance III 400 MHz spektrometer (Bruker Scientific Inc., NY, USA). Alle prøvene ble oppløst i 1 ml DMSO-d
6 gjennom omfattende sonikering og
1 H-spektra ble oppsamlet med en gradient basert puls program (zgesgp, Bruker) ved 298 K ved anvendelse av en spektral vindu av 9 kHz . NMR-spektra ble behandlet og analysert med toppspin 3.1 programvare (Bruker Scientific Inc., N.Y., USA). I tillegg ble aminosyren koplingen også verifisert ved den dempede totalrellektans-Fourier Transform infrarødt spektroskopi (ATR-FTIR) (protokoll S1 i File S1 og fig S1). Den samlede substitusjonsgrad av den opprinnelige CH polymerryggraden ble bestemt ved ATR-FTIR, som tidligere beskrevet elsewere [36] (gjennomsnitt ± s.d .: 43,84 ± 6,67%;
n
= 3). I tillegg ble graden av substitusjon også bestemt ved NMR-analyse ved integrering av histidin (δ = 8,1 ppm), arginin (δ = 7,41 ppm) og chitosan (δ = 1,3 ppm) karakteristiske topper (Histidin forhold = 1,14; Arginin ratio = 0,39).
partikler Formulering og fysiokjemiske Karakterisering
for å sikre eksistensen av genetisk materiale for innkapsling inn nanocarriers ble pVAX1-LacZ plasmid utgangspunktet forsterkes i rekombinante bakterier og utvinnes som tidligere rapportert [37]. I korthet, for formulering av kitosan-histidin-arginin /pDNA (CH-H-R /pDNA) nanopartikler, ble polymeren oppløst i acetat-buffer (pH 4,5) ved den ønskede konsentrasjon. Alle amino CH-H-R-nanopartikler ble formulert ved et tidligere optimalisert for amin til fosfat-forholdet (N: P forhold = 60). Nanopartiklene ble syntetisert ved tilsetning pDNA til polymerløsningen ved 1:04 (v /v). Blandingen ble deretter kraftig blandet i 1 min. Etterpå ble kompleksene stabilisert ved romtemperatur og gjenvunnet ved sentrifugering ved 18 000 g i 30 min.
partikler størrelse og zeta-potensialet ble bestemt ved hjelp av et Zetasizer Nano Zs instrument (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) som vår gruppe tidligere beskrevet [37]. Alle forsøkene ble utført ved 25 ° C, med utbyttbare foldede kapillære celler, i automatisk modus. Dataene ble prosessert i Zetasizer programvare (v 6.2). I tillegg ble nanopartikkel zeta-potensialet også vist i en rekke forskjellige pH-verdier (5,0 til 7,4), for å ta opp ytterligere pH-responsive virkemåten av dette system under forskjellige betingelser. PH screening ble utført ved resuspendering av nanopartikler i buffere med en passende bufferkapasitet (acetat-buffer, 10 mM, pH 5,0; sitratbuffer 10 mM, pH 6,0 og pH 6,5, HEPES-buffer 10 mM, pH 7,0 og pH 7,4). Alle bufferne ble tidligere filtrert gjennom et 0,22 um filter.
De fremstilte nanopartikler ble også analysert ved scanning-elektronmikroskopi (SEM). Før SEM-analyse ble de nanopartikkel prøvene farvet med 0,1% fosfowolframsyre og sonikert. Etterpå nanopartikkelsuspensjonen ble dispergert i aluminium stubber, og frese belagt med gull etter tørking ved romtemperatur. Nanopartikkel Prøvene ble deretter visualisert på en Hitachi S-2700 (Tokyo, Japan) elektronmikroskop konfigurert med optimale innstillinger for bilde nano-størrelse materialer.
In vitro
partikler Cell Opptak
in vitro
nanopartikkel opptak i de ulike co-kultur-systemer (01:01, 01:03, 01:05, 03:01) ble analysert ved konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). For å skille hFIB celler fra MCF-7, sistnevnte ble merket med CellLight 2.0® BacMam Actin-grønn fluorescerende protein (GFP) sonde ved å følge produsentens protokoll. Før celle såing, imaging platene var overflaten belagt med kollagen I, i 30 minutter, som anbefalt av produsentene. Etter utbruddet av GFP uttrykk, ulike MCF-7 /GFP til hFIB forholdstall var sub-dyrket på åtte vel μ-Slide Ibidi plater med en tetthet på 2 × 10
4 celler per brønn. Cellene ble dyrket i DMEM-F12-medium supplert med 10% (v /v) FBS, ved 37 ° C i humified atmosfære med 5% CO
2. Etter den første dag av co-kulturen, ble cellene inkubert med CH-H-R-nanopartikler ladet med RITC-merket pDNA (1 pg /cm
2) i 4 timer [38]. Nanopartiklene ble også inkubert i monokulturer av hFIB, MCF-7 og Actin-GFP MCF-7-celler. I tillegg ble MCF-7 celler farget med GFP og inkuberes med nakne RITC-pDNA anvendt som kontroller (figur S2). Etter en 4-timers inkubasjonsperiode ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 min, vasket grundig med PBS og farget med Hoechst 33342® nukleær sonde ved romtemperatur. Celle bildebehandling ble utført på en Zeiss LSM 710 laserskanning confocal mikroskop (Carl Zeiss SMT Inc., USA) ved hjelp av en Plan-Apochromat 40 × /1,4 Oil DIC objektiv. Bildene av prøvene ble anskaffet i z-stack modus med en skive tykkelse på 0,23 mikrometer. Ortogonale seksjonering og 3D rekonstruksjon av de ulike z-stabler ble utført på Zeiss LSM Zen programvare (2010).
flowcytometrisystemer Analyse av partikler Opptak
Effekten av ulike co-kultur forholdstall på omfanget og spesifisiteten av nanopartikkelopptaket ble analysert ved flowcytometri ved anvendelse av en BD FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson Inc., USA). I korthet, for opptakseksperimenter, ble ko-kulturer utsådd i 6 brønners kulturplater med totalt 2 x 10
5 celler per brønn. Cellene ble dyrket i 24 timer i DMEM-F12-10% FBS før alle forsøk. I tillegg ble ko-kulturer og monokulturer av hFIB og MCF-7 ble brukt som kontroller for å etablere de korrekte port og innhentingsparametere i FL-1 (530/30 nm (GFP)) og FL-2 (585/42 nm ( RITC)) kanaler (Figur S3). For analyse av nanopartikkel-opptaket i de forskjellige ko-kulturer CH-H-R-nanopartikler ble fremstilt med ferske merket RITC-pDNA (1 pg /cm
2) og inkubert med celler i 4 timer. Etterpå ble cellene grundig skylt med iskald PBS og høstet med 0,18% trypsin /5 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre). For strømningscytometri-analyse ble cellene resuspendend i 600 ul av frisk PBS. Datainnsamlingen ble gjennomført i Cellquest ™ Pro den der 8 × 10
3 hendelser ble registrert i gated regioner av interesse tildelt hFIB og MCF-7 celler. Flowcytometri data ble analysert i prøveversjon av FCS uttrykkelig v.4 forskning utgave programvare (De Novo Software, Ontario, Canada). For beregning av celleprosent et inngjerdet område som strekker seg fra 10
1 til 10
4 ble brukt. Denne regionen er avgrenset av en markør i histogrammene og tilsvarer R2 kvadrant i dot plots. Alle histogrammer av ubehandlede kontroller ble trukket til histogrammer oppnådd for forskjellige forhold.
Resultater
Co-kulturer av MCF-7 og hFIB
I utgangspunktet annerledes brystkreft ko-kulturmodeller ble etablert ved bruk av forskjellige celleforhold som tidligere har vært beskrevet i litteraturen som å være beskrivende for
in vivo
-mimicking tilstander, nemlig, 1:01; 01:03; 01:05; 03:01, MCF-7 til hFIB celler [19], [39], [40], [41], [42]. Utviklingen av de etablerte samarbeidskultur modeller er presentert i figur 2.
Co-kulturer av MCF-7 til hFIB av ratio: 01:01 (A1-A5), 01:03 (B1-B5) , 01:05 (C1-C5), og 03:01 (D1-D5). Monokulturer av MCF-7 (E1-E5) og hFIB (F1-F5) ble brukt som kontroller. Opprinnelig forstørrelse 100 x.
Gjennom analysen på figur 2, er det klart synlig at cellene er vedheftende og kan forbli i ko-kultur i flere dager uten løsgjøring eller unormal celledød. Interessant, i ko-kulturer som ble etablert med flere fibroblaster enn brystcancerceller (figur 2 B1-B5 og C1-C5), MCF-7-celler utviklet en svak tendens til å danne agglomerater som er omgitt av fibroblaster. Dette tettbebyggelse er spesielt tydelig etter 8 dager med co-kultur (figur 3), og det er forbundet med fenotypiske egenskaper av brystkreft celler som er organisert i acinar strukturer [43].
Co-kulturer av MCF- 7 og hFIB 01:01 (A, B) og 01:05 (C, D). Original forstørrelse 100 ×.
Syntese og karakterisering av CH-H-R Multifunksjonell Polymers
Tillegg av aminosyreresidier til kitosan ryggrad ble bekreftet av
1 H NMR-spektroskopi. Resultatene i figur 4 a og b viser tilstedeværelsen av ytterligere proton topper ved δ≈1.5 ppm (-CH
2-, L-arginin og L-histidin, nummer 1) og δ≈2.8-3.0 ppm (-CH
2NH-, L-arginin, nummer 2) i sammenligning med spektrene av chitosan alene. De signaler som svarer til C
3-C
6 karboner av chitosan er maskert av løsningsmiddeltopper. Den kitosan anomere karbonsignaler blir oppnådd mellom δ≈4.6-4.9 (nummer 7 og 7 *) [44]. Proton signalet ved δ≈1.9 ppm (nummer 6) tilsvarer -CH
3 grupper knyttet til de acetamido delene av kitosan [44]. Eksistensen av den karakteristiske proton toppen δ≈7.41 ppm (-NHCH = NHNH
2, nummer 3) er tilordnet guanidin funksjonell gruppe [45] er tilstede i L-arginin antyder vellykket inkludering av denne aminosyre. I tillegg er utseendet av karakteristiske proton toppene av L-histidin imidazolring δ≈8.0-8.5 ppm (-N = CH-NH-, nummer 5) indikerer også inkludering i kitosan polymeren. Histidin presenterer også protontopper ved δ≈7.1-7.2 ppm som svarer til den H2 hydrogen (HN-CH-C, nummer 4) i imidazolringen. Disse resultatene er i overensstemmelse med dem som ble oppnådd ved ATR-FTIR-analyse (figur S2).
1H NMR-spektra av umodifisert CH (A) og CH-H-R (B og D). Zeta potensial (C) og SEM analyse (D) CH-HR /pDNA nanopartikler, henholdsvis.
partikler Formulering og fysiokjemiske Karakterisering
syntese av CH-HR /pDNA nanopartikler ble fremmet av etablering av attraktive elektrostatiske krefter mellom positivt ladet polymer ryggrad og de negativt ladede pDNA biomolekyler. Nanopartikkel størrelse karakterisering ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) viste at nanodevices fremstilt ved denne prosess, har sub-cellulær størrelse i nanoområdet (figur 4C), en verdifull egenskap hvis terapeutiske anvendelser er forutsett. SEM-analyse viste også at partiklene utgjør en sfærisk-lignende morfologi (figur 4D). I tillegg er analysen av zeta-potensialet viste at overflateladningen av nanopartiklene er meget positiv og i området for partikkelstabilitet,
det vil si., Etter noen partikkelaggregering ble observert (figur 4 C og D). Modifikasjonen av zeta potensialet i nanopartikler med miljø pH ble også undersøkt for ytterligere å støtte kjøp av en pH responsive atferd når aminosyren delene ble podet inn i mors kitosan (figur 5). De oppnådde resultater viser at nanopartiklene har en høy positiv ladning i området fra lysosomale pH (pH 5,0 6.0). Interessant, ved høyere pH, overflateladningen av nanopartikler reduseres, som illustrerer deprotonering av de primære aminer med kitosan og av den positivt ladede imidazolgruppen i histidin (figur 5).
Skjematisk fremstilling av zeta potensialet reduseres så en funksjon av pH. Data presentert som gjennomsnitt ± SD
Effekt av Cell Ratio på effektiviteten av partikler Cellular Opptak
Etter å ha bekreftet vellykket syntese av nanoparticulated systemer og at MCF-7-hFIB celler holdt seg stabil i co-kultur, ulike celle forhold ble deretter etablert i co-kultur med det formål å gi en plattform for å vurdere celle opptak hendelsene i et multifunksjonelt nanopartikkel-system består av CH-HR og pDNA. Cellulært opptak av nanopartiklene ble innledningsvis karakterisert ved konfokal mikroskopi for å evaluere deres celle internalise kapasitet. Analysen av 3D-rekonstruksjon av ko-kulturmodeller viser at nanocarriers er i stor utstrekning til stede i cytoplasma (figur 6 A). De pDNA belastede nanopartikler er også lokalisert til cellekjernen som vist i ortogonale skiver (figur 6 B, B1, B2, hvite piler) og kjernefysiske seksjoner (figur 6 C, hvite piler). Dessuten, en colocalization analyse ble også utført for å ytterligere underbygge disse funnene. Som vist i figur 6 D (colocalization kanal – grå farge) er det en synlig colocalization mellom de RITC-merkede nanocarriers og i det intracellulære rommet (lilla pil). I tillegg er den kjernefysiske colocalization illustrerer også eksistensen av nanocarriers i kjernerommet.
Konfokalmikroskopi bilder av MCF-7 brystkreftceller etter fire timers inkubering med nanocarriers (A, B), ortogonal seksjonering i xy aksen (B1, B2), 3D-rekonstruksjon av cellekjernen (C). Colocalization av røde og grønne kanaler (D). Colocalization av de røde og blå kanal. Red kanal – RITC merket pDNA /CH-H-R; Grønne kanalen – Actin-GFP farging av MCF-7 Blå Channel – Hoechst 33342® atom farging. Grey kanaler. Colocalization analyse
Nanodevice målretting kapasitet ble også vurdert i de ulike samarbeidskultur modeller av konfokalmikroskopi og flowcytometri ved å merke den pDNA stede i nanopartikler med RITC og også kreftceller med en GFP aktin sonde. Gjennom denne tilnærmingen var vi i stand til å skille nanopartikkel opptak i begge celletyper (figur 7). Analyse av forskjellige CLSM bilder, ser vi at for de forskjellige ko-kultur-forhold, er det nanopartikkel internalise markert høyere i MCF-7-celler i sammenligning med hFIB (figur 7). Faktisk, strømningscytometri-analyse bekrefter observasjoner av CLSM bilder. Figur 8 viser at CH-R-H /pDNA nanopartikler gå inn fortrinnsvis i MCF-7 kreftceller, på bekostning av hFIB, for alle ko-kultur-forhold. Dette funnet understreker en mulig selektivitet av dette systemet mot ondartede celler i heterogene microenvironments. Videre nanopartikkel opptakseksperimenter i monocultured MCF-7 celler og hFIB tyder på at nanocarriers er mer internalisert i ondartede celler enn i normale celler (figur S4), videre vekt på resultater oppnådd for co-kultur eksperimenter.
ko-kulturer av MCF-7 til hFIB i forhold av: 01:01 (A-C), 01:03 (D-F), 01:05 (G-i) og 03:07 (J-L) etter 4 timers inkubering med nanopartikler. Red kanal – RitC-merket pDNA /CH-H-R nanopartikler; Grønne kanalen – Actin-GFP farging av MCF-7; Blå Channel – Hoechst 33342® nukleær farging; Grey Channel: DIC; Sammenslåtte -. Superimposition av alle kanaler
Representative prikkplotter av nanopartikkel opptak i de ulike co-kultur forhold (A-D). R2 kvadrant ble brukt som en port for histogram analyse. Representative histogrammer av nanopartikkel-opptak i MCF-7-celler (E-H) og hFIB (I-L) populasjoner med forskjellige ko-kulturforhold etter fire timers inkubering med RITC-merkede pDNA /CH-HR nanopartikler.
diskusjon
for tiden, har nødvendigheten for å forbedre effektiviteten av anti-kreft terapeutiske midler til utviklingen av dyktige nanoskala leveringssystemer som er i stand til å redusere lokaliserte og systemiske bivirkningene av konvensjonelle kjemoterapeutika [8]. Disse nanodevices har et sett med unike egenskaper som forbedrer farmakokinetiske og farmakodynamiske profilen av bioaktive molekyler, noe som øker deres biotilgjengelighet på målse [6]. Egentlig, på grunn av sin allsidighet, nanocarriers kan være konstruert for å selektivt gjenkjenne målrette kreftceller og unngå førstepassasjemetabolisme, fagocytose eller rask blodclearance, redusere sannsynligheten for off-target hendelser [3]. I tillegg, når lokalisert inne i cellerommet, nanocarriers beskytte lasten fra naturlig medikament-resistensmekanismer i tumorceller, slik som de som er avhengige av ABC-transportører, og også lede de terapeutiske molekyler til deres intracellulære mål [46]. Alle disse viktige egenskapene er svært avhengig av de ulike stadier av nanocarrier prosjektering og montering. Derfor er en skikkelig evaluering i løpet av nanopartikkel utviklingsprosessen avgjørende for sin vellykkede anvendelse
in vivo.
Faktisk evalueringen av nye leveringssystemer må være grundig utført for å hindre potensiell helse risiko og identifisere optimale egenskaper [9]. Generelt blir preklinisk evaluering av biologisk resultat av en nanodevice utføres både
in vitro
, ved hjelp av cellekulturer, og
in vivo,
med dyremodeller. Imidlertid har den nåværende etterspørselen for å redusere dyreforsøk på grunn av de tilhørende etiske og økonomiske spørsmål bedt om utvikling av alternative tilnærminger som cellekulturer. Men for å låse opp det fulle potensialet i cellekultur modeller og få mer naturtro resultater, har forskjellen mellom enkle cellekulturer og
in vivo
vev til å bli redusert. Derfor har utviklingen av nye modeller basert på co-kulturer frembragt muligheten til å etterligne tumorvev på en slik måte at den fysiologiske miljøet funnet
in vivo
kan replikeres
in vitro
. Testing nanocarrier kandidater i disse co-kulturer systemer, gir mer nøyaktige resultater, siden disse reprodusere tumorprogresjon, resistens og også celle-celle kommunikasjon [47]. Alle disse hendelsene til slutt påvirke biologiske resultatene av en gitt nanocarrier systemet og dets lastet bioaktive molekyler.
Derfor blir det verdifullt å karakterisere nanopartikkel cellulært opptak i co-kultur modeller for å vurdere sin målgruppe spesifisitet. Ikke desto mindre, ettersom virkningen av nanopartikler kan endres i henhold til egenskapene til tumor microenvironments, evaluere forskjellige betingelser er et viktig krav i pre-klinisk utvikling. Gjennom denne analysen virkningen av funksjonalisnanopartikler mot maligne celler kan deretter bli innstilt avhengig av tumor nisje og dets omkringliggende normale celler. For det, blir det viktig å utvikle ulike samarbeidskultur modeller som reproduserer dynamiske miljøer. Dermed ble her kitosan funksjonnanopartikler testet i co-kulturer med ulike maligne til normal celle forholdstall. For å utføre disse analysene, ble ulike prosenter av hFIB og brystkreftceller (MCF-7) brukes. Disse modellene ble etablert ved å ta hensyn til tidligere rapporter, hvor disse spesielle celleforhold ble anvendt for å etterligne kreft miljøer [19], [39], [40], [41], [42]. Figur 2 viser den høye formeringshastigheten av begge celletyper, med ingen unormal celledød, sammenlignet med sine motparter monokultur. Dessuten er resultatene vist i figur 2 bekrefter de gode interaksjoner mellom MCF-7 brystkreftceller og hFIB, og derfor vellykket etablering av disse ko-kulturmodeller.
Når det gjelder celle morfologi, de optiske bilder (Figur 2 ) viser at begge celletyper bevare deres fenotypiske trekk. Kreftceller opprettholdt sin epitelial morfologi, med en polygonal form [48], [49].
