Abstract
NEDD9, et samlings vedheft stillas protein, har nylig foreslått å regulere invasjon og metastasering i enkelte krefttyper, men ukjent i livmorhalskreft. Målet med denne studien var å finne ut om NEDD9 var involvert i progresjon og metastasering av livmorhalskreft. De eksperimentelle resultatene viste NEDD9 protein ble overuttrykt i livmorhalskreft sammenlignet med normal cervical epitel vev. Overekspresjon av NEDD9 var korrelert med histologisk gradering, lymfeknutemetastase, og FIGO stadium av livmorhalskreft. Dempe NEDD9 resulterte i tyrosin defosforylering av FAK og SRC teinene, og redusert celle migrasjon og invasjon i livmorhalskreft Siha og HeLa celler. Overekspresjon av NEDD9 førte til tyrosin-fosforylering av FAK og SRC oncoproteiner, og øket cellemigrering og invasjon. Videre tyrosinfosforylering av NEDD9 ble betydelig redusert via undertrykke tyrosinfosforylering av FAK eller SRC, noe som tyder på en positiv feedback loop av tyrosinfosforylering mellom NEDD9 og FAK eller SRC. I tillegg er våre data viste at stanse NEDD9 redusert vimentin uttrykk og økt E-cadherin uttrykk i livmorhalskreftceller, og vice versa. E-cadherin var gjenstand for regulering av NEDD9, FAK og SRC, men endret verken tyrosin-fosforylert eller total NEDD9. Våre funn tyder på at NEDD9 er overuttrykt i livmorhalskreft vev og celler, og overexpressed NEDD9 fremmer migrasjon og invasjon i livmorhalskreft celler, sannsynligvis via en positiv feedback loop av tyrosinfosforylering mellom NEDD9 og FAK eller SRC
Citation.: Sima N, Cheng X, Ye F, Ma D, Xie X Lü W (2013) The Overuttrykte Stillas Protein NEDD9 Fremmer Migrasjon og invasjon i livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP via Tyrosin Fosforylert FAK og SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10,1371 /journal.pone.0074594
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, Belgia
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 05.08.2013; Publisert: 18.09.2013
Copyright: © 2013 Sima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30801227,. 81272862), Natural Science Foundation of China Zhejiang Provincial (nr Y2100403;. LY12H16020), National Basic Research Program of China (No. 2009CB521808), den grunnleggende Forskning Midler til de sentrale universitetene i Kina og Zhejiang Provincial Program for dyrking av høy level Innovativ Helse talenter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste diagnosen kreft hos kvinner over hele verden, spesielt i utviklingsland. Årlig ca 529 800 kvinner møter denne sykdommen, sto for 9% av de totale nye krefttilfeller [1]. Selv om dagens behandlingsstrategier som radikal hysterektomi og strålebehandling har gode kliniske resultater, er nesten 275 100 dødsfall knyttet til livmorhalskreft hvert år. I tillegg er kirurgi kun egnet for tidlig stadium sykdommer og radioterapi resulterer i uønskede bivirkninger, slik som eggstokksvikt, vaginal stenose, radiocystitis og stråling proktitt som påvirker kvaliteten av pasientens liv [2]. Derfor er disse fakta underst et presserende behov for å utvikle mer effektive og nye terapeutiske mål.
NEDD9 genet, først identifisert i nevrale forløper celler i 1992, ble nedregulert under utviklingen av musen sentralnervesystemet [ ,,,0],3]. Etterpå dette genet ble også funnet i andre arter og vev. Law et al [4] skjermet et cDNA bibliotek for genene som forårsaket trådformede gjær spirende
S. cerevisiae
for å finne kandidat gener som kan koordinere cellulær signalering og morfologi. En «ny» genet ble identifisert og tildelt som menneskelige Enhancer av fila 1 (HEF1). En annen forskningsteam funnet at en ny 105 kD p130Cas-relatert protein ble fosforylert tyrosin ved inngrep av ß1 integriner i T-lymfocytter og betegnet den som lymfocytt-type Crk-assosiert substrat (Cas-L) [5]. Dermed NEDD9 hadde to andre uavhengige navn i historien. NEDD9 proteiner regulere proteinkomplekser som kontrollerer cellesyklus og apoptose, migrasjon, kjemotaksis, og differensiering [6]. FAK og SRC ble brukt som viktige mål for NEDD9 og de var fosforylert og aktivert gjensidig, som ble ansett som «kjernen reguleringsprosessen» av NEDD9 [7].
I de siste årene, endret uttrykk av stillas protein NEDD9 har dukket opp som bidrar til kreft metastaser i flere krefttyper, som brystkreft [6,8], glioblastom [9], melanom [10], lunge [11,12] og hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [1. 3]. Imidlertid er ingen studie hittil utført for å bestemme om NEDD9 er assosiert med human cervical carcinoma. Nye rapporter har antydet at NEDD9 er overuttrykt i noen menneskelig carcinoma som melanom [10] og HNSCC [13]. Her oppdaget vi NEDD9 uttrykk i menneskelig livmorhalskreft vev og utforsket rollen NEDD9 i utviklingen av livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøve samling
prøver av livmorhalsen og lymfeknute vev og kliniske parametre fra 67 livmorhalskreftpasienter (38 livmorhals plateepitel karsinom og 29 adenokarsinomer), som gjennomgikk kirurgi i løpet av 2005-2009 i Women Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, ble samlet inn og detaljerte data ble vist i tabell S1. Videre ble 22 livmorhals normale vevsprøver som styrer avledet fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi på grunn av godartede gynekologiske sykdommer. Ingen pasienter fikk kjemoterapi eller radioterapi før vev ble oppnådd. Studien ble gjennomgått og godkjent av etisk komité kvinnenes Hospital, School of Medicine, Zhejiang University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter eller deres foresatte.
Immunohistochemistry
Alle vev ble immunhistokjemisk farget på 4-mikrometer seksjoner å vurdere NEDD9 uttrykk i disse prøvene. Mus monoklonalt antistoff 2G9 mot NEDD9 (Abcam, 1: 1000) ble anvendt som det primære antistoff. EnVision
TM deteksjon kit ble anvendt i prosedyrene og 3,3′-diaminobenzidin (DAB) ble påført som kromogen. Hver seksjon ble scoret blindt for semi-kvantitativ bestemmelse av immunhistokjemisk farging intensitet av en patolog. Fargeintensitet ble scoret som følger: 0, ingen farging; 1, svak positivitet; 2, moderat positivitet; og 3, sterk positivitet. De sammensatte immunhistokjemi score ble beregnet ved å summere intensitetspoeng multiplisert med celle andel av denne intensiteten poengsum. Hvis for eksempel prøven viste moderat farging (mottok 2) i 20% av cellene og sterk farging (mottok 3) i 30% av cellene, vil de sammensatte immunhistokjemi score være (2 x 0,2) + (3 x 0,3) = 1,3. En gjennomsnittlig poengsum ble brukt for statistisk analyse.
Cell kultur
Menneskelivmorhalskreft cellelinjer Siha (HPV16-positiv), CaSki (HPV16-positiv), HeLa (HPV18-positive), C33A (HPV-negative), human ikke-tumor keratinocytt linje HaCaT og humane embryonale nyrecellelinjer HEK293 og HEK293T ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium. (DMEM; GIBCO, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C
Immunofluorescence
Førti-åtte timer etter utsåing på dekkglass, ble cellene fiksert med 3,7% paraformaldehyd og inkubert med muse-monoklonalt antistoff 2G9 (1: 200) mot NEDD9 som primært antistoff. Etter skylling tre ganger med PBS, ble cellene inkubert med geite anti-muse antistoff konjugert med Alexa Fluor 647 (Invitrogen) fortynnet 1: 1500 i 2% BSA som sekundært antistoff. Kjernene ble merket med Hoechest33342 (Sigma).
sirnas Utarbeidelse og Transfeksjon
Basert på litteraturen [14] og en gratis web-basert verktøy (https://www.dharmacon.com) , tre par sirnas ble utformet mot NEDD9 mRNA. sirnas mot HPV16 E6 /E7 og E-cadherin ble utformet som beskrevet tidligere [15]. Alle de siRNA tomannsboliger (tabell S2) ble kjemisk syntetisert ved GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Transfeksjoner ble utført i 6-brønners plater og ved hjelp av Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Lentiviral Produksjon
Den fullstendige kodende sekvensen til NEDD9 ble amplifisert ved PCR fra plasmider inneholdende cDNA-klon av NEDD9 (OriGene, USA) og settes inn i en lentivirus-gen overføringsvektor pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, USA). Den kodende sekvens av korte hårnål RNA (shRNAs) målrettet mot grønn fluorescens protein (GFP) eller NEDD9 (tabell S2) ble klonet som følger umiddelbart etter en U6 pol III promoter inn i en lentivirus-gen overføringsvektor (Invitrogen, USA). Vektorene ble deretter pakket inn lentiviral partikler i HEK293T celler. De lentiviruses ble anvendt for å infisere livmorhalskreft celle som tidligere beskrevet [16]. Produserte lentiviruses ble titrert og lagres i henhold til produsentens anvisninger.
Kvantitativ PCR
Totalt RNA ble fremstilt fra de behandlede celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, USA). Sanntid kvantitativ PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av en 7300 Real-time PCR system (Applied Biosystems) og fremført av SYBR grønt fargestoff i henhold til produsentens instruksjoner. Oligonukleotid primere ble syntetisert ved Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). som er oppført i tabell S2. Relativ kvantifisering av mRNA-ekspresjon ble beregnet med 2
-ΔΔCT metode som tidligere beskrevet [17].
Western blot og immunoutfelling
Western blots ble utført som beskrevet tidligere [18] . Celler ble høstet og resuspendert i lyseringsbuffer for proteinekstraksjon. Femti mikrogram av totalt protein fra hver prøve ble underkastet en 10% SDS-PAGE-gel-elektroforese. For immunoutfelling ble cellene ødelagt i 250 ul av immunpresipitering buffer. Like mengder protein (300 ug) ble underkastet immunoutfelling etterfulgt av Western blot-analyse. Akkumulert grå nivå av Western blot band ble oppnådd ved å bruke ImageJ programvare (NIH, USA) for relativ kvantifisering kvantitativ analyse. Primære antistoffer som var spesifikke for følgende proteiner: NEDD9 (ab18056) fra Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), pSRC (2101), fosfo-tyrosin (9411), vimentin (3932) og E-cadherin (3195) form Cell Signaling, HPV16 E6 (MAB874), E7 (MAB8680) fra Millipore, GAPDH (sc-59540) og β-aktin (sc-1616-R) fra Santa Cruz. Bånd ble visualisert ved hjelp av en ECL Kit (Pierce, USA).
Scratch sårhelende analysen
Scratch sårhelende analysen ble utført for å bestemme celle migrasjon. Celler ble infisert med lentivirus, og 72 timer senere vokst til full konfluens. Deretter sår (ca. 1 mm brede) ble fremstilt ved anvendelse av en mikropipette spissen skrapet gjennom brønnene. Den cellemigrering Hastigheten ble beregnet ved å måle avstanden migrerte i 24 timer. Bildene ble tatt ved hjelp av fasekontrastmikroskop (Olympus, Japan) på ulike tidspunkter etter scratch.
Transwell analyser
In vitro celle invasjon analyser ble utført i Matrigel-baserte Transwell plater i hovedsak som tidligere beskrevet av Pelletier et al [19] med små modifikasjoner. 5 x 10
4 Celler ble platet inn i Matrigel-belagte øvre kamrene i 24-brønners Transwell plater (Corning Costar, Cambridge, MA) med en porestørrelse på 8 um. De nedre Kamrene ble fylt med medium supplert med 20% føtalt bovint serum. Etter 24 timers inkubering, ble de ikke-migrerte celler på den øvre overflate av membranene forsiktig skrapet vekk med bomullspinner og de migrerte celler som hadde invadert til den nedre overflate var farget med krystallfiolett og tellet. Celle migrasjon analyser ble utført på en lignende måte, men uten Matrigel.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene ble analysert med programvarepakken SPSS 12.0. En måte ANOVA og t-test ble brukt for å sammenligne data.
p
Verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant statistisk.
Resultater
NEDD9 er overuttrykt i menneskelig livmorhalskreft vev og cellelinjer
For å finne en ledetråd av forholdet mellom NEDD9 protein og menneskelig livmorhalskreft, ansatt vi immunhistokjemisk analyse for å bestemme uttrykket av NEDD9 protein i menneskelivmorhalskreft vev og analysert foreningen av NEDD9 uttrykk med menneskelig livmorhalskreft progresjon. Vi fant at NEDD9 protein ble overuttrykt i de fleste livmorhalskreft vev, men dårlig uttrykt i normale livmorhals epitel vev (Figur 1a). I tillegg ble NEDD9 protein overexpressed med metastatisk lymfeknuter (Figur 1b). Dessuten ble NEDD9 overekspresjon korrelert med histologiske grad, metastase, og FIGO trinn (figur 1C). Videre, som vist i figur 1D, ble NEDD9 mRNA overuttrykt i fire vanlige cervical cancer-cellelinjer (Siha, HeLa, C33A og CaSki) uavhengig av HPV-positive og -negative, men relativt dårlig uttrykt i humane keratinocytt linje HaCaT og humane embryonale nyrecelle linjen HEK293. Western blot analyse viste at NEDD9 ble sterkt uttrykt i cervikal kreft-cellelinjer, på samme måte som de av qPCR. Immunofluorescens-analyse viste at proteinet av NEDD9 ble overuttrykt i livmorhalskreft cellelinjer og fordelt hovedsakelig i cytoplasma (figur 1E).
(A) Immunohistokjemisk farging av NEDD9 i squamous karsinom i cervix (SCC), adenokarsinom livmorhalsen (AC) og normalt vev i livmorhalsen. Original forstørrelse, × 400. (B) Immunhistokjemisk farging av NEDD9 i metastatisk venstre eksterne iliaca lymfeknuter av SCC og metastatiske riktige obturator lymfeknuter av AC. Original forstørrelse, × 400. (C) Statistisk analyse viste NEDD9 overekspresjon var korrelert med FIGO stadium, histologisk gradering og metastasering. (D) Ekspresjon av NEDD9 mRNA og protein i flere cellelinjer ble bestemt ved kvantitativ PCR og Western blot-analyse. (E) NEDD9 (rød) lokalisering og uttrykk ble vurdert ved immunfluorescens analyse i livmorhalskreft Siha, CaSki, HeLa, C33A celler og menneske HaCaT keratinocytter. Celler ble kontra farget med Hoechest33342 (blå) og visualisert ved 60 x forstørrelse.
Endret uttrykk for NEDD9 påvirkninger migrasjon og invasjon i livmorhalskreftceller
For å identifisere NEDD9 funksjon i livmorhalskreftceller, vi slått ned NEDD9 i Siha og HeLa celler ved hjelp av en bestemt siRNA (S: 5 «GAG ACA CCA UCU ACC AAG U [dT] [dT] 3», AS: 5 «ACU UGG UAG august GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 «), som ble utvalgt fra tre kandidater ved qPCR. Som vist i figur 2A, 2B og 2C, viste siRNA sterke interferenseffekter mot NEDD9 mRNA og protein i livmorhalskreft Siha og HeLa-celler. Videre forsøkte vi å avgjøre om migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller vil bli svekket ved reduksjon av NEDD9 uttrykk via lentivirus-gjennomført shRNA. Resultatene av Transwell analyser viste at NEDD9 shRNA kutte ned invasiv og vandrende evnen til livmorhalskreft Siha og HeLa celler (figur 2D og 2E). Videre er resultatene av sårhelende analyser viste signifikant langsom lukking av sår i den NEDD9 shRNA-behandlet vs. kontroll Siha og HeLa-celler ved 24 timer etter at bunnen (figur 2F, 2G og 2H). Vi har fastslått ytterligere effekten av økt NEDD9 på cellemigrering og invasjon. Lentivirus vektorer ble ansatt for å overuttrykker NEDD9 i HaCaT celler (figur 3A). TGFp (5 ng /ml) økte også ekspresjon av NEDD9 i HaCaT-celler (Figur 3B). Resultatene av Transwell-analyse viste at eksogene overekspresjon av NEDD9 resulterte i økt celle invasjon og migrasjon i HaCaT celler uten TGFB stimulering (Figur 3C og 3D).
NEDD9 ble slått ned av sirnas eller shRNAs i livmorhalskreft Siha og HeLa celler. (A) Et interferenseffekter ble bekreftet ved kvantitativ PCR i Siha og HeLa-celler. Ekspresjon av NEDD9 ble undersøkt ved Western blotting i Siha (B) og HeLa-celler (C). Celler ble infisert med lentiviral vektorer som koder shRNA mot NEDD9. Resultatene av Transwell-analysen viste at lentiviral levering av shRNA målretting NEDD9 resulterte i redusert celle invasjon (D) og migrasjon (E) i Siha og HeLa-celler. Resultatene av Scratch sårhelende analysen ytterligere bekreftet at stanse NEDD9 resulterte i redusert celle migrasjon (F, G og H). Scale bar, 100 mikrometer. *
P
0,05.
lentivirus vektorer ble ansatt for å overuttrykker NEDD9 i menneskelige HaCaT keratinocytter (A). TGFp (5 ng /ml) økte også ekspresjon av NEDD9 i humane keratinocytter HaCaT (B). Resultater av Transwell-analysen viste at lentiviral levering av NEDD9 resulterte i øket celle invasjon (C) og migrasjon (D) i HaCaT-celler uten TGFp stimulering. Scale bar, 100 mikrometer.
Gjensidig regulering mellom NEDD9 og FAK eller SRC
Videre er uttrykk for FAK og SRC, to NEDD9 assosierte proteiner [4], i infisert Siha og HeLa-celler ble bestemt ved Western blot. Resultatene viste at uttrykket av fosfo-FAK (Tyr397) og fosfo-Src (Tyr416), men ikke total FAK og total Src-protein ble signifikant redusert etter knockdown av NEDD9 (figur 4A og 4B). I overekspresjon eksperimenter, tyrosin-fosforylert FAK og SRC, snarere enn total FAK og total SRC, var signifikant oppregulert mens NEDD9 ble eksogent overexpressed i HaCaT celler (Figur 4C og 4D). Videre immunoutfelling ble anvendt for å bestemme om FAK-inhibitor PF-228 (Sigma, 10 uM) eller SRC-inhibitor PP2 (Sigma, 10 uM) regulert ekspresjon av NEDD9. Resultatene viste at ekspresjon av tyrosin-fosforylert NEDD9, snarere enn total NEDD9, ble signifikant redusert mens FAK eller SRC ble undertrykket av PF-228 eller PP2 i Siha og TGFp-stimulerende HaCaT-celler (figur 4E og 4F). I tillegg PF-228 (10 mm) eller PP2 (10 mm) redusert fosforylering av FAK eller SRC i TGFB-stimulerende HaCaT celler (Figur S1). PF-228 eller PP2 trykkes invasjon og migrasjon av Siha og TGFp-stimulerende HaCaT-celler (Figur S2). Tilsvarende resultatene av Transwell-analyse viste at begge inhibitorer trykkes celle invasjon og migrering økt med eksogen overekspresjon av NEDD9 i HaCaT-celler (figur 4G).
(A og B) Ekspresjon av NEDD9-assosierte onkoproteiner, FAK og SRC, ble undersøkt ved Western blotting. Tyrosin-fosforylert FAK og SRC, snarere enn FAK og SRC, var signifikant nedregulert mens NEDD9 ble stille i Siha og HeLa celler. (C og D) Videre har tyrosin-fosforylert FAK og SRC var signifikant oppregulert mens NEDD9 ble eksogent overuttrykt i HaCaT-celler. (E og F) Resultater av immunoprecipitation viste at tyrosin-fosforylert NEDD9, snarere enn NEDD9, var signifikant nedregulert mens FAK eller SRC ble undertrykt av FAK inhibitor PF-228 eller SRC inhibitor PP2 i Siha og TGFB-stimulerende HaCaT celler. (G) Resultater av Transwell analysen viste at økt celle invasjon og migrering av eksogene overekspresjon av NEDD9 ble undertrykt av FAK inhibitor PF-228 eller SRC inhibitor PP2 i HaCaT celler. Scale bar, 100 mikrometer.
NEDD9 regulerer vimentin og E-cadherin i livmorhalskreftceller
vimentin og E-cadherin var viktige proteiner i forhold til celle invasjon og migrasjon. Western blot analyse viste at vimentin ble nedregulert og E-cadherin ble oppregulert mens NEDD9 ble undertrykt av shRNA i Siha og HeLa-celler (figur 5A). Videre vimentin ble oppregulert og E-cadherin ble nedregulert mens NEDD9 ble overuttrykt i HaCaT celler (figur 5B). Resultatene tyder på at vimentin og E-cadherin er involvert i den regulatoriske rolle NEDD9 på celle migrasjon og invasjon i livmorhalskreftceller. Resultatene av Transwell-analyse viste at redusert celle invasjon og migrasjon indusert av shRNA spesifikt for NEDD9 ble økt med transfeksjon av siRNA mot E-cadherin (figur 5C og 5D). Resultatene bekreftet videre at E-cadherin var et undertrykkende regulatorisk protein i NEDD9 fremme celle migrasjon og invasjon i livmorhalskreftceller. Videre er nedregulert E-cadherin via overekspresjon av NEDD9 var signifikant oppregulert i kraft av PF-228 eller PP2 i HaCaT celler, i mellomtiden, den oppregulert vimentin uttrykk var signifikant nedregulert (figur 5E). I motsatt eksperiment, verken tyrosin-fosforylert eller total NEDD9 ble vesentlig endret, mens E-cadherin ble undertrykt av siRNA i HaCaT celler (Figur 5F).
Uttrykk for EMT markører, vimentin og E-cadherin, ble undersøkt ved Western blotting. (A) vimentin ble nedregulert og E-cadherin ble oppregulert mens NEDD9 ble stille i Siha og HeLa celler. (B) vimentin ble oppregulert og E-cadherin ble nedregulert mens NEDD9 ble overuttrykt i HaCaT celler. Resultater av Transwell-analysen viste at redusert celle invasjon (C) og migrasjon (D) med shRNA av NEDD9 ble økt med siRNA mot E-cadherin i Siha og HeLa-celler. Scale bar, 100 mikrometer. (E) E-cadherin ble oppregulert og vimentin ble nedregulert i kraft av FAK inhibitor PF-228 eller SRC inhibitor PP2 i HaCaT celler med eksogene NEDD9. (F) Resultater av immunoprecipitation viste at tyrosin-fosforylert NEDD9 og total NEDD9 ikke signifikant regulert mens E-cadherin ble undertrykt av siRNA i HaCaT celler.
E6 /E7 oncoprotein regulerer ikke NEDD9 i livmorhalsen kreftceller
det har vært kjent at HPV E6 og E7 gener er sentrale onkogener i initiere utvikling av livmorhalskreft, men effekten av E6 og E7 på verten gener assosiert med kreft progresjon er fortsatt usikker. Dermed observerte vi mulige sammenhenger mellom E6 /E7 og NEDD9 i livmorhalskreftceller. Men berøvelse av HPV16 E6 /E7 av siRNA ikke endre uttrykket av NEDD9 i HPV16-positive Siha og CaSki celler (Figur 6A og 6B), vice versa, gjorde nedregulering av NEDD9 ikke påvirke uttrykket av E6 /E7 (figur 6C og 6D). Våre resultater tyder på at NEDD9 er en sen molekylær hendelse som deltar hovedsakelig i progresjon eller metastasering av livmorhalskreft.
(A og B) Resultatet av qPCR og vestlige blotter viste at deprivasjon av E6 /E7 av siRNA didn «t endre uttrykket av NEDD9 i HPV-positive Siha og CaSki celler. (C og D) Forstyrrelser av NEDD9 ikke påvirke uttrykket av E6 /E7 i Siha og CaSki celler.
Diskusjoner
Selv om NEDD9 ble opprinnelig først identifisert som en av nytt gener uttrykt av nevrale forløper celler men nedregulert følgende fosterutvikling [3], flere aktuelle studier funnet at NEDD9 overekspresjon, som onkogene signal unormalt, var assosiert med kreft metastaser ved brystkreft [6,20,21], glioblastom [9] , melanom [10] og hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [13], samt knyttet til resistens i gastrointestinal stromal tumor (GIST) [22]. Nyere studier viser at NEDD9 regulerer TGFB sti i brystkreft [23,24] og leverkreft [25] og Wnt signal i kolorektal kreft [26]. Videre er TGFp en potent inhibitor av cellesyklus i humane keratinocytt HaCaT-celler, men det har også vist seg å fremme invasjon og migrasjon i HaCaT-celler [27,28]. Dermed har vi ansatt HaCaT celler som en modell for å studere en indusert migrering /invasjon fenotype.
Det hadde blitt bevist av immunhistokjemisk analyse som NEDD9 ble uttrykt i menneskelig bronchiolar epitel [29], humane lymfocytter i revmatoid artritt synovium [30 ], rotte cerebral cortex og hippocampus nevroner [31], menneskelig nevi og føflekkreft [10], mus embryonale encephalic og bagasjerommet nevralrøret [32], human sent innsettende Alzheimers sykdom [33], mus og chick embryonale neural crest [34] , menneskelige hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [13]. Videre har immunhistokjemisk analyse viser også at NEDD9 overekspresjon er korrelert med HNSCC og melanom progresjon [10,13]. Livmorhalskreft besitter en klinisk kjennetegn som metastaser til lymfeknuter skjer vanligvis på et tidlig stadium og presenterer dårlig prognose. Således vi har oppdaget og sammenlignet NEDD9 ekspresjon ved immunohistokjemisk analyse i 67 livmorhalskreft og 22 cervical normale vev, så vel som cervical cancer cellelinjer og ikke-tumor keratinocyt linje. Våre resultater viser at NEDD9 protein ble overuttrykt i de fleste livmorhalskreft vev og celler sammenlignet med normal epitel vev og ikke-kreft keratinocytter. Videre fant vi at NEDD9 overekspresjon var korrelert med lymfeknutemetastaser, histologisk gradering, og FIGO stadium av livmorhalskreft pasienter. Våre resultater var lik de rapportert av Lucas JT, Jr. et al [13] i HNSCC og av Kim M et al [10] i melanom og foreslår at NEDD9 overekspresjon kan innebære i progresjon og metastasering av livmorhalskreft.
NEDD9 protein bevarer en NH2-terminal Src homologi 3 (SH3) domene, som binder seg til proteiner inneholder poly-motiver som FAK. FAK er en av de viktigste assosierte proteiner av NEDD9 særlig i det sentrale adhesjon [4]. Natarajan M et al [9] tenkte at NEDD9 handlet som spesifikke nedstrøms effektorer av FAK som fremmet glioblastom celle migrasjon og invasjon. Vi fant i studien at NEDD9 og FAK tilsvar distribuert i cytoplasma av HPV16-positive livmorhalskreft Siha celler (data ikke vist), noe som tyder på det kanskje er noen spesielle koblinger mellom NEDD9 og FAK. RNA interferens (RNAi) er et kraftig verktøy for å kneble spesifikke gener. Flere studier [9,10,14,25,34-38] har vist at spesifikke sirnas rettet mot mRNA av NEDD9 genet er i stand til å ned-regulere uttrykk for NEDD9. Her benyttet vi RNAi som et verktøy for å undersøke hvilken rolle NEDD9 i utviklingen av livmorhalskreft. Dessuten ble en lentivirus genoverføring vektor brukes for å eksogent overuttrykker NEDD9 i studien. I våre forsøk, sirnas målretting NEDD9 genet effektivt hemmet både mRNA og protein uttrykk for NEDD9. FAK og SRC ble brukt som viktige mål for NEDD9 og de var fosforylert og aktivert gjensidig, som ble ansett som «kjernen reguleringsprosessen» av NEDD9 [7]. Egentlig funksjoner av FAK og SRC-proteiner er avhengig av deres tyrosinfosforylering i noen bestemte aminosyrerester i proteiner (for eksempel, Tyr416 av SRC og Tyr397 av FAK). Således vi har oppdaget tyrosinfosforylering av FAK og Src-protein følgende nedregulering eller oppregulering av NEDD9 og fant at tie av NEDD9 resulterte i tyrosin defosforylering, snarere enn redusert ekspresjon av både FAK og SRC. Interessant, overekspresjon av NEDD9 førte til tyrosin fosforylering av FAK og SRC. Videre fant vi også tyrosin-fosforylering snarere enn uttrykk for NEDD9 ble hemmet mens tyrosin-fosforylering av FAK eller SRC ble undertrykt av selektive hemmere som PF-228 og PP2. Mange grupper har funnet NEDD9 er en nedstrøms molekyl av FAK og SRC som fremmer migrasjon og invasjon relaterte signale [39,40]. Imidlertid har flere studier nylig vist at NEDD9 trolig fungert som oppstrøms signal om FAK og SRC [6,41]. Vedvarende redusert FAK [6] og SRC [41] aktivering ble vist i celler avledet fra NEDD9 knockout belastning. Våre funn tyder på at det kan være en positiv feedback loop av tyrosinfosforylering mellom NEDD9 og FAK eller SRC. Derfor tyrosin-fosforylering ble kontinuerlig forsterket via den såkalte «kjerne regulering prosess» og til slutt danne signaler med invasjon og metastase.
Siden den første funksjonsanalyse i 1996 [4,5], ble NEDD9 forbundet med migrasjon , invasjon og metastasering i ulike studier. Law et al. først oppdaget NEDD9 kan regulere cellepolarisering [4], som var et uunnværlig trinn i prosessen av cellemigrering. Celle migrasjon er grunnlaget for kreft celle invasjon og metastasering. Inntil nå ble NEDD9 funnet å delta i kreftmetastaser i glioblastom [9], melanom [10], og brystkreft. For tiden er det antatt at NEDD9 proteinet er assosiert med migrasjon, invasjon og metastase av kreftceller [7,42]. Våre resultater viste at NEDD9 protein ble overuttrykt i livmorhalskreft vev med metastaser. Videre hemme NEDD9 uttrykk av RNAi svekket migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller. Celler som gjennomgår epitelial-mesenchymale overgang (EMT) mister sin epitelial morfologi og få en bevegelige fenotype, som spiller en nøkkelrolle i kreft invasjon og metastasering [43]. Vimentin og E-cadherin var viktige biomarkører av epitel-mesenchymale overgang (EMT). Western blot analyse viste at shRNA mot NEDD9 redusert uttrykk for vimentin og økt uttrykk av E-cadherin og NEDD9 overekspresjon oppregulert vimentin og ned-regulert E-cadherin, som er lik de som er rapportert av Tikhmyanova N [21]. Videre nedregulert E-cadherin via overekspresjon av NEDD9 var signifikant oppregulert i kraft av inhibitor av FAK eller SRC. Verken tyrosin-fosforylert eller total NEDD9 ble betydelig regulert mens E-cadherin ble undertrykt. Våre resultater tyder på at NEDD9 overekspresjon fremmer migrering og invasjon av cervikale kreftceller sannsynligvis via i det minste delvis, epitelial-mesenchymale overgang (EMT) pathway. E-cadherin er et nedstrøms protein av NEDD9 og kan være en nøkkel modulator av NEDD9-mediert kreftcelle migrering og invasjon.
Det er velkjent at humane papillomavirus (HPV) infeksjon er den viktigste etiologiske faktor i cervical kreft [44]. Infeksjon med høyrisiko HPV (hr-HPV), spesielt HPV type 16 og 18, er årsaksmessig knyttet til utvikling av livmorhalskreft. Mange rapporter har slått fast at høyrisiko HPV (hr-HPV) stammer spesielt HPV-typene 16 og 18 er onkogene, som avhenger av de virale E6 og E7 onkogener som er rettet mot p53 og pRb tumor suppressor proteiner [45]. Gitt betydningen av E6 /E7, vi en hypotese om at det var noen forbindelser mellom E6 /E7 og NEDD9 i begynnelsen av studien. Vi har imidlertid ikke etablere en forbindelse mellom E6 /E7 og NEDD9.
