Abstract
MUC17 er en type en membranbundet glykoprotein som hovedsakelig uttrykt i fordøyelseskanalen. Nyere studier har vist at den avvikende overekspresjon av MUC17 er korrelert med ondartet potensialet i bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer (PDACs); imidlertid, er den nøyaktige reguleringsmekanisme av MUC17 uttrykk har ennå ikke er identifisert. Her gir vi den første rapporten fra MUC17 reguleringsmekanisme i henhold hypoksi, en viktig funksjon av svulsten mikromiljøet og en pådriver for kreft progresjon. Våre data viser at MUC17 ble betydelig indusert av hypoksisk stimulering gjennom en hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF1α) -avhengig sti i noen kreft i bukspyttkjertelen celler (f.eks AsPC1), mens andre bukspyttkjertelen kreftceller (f.eks BxPC3) viste lite respons på hypoksi . Interessant disse lav-responsive celler har sterkt metylerte CpG-motiver innenfor hypoksi følsomme element (HRE, 5′-RCGTG-3 «), et bindingssete for HIF1α. Dermed har vi undersøkt demetylering effektene av CpG på HRE på hypoksisk induksjon av MUC17. Behandling av lav-responsive celler med 5-aza-2»-deoksycytidin, etterfulgt av ytterligere hypoksisk inkubering resulterte i gjenopprettelse av hypoksiske MUC17 induksjon. Videre er DNA-metylering av HRE i pankreas vev fra pasienter med PDACs viste høyere hypometylering status sammenlignet med dem fra ikke-cancervev, og hypometylering ble også korrelert med MUC17 mRNA-ekspresjon. Samlet utgjør disse funnene antydet at HIF1α-mediert hypoksisk signalveien bidrar til MUC17 uttrykk, og DNA metylering av HRE kan være en determinant av hypoksisk induserbarheten av MUC17 i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Kitamoto S, Yokoyama S, Higashi M, Yamada N, Matsubara S, Takao S, et al. (2012) Uttrykk for MUC17 reguleres av HIF1α-mediert hypoksisk Responses og Krever Metylering-Free Hypoksi Ansvarlig Element i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (9): e44108. doi: 10,1371 /journal.pone.0044108
Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 28 februar 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 10.09.2012
Copyright: © Kitamoto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Princes Takamatsu Cancer Research Fund til S. Yonezawa; Grants-i-Aid for Scientific Research på Scientific Research (B) 23390085 til S. Yonezawa; Scientific Research (C) 21590399 M. Higashi; Unge Forskere (B) 24701008 til S. Yokoyama; Scientific Research på Prioriterte områder 239349 til S. Kitamoto (JSP Fellowship) fra departementet for utdanning, vitenskap, sport, kultur og teknologi, Japan; en Foundation Pancreas Forskning fra Japan til S. Yokoyama; og Kodama Memorial Foundation, Japan til M. Higashi. S. Batra støttes delvis av National Institutes of Health tilskudd (CA78590, CA163120, CA133944 og CA111294). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive former for kreft. På grunn av sin aggressive vekst og metastatiske egenskaper, den totale overlevelsen av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er 3-5% [1]. Avaskulære morfologi er en viktig egenskap ved kreft i bukspyttkjertelen, noe som resulterer i dårlig blod og oksygentilførsel. Følgelig inneholder kreftceller som er i det lave oksygen spenninger kreft i bukspyttkjertelen, en tilstand som kalles hypoksi. Oppsamling av bevis indikerer at den hypoksiske tumormikromiljøet er nært korrelert med solide tumoregenskaper inkludert invasjon, metastase og dårlig respons på anticancer terapi [2], [3]. I denne forbindelse har hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF1α) blitt identifisert som et viktig regulator av hypoksisk respons, aktivere ulike kreftrelaterte gener som for eksempel VEGF, Caix, og GLUT1.
slimstoffer er tungt
O
-glycosylated proteiner som finnes i slimlaget, og de blir forskjellig uttrykt på celleoverflaten av mange epitel. De er ansvarlige for de fysiske egenskapene til slim geler og er involvert i epitelcelle-beskyttelse og vedlikehold av den lokale molekylære mikromiljøet [4], [5], [6], [7]. Derimot, er det også økende bevis for at slimstoffer blir avvikende uttrykt i forskjellige kreftformer, og de har vært implisert i maligne transformasjon, samt tumorcelleformering, overlevelse, invasjon og metastase [8], [9], [10]. I denne sammenheng nylige studier vist at visse membranbundne slimstoffer er tilstrekkelig for å indusere den epiteliale-til-mesenchymale overgang og derved representere attraktive mål for anticancer-behandling [11], [12].
MUC17 glykoprotein var karakterisert som et membranbundne mucin [13]. RNA-blot-analyse indikerte at
MUC17
er hovedsakelig uttrykt i fordøyelseskanalen, inkludert i tolvfingertarmen, ileum, og tverrgående kolon [13], [14]. Under fysiologiske betingelser, har det blitt foreslått at endogen MUC17 spiller en viktig rolle i celle hvile prosesser og bidrar til tykktarm-mucosal beskyttelse [15], [16]. Moniaux et al. rapportert at MUC17 ble abnormt uttrykt i bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer (PDACs) sammenlignet med sin mangel på uttrykk i normal bukspyttkjertelen eller pankreatitt [17]. Videre Hirono et al. rapporterte også at MUC17 er en uavhengig prognostisk faktor assosiert med lymfeknutemetastase i PDACs [18]. Disse funnene antyder at MUC17 kan ha en viktig rolle i progresjon kreft i bukspyttkjertelen. Når det gjelder reguleringsmekanisme for MUC17, vår tidligere studie antydet at epigenetiske forandringer, inkludert CpG-DNA metylering og histonmodifikasjonene på H3-K9 i MUC17 proksimale arrangøren er viktige faktorer som bestemmer MUC17 uttrykk [19]. Det er imidlertid fortsatt uklart hva slags transkripsjonsfaktorer er rekruttert til MUC17 arrangøren og involvert i reguleringen av MUC17 uttrykk.
I denne studien, gir vi den første bevis beskriver reguleringsmekanisme for MUC17 i hypoksisk svulstens mikromiljø. Våre resultater viser at MUC17 er indusert av HIF1α formidling hypoksisk respons, og den spesifikke DNA metylering bestemmer hypoksisk induserbarheten av MUC17 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
menneske~~POS=TRUNC pankreas tumorvev ble hentet fra Kagoshima universitetssykehus, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. Denne studien ble godkjent av etisk komité av Kagoshima universitetssykehus.
bukspyttkjertelkreft cellelinjer og prøver menneskelig vev
De menneskelige bukspyttkjertelen carcinoma cellelinjer AsPC1, BxPC3, HPAFII, og PANC1 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). BxPC3 og AsPC1 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma, St. Louis, MO, USA.). HPAFII celler ble dyrket i Eagles minimum essensielt medium (Sigma). PANC1 celler ble dyrket i D-MEM (Sigma). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og 100 U /ml penicillin /100 g /ml streptomycin (Sigma). Hypoksiske kulturbetingelser ble oppnådd med en multi-gass-inkubator inneholdende en gassblanding bestående av 94% N
2, 5% CO
2, og 1% O
2 (ASTEC, Japan). Alle forsøkene ble utført minst tre ganger mindre annet er angitt.
RNA ekstraksjon og RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Wilmington, DE, USA). For RT-PCR, den oppnådde mRNA ble revers-transkribert til cDNA med høy kapasitet RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne for den påfølgende PCR-er vist i tabell S1. PCR ble utført med AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll.
Protein utvinning og Western blotting
Cellene ble dyrket på 6 cm oppvasken under hypoksiske betingelser for deres angitte tider. Totale cellelysater ble fremstilt under anvendelse av RIPA-buffer inneholdende protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque, Japan). Etter kvantifisering ved BCA-analyse (Thermo Scientific), ble like mengder løst ved 3-8% SDS-PAGE og elektrooverført på PVDF-membraner. For MUC17 ekspresjon analyse, ble protein lysater løst på 2% agarosegeler inneholdende SDS og passivt overført på PVDF-membraner og inkubert over natten ved romtemperatur. Membranene ble blokkert med 1% skummet melk /PBST i 2 timer og underkastet den standard immundeteksjon prosedyren ved hjelp av spesifikke primære antistoffer. De primære antistoffer var som følger: anti-human MUC17 (kanin pAb, 1:1000, generert av en av forfatterne, Dr. Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE, USA); anti-human HIF1α (mus mAb, 1:1000, H1alpha67, Novus Biologicals), og anti-human α-tubulin (mus mAb, DM1A, Sigma).
RNA interferens
For RNA interferens (RNAi) eksperimenter,
HIF1A
uttrykk ble stille ved hjelp av On-Target pluss siRNA (Dharmacon) i henhold til produsentens anvisninger. On-Target pluss siControl ikke-målsøkende siRNA ble anvendt som en kontroll. AsPC1 celler ble sådd i 6-cm retter, og ved 50-60% konfluens, ble de tilført med 13,6 nmol /L siRNA hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
Dual-luciferaserapportørplasmid analysen
Den 5′-flankerende sekvens (-687-53) av human MUC17 ble amplifisert ved bruk av genomisk DNA isolert fra AsPC1 celler. PCR-fragmentet ble spaltet med Nhel og Xhol og klonet inn i pGL4.17 vektor (Promega). For å generere HRE mutanter av den menneskelige MUC17 promoter, ble en QuikChange Lightning seterettet mutagenese Kit benyttet (Stratagene). Primersettene er vist i tabell S1. For den doble luciferase reporter analysen ble AsPC1-celler sådd ut i en 24-brønns plate ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn og transient transfektert med 75 ng av luciferase reporter plasmid ved hjelp av JetPEI (Polyplus Transfeksjon) ifølge produsentens protokoll. Deretter ble luciferaseaktiviteten i de totale cellelysatene ble analysert etter 24 timer ved hjelp av Dual-luciferase reporter Assay System (Promega) i et flermodus Tristar mikroplateleser LB 941 (Berthold Technologies). Den Renilla luciferasereportergenet uttrykt i en pGL4.74 vektor ble samtidig tilført som en intern kontroll.
Chromatin immunoprecipitation
kromatin immunoprecipitation (chip) Analysen ble utført ved hjelp av en Shearing-Chip kit og en OneDay ChIP kit (Diagenode, Philadelphia, Pennsylvania, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble nucleoproteins komplekser ultralydbehandlet for å redusere størrelsene av DNA-fragmenter 300-500 bp ved hjelp av en Bioruptor (Cosmo Bio). Ett mikrogram av normal mus IgG ble anvendt som negativ kontroll, og muse anti-humant HIF1α antistoff ble brukt for hver immunoutfelling. Immunopresipitert-DNA ble amplifisert ved PCR som beskrevet tidligere. Brikken primere ble utformet for å målrette HRE stedet av MUC17 promoter. Primerne for den påfølgende PCR-er vist i tabell S1. PCR-betingelsene var 95 ° C i 5 minutter, 34 sykluser ved 96 ° C i 5 s, 59 ° C i 5 s, og 68 ° C i 7 s, og en endelig forlengelse reaksjon ved 72 ° C i 1 min. De amplifiserte produktene ble utsatt for 1.0% agarosegel-elektroforese.
DNA metylering analyse
For CpG demetylering analysen ble AsPC1 celler inkubert med 1 pM 5-azadC (Sigma) i 7 dager. Ved slutten av behandlingen, ble DNA og protein ekstrahert for metylering-spesifikk PCR (MSP) og Western blotting. DNA-ekstraksjon og MSP ble utført i henhold til standardmetoder. I korte trekk, ble samlet DNA fra cellelinjer og vev ble ekstrahert ved hjelp av en DNeasy Tissue System (Qiagen). Bisulfitt modifikasjon av det genomiske DNA (2 pg) ble utført ved anvendelse av en Epitect bisulfitt Kit (Qiagen), og like mengder av modifiserte DNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems). Spesifisiteten til MSP primere er i stor grad påvirket av de termodynamiske egenskapene til 3′-enden av den foreslåtte primer. Således vi setter cytidin rest av CpG innenfor HRE som 3′-enden av primeren MSP. U primer er utformet for amplifisering av natriumbisulfitt omdannet DNA i en unmethylated tilstand, mens M primer er spesifikk for natriumbisulfitt omdannet denaturert DNA. De HRE-målrettede primerpar er vist i tabell S1. PCR-betingelsene var 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser ved 96 ° C i 5 s, 59 ° C i 5 s, og 68 ° C i 5 s, og en endelig forlengelse reaksjon ved 72 ° C i 1 min. De amplifiserte produkter ble utsatt til 1,0% agarosegel-elektroforese.
For ytterligere å undersøke korrelasjonen av MUC17 uttrykk med metylering status på, pankreas tumorvev ble innhentet fra kirurgisk resected pancreatic eksemplarer av 10 pasienter med PDAC biologiske prøver . Normale pankreatiske vev ble oppnådd fra de samme pasientene fra områder fjernt fra svulsten. Alle vevsprøver ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. For å gjennomføre MSP og RT-PCR, ble samlet DNA og RNA isolert fra vev og analysert som beskrevet tidligere. Resultatene oppnådd fra MSP og RT-PCR-bånd ble kvantifisert ved bilde J soft ware, og det relative nivået av unmethylation i hver prøve ble beregnet som en indeks for unmethylation status ved hjelp av ligning (%) = U /(U + M). Korrelasjonen av MUC17 mRNA uttrykk med metylering status for HRE ble analysert ved hjelp av Spearmans test.
Statistical Analysis
I luciferase reporter og chip analyser, ble de statistiske forskjellene bestemmes ved hjelp av en tosidig elevens
t
-test. For å undersøke sammenhengen mellom HRE metylering status og MUC17 uttrykk i vevsprøver, ble Spearman test utført ved hjelp av statistisk programvare R versjon 2.12.2. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Uttrykk for MUC17 økes i henhold til hypoksi i kreft i bukspyttkjertelen celler
For å undersøke effekten av hypoksisk eksponering på MUC17 uttrykk, vi dyrket. menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler AsPC1 henhold hypoksiske dyrkningsforhold (1% O
2) i 2 dager. I RT-PCR-analyse, uttrykk for MUC17 og Caix, en hypoksisk markør, ble betydelig økt, mens HIF1α mRNA nivåene var stabilt under hypoksiske forhold, bekrefter tidligere rapportert posttranskripsjonelt regulering av HIF1α [20]. Western blotting ble også anvendt for å undersøke den MUC17 proteinnivå, og det viste en fremtredende induksjon av MUC17 og HIF1α ekspresjon i en tidsavhengig måte (figur 1A og 1B). Til dags dato, er HIF1α kjent som en viktig regulator av hypoksisk respons i mange kreftformer. HIF1α binder seg til hypoksi reagerende element (HRE, 5′-RCGTG-3 «), et bindingssete for HIF1α, og transaktiverer mange hypoksi-responsive gener inkludert VEGF, GLUT1, og Caix. Vi gjennomførte sekvensanalyse av de ca 3,0 kb MUC17 arrangøren med MatInspector programvare (Genomatix) og fant en antatt HRE (+ 37 /+ 41) i den proksimale promoter regionen MUC17. Dermed hypotese vi at MUC17 overekspresjon henhold hypoksiske forhold formidles av HIF1α. For å undersøke virkningen av hypoksi på den transkripsjonelle aktivitet av MUC17 promoteren, konstruerte vi et MUC17 promoter-luciferase reporter vektor inneholdende HRE området. Under hypoksiske betingelser, AsPC1-celler transfektert med denne konstruksjon viste signifikant øket reporter-aktivitet (figur 1C), noe som tyder på at forbedringen av MUC17 til uttrykk under hypoksiske betingelser er på grunn av en økning av transkripsjonen aktivitet.
(A) AsPC1 cellene ble dyrket under hypoksiske forhold (1% O
2) for de angitte tider. MUC17 mRNA-ekspresjon ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR ved hvert tidspunkt. (B) AsPC1-celler ble dyrket med normoksisk eller hypoksiske betingelser i de angitte tidsrom. Cellelysatene ble probet med anti-MUC17, HIF1α, og a-tubulin antistoffer ved Western blot-analyse. Intensitetene for bånd ble kvantifisert ved densitometrisk scanning, og forholdet mellom MUC17 til a-tubulin ekspresjon er vist under hvert bånd som den relative intensitet sammenlignet med det som ble oppnådd i normoksisk AsPC1 celler. (C) MUC17 promoter-aktivitet ble målt ved hjelp av en dobbel-luciferase reporter-analysen. Etter transfeksjon av MUC17 reporter plasmid, ble AsPC1 celler inkubert i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser i 24 timer. Cellelysater ble analysert ved hjelp av en luciferase assay kit i en Tristar multimode mikroplateleser LB941 (Berthold Technologies). Transformasjon effektivitet ble normalisert på basis av Renilla luciferase-aktivitet. Arrangøren aktivitet etter normoksisk betingelser ble gitt en verdi på 1. P-verdiene ble bestemt ved bruk av Student
t
-test. * P. 0,05
hypoksisk induksjon av MUC17 er regulert av HIF1α-avhengige signalveien
For å undersøke om HIF1α er virkelig involvert i hypoksisk induksjon av MUC17, vi undersøkte effekten av HIF1α stanse på hypoksisk MUC17 induksjon i AsPC1 celler ved hjelp sirnas. Under hypoksi, kontroll siRNA hadde ingen virkning på transkripsjonen av MUC17, HIF1α, Caix, og ß-aktin. Tvert imot, behandling med sirnas som målretter HIF1α førte til en fremtredende reduksjon av hypoksisk MUC17 induksjons samt Caix (figur 2B). Det samme resultatet ble observert på proteinnivå (figur 2B), som indikerer involveringen av HIF1α i hypoksisk MUC17 induksjon.
(A) Etter transfeksjon av HIF1A sirnas, ble AsPC1 celler dyrket under normoxia (N) eller hypoksi (H) i 24 timer. Nivået av mRNA ble målt ved hjelp av RT-PCR. (B) Cellelysater fra AsPC1 celler behandlet med HIF1A sirnas ble immunoblottet med de angitte antistoffer. α-tubulin fungert som en lasting kontroll. (C) Densitetene til de innhentede band fra Western blotting-analyse ble kvantifisert og uttrykt som relative gangers økning sammenlignet med det som ble oppnådd fra mock celler under hypoksiske dyrkningsforhold. ns, ikke signifikant. * P 0,05, ** P. 0,005
Hypoksi øker rekrutteringen av HIF1α til HRE og aktiverer MUC17 transkripsjon
For å vurdere involvering av HIF1α i MUC17 transkripsjonsregulering, vi utføres chip analyser. Resultatet viste at anti-HIF1α antistoff betraktelig beriket MUC17 promotorfragmenter som bærer HRE henhold hypoksiske betingelser, men ikke i henhold til normoksisk betingelser (figur 3A og 3B). Videre vi testet om HRE var faktisk avgjørende for hypoksi-induserende MUC17 trans. Reporter vektorer mutasjoner på HRE området ble bygget og transfektert inn AsPC1 celler i henhold hypoksiske forhold. Som vist i figur 3C,-celler transfektert med enten mutante vektorer utviste signifikant redusert transaktivering sammenlignet med den til villtype-promotor konstruere-transfekterte celler, noe som indikerer vesentlig rolle HRE området i den hypoksiske MUC17 induksjon.
(A) Binding av HIF1α til kromatin ble bekreftet av en chip analysen. AsPC1 celler ble dyrket under normoxia eller hypoksi i 24 timer. PCR ble utført med spesifikke primere som dekker HRE. (B) De tettheter av de oppkjøpte band i panelet (A) ble kvantifisert ved hjelp av Image J (NIH) og normalisert til Input inkludert i hvert forsøk. (C) For å vurdere aktiviteten av transaktivering HIF1α gjennom HRE, ble en dobbel luciferase-assay gjennomføres. AsPC1-celler ble transfektert med villtype eller mutante HRE MUC17 promotorkonstruksjoner i henhold til hypoksiske betingelser i 24 timer. P-verdier ble bestemt med Student
t
-test. ns, ikke signifikant. * P 0,01, ** P. 0,001
Differensial uttrykk mønster av MUC17 indusert av hypoksi i ulike bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Videre har vi vurdert om hypoksisk induksjon av MUC17 er en universell hendelse i kreft i bukspyttkjertelen celler. Andre cellelinjer (BxPC3, HPAFII, og PANC1) ble dyrket under hypoksiske betingelser i 2 dager, og mRNA-ekspresjonsnivåer ble overvåket. Resultatene viste at MUC17 uttrykk nivåer i AsPC1 og HPAFII celler ble signifikant økt etter hypoksiske forhold. I motsetning til dette ble bare en svak økning observert i BxPC3 og PANC1 celler (figur 4A). I denne sammenheng har vi nylig rapportert at DNA hypometylering er en nøkkelfaktor for MUC17 uttrykk i bukspyttkjertelkreft (figur 4B). Interessant, AsPC1 og HPAFII celler, som utstilte fremtredende MUC17 induksjon etter hypoksi, vises en nesten helt unmethylated HRE (nr 13) i MUC17 promoter, mens BxPC3 og PANC1 cellene hadde sterkt denaturert hres [19]. Dermed hypotese vi at DNA metylering status for HRE bestemmer MUC17 induksjon respons på hypoksi.
(A) Differensial uttrykk mønster av MUC17 indusert av hypoksisk eksponering i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Hver bukspyttkjertelen cellelinjen ble dyrket under normoksiske (N) eller hypoksisk (H) betingelser. Nivået av mRNA ble bestemt ved RT-PCR ved hvert tidspunkt. (B) Den humane MUC17 genpromoter sekvens, som spenner over posisjonene -687 til 302 i forhold til transkripsjonsstartsetet. Tallene av CPG nettsider er understreket. Den HRE nettstedet inneholder den CpG nettstedet (nr 13).
DNA metylering status for HRE bestemt hypoksi induserbarheten av MUC17 uttrykk
For å undersøke involvering av DNA metylering av HRE i MUC17 til uttrykk under hypoksiske betingelser, behandlet vi BxPC3 og PANC1 celler med 5-AzadC (et DNA demethylating middel) i 7 dager, og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer under normoxia eller hypoksi. Først bekreftet vi demetyleringen effekten av 5-AzadC behandling på HRE av MSP (figur 5A). Deretter undersøkte vi MUC17 ekspresjon i celler behandlet med 5-AzadC henhold hypoksiske betingelser, noe som resulterer i gjenopprettelse av MUC17 ekspresjon bare i celler behandlet 5-AzadC behandling under hypoksi (figur 5B).
(A) Demetylering av CpG steder i MUC17 promoter i BxPC3 og PANC1 celler etter 1fiM 5-azadC behandling. MUC17-negative /lav cellelinjer ble behandlet med eller uten 5-azadC i 7 dager. Metylering status for MUC17 arrangøren husing HRE ble undersøkt av MSP. PCR-produktene som er merket M (denaturert) ble amplifisert ved metylering-spesifikke primere, og de som er merket U (unmethylated) ble amplifisert med primere som er spesifikke for unmethylated DNA. (B) Restaurering av MUC17 uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer med 5-azadC behandling. Celler ble behandlet med eller uten 5-azadC i 7 dager. I løpet av de siste 24 timer, ble hver gruppe dyrket under normoksiske (N) eller hypoksisk (H) betingelser. MUC17 uttrykk ble undersøkt ved Western blotting.
MUC17 uttrykk korrelerer med hypometylering på HRE innenfor promoter omegn
I tillegg til å vurdere den biologiske betydningen av HRE metylering i MUC17 uttrykk, vi undersøkte MUC17 uttrykk og metylering status i normale og bukspyttkjertel tumorvev fra pasienter med PDACs av henholdsvis RT-PCR og MSP,. I samsvar med tidligere rapporter [17], [18], MUC17 mRNA og protein er overuttrykt i PDAC (Figur 6A og B). I MSP analyse ved hjelp av 10 parrede PDAC prøver (ikke-cancervev; n = 10, cancervev; n = 10), ble unmethylated signaler signifikant observert i vev med PDAC sammenlignet med dem fra ikke-cancervev (to-halet Student
t
-test, P = 0,007). Vi har også undersøkt sammenhengen mellom MUC17 mRNA uttrykk og metylering status for HRE. Nivået på MUC17 mRNA var sterkt korrelert til hypometylering status for HRE i MUC17 arrangøren i bukspyttkjertelkreft (figur 6C).
(A) MUC17 mRNA uttrykk og HRE metylering status i normal bukspyttkjertelen (N) og pankreas tumorvev (T) ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og MSP, respektivt. (B) Representative immunhistokjemiske fargings data for MUC17 i en pasient med PDAC. Scale bar, 100 mikrometer. (C) Korrelasjon av MUC17 mRNA-ekspresjon og HRE metylering status ble analysert ved hjelp av Spearman test. Densitetene til de innhentede bånd ble kvantifisert ved hjelp av Image J, og den relative mengde av unmethylation i hver prøve ble beregnet som en indeks for den avvikende unmethylation status ved hjelp av ligning (%) = U /(U + M).
diskusjon
Nylige studier har identifisert human MUC17, som blir overuttrykt i PDACs, som en selvstendig prognostisk faktor av lymfeknutemetastase [17], [18]. Selv om lite er kjent om den funksjonelle rollen MUC17 i kreft, forstå reguleringsmekanisme for MUC17 kan være et viktig steg i å utvikle nye strategier for kreftdiagnose og behandling.
I denne studien har vi undersøkt hypoksisk regulering av MUC17 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre resultater viste at MUC17 er betydelig indusert ved hypoksi på en tidsavhengig måte, og dette oppregulering er direkte mediert av HIF1α. Videre er bruken av fire cellelinjer med forskjellige MUC17 hypoksiske inducibilities tillater oss å foreslå en modell for epigenetisk regulering av MUC17 i bukspyttkjertelkreft. Vi foreslår at DNA metylering av HRE hemmer HIF1α-mediert MUC17 trans i celler med lav MUC17 hypoksisk induserbarheten, mens progressive hypometylering av HRE tillater en fremtredende økning i MUC17 til uttrykk under hypoksiske forhold i celler med høy hypoksisk induserbarheten. Det er økende bevis for at metylering av CpG områder i promotorområdene påvirker induksjon av genuttrykk ved HIF1α, antagelig ved å begrense tilgangen av transkripsjonsfaktorer til
cis
-acting elementer [21], [22]. Som vist i figur 6, er hypometylering av HRE innenfor MUC17 promoteren en hyppig hendelse i de pankreatiske vev hos pasienter med PDAC. Selv om videre studier er nødvendig for å belyse andre faktorer involvert i MUC17 uttrykk, kan dette forklare hvorfor MUC17 er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft. Når det gjelder mangel på Caix induksjon i PANC1 celler, har det blitt demonstrert at Caix uttrykk er, i det minste delvis, regulert ved hjelp av setespesifikk CpG hypometylering ved -74 bp i promoteren av nyrecellekreft og andre kreftcelletyper [23] , [24], [25]. Derfor kan dette svaret også bli påvirket av DNA metylering status for HRE i Caix promoter.
Det er noen konsekvenser for vurderer den funksjonelle rollen MUC17 i kreftutvikling. I solide tumorer på grunn av ubegrenset spredning av kreftceller og utilstrekkelig vaskularisering, er oksygenmangel (hypoksi) og næringsmangel anerkjent som viktige funksjoner av svulsten mikromiljøet og en pådriver for kreft progresjon. Nylig er det blitt rapportert at MUC1, som også er identifisert som en hypoksi-induserbar mucin kunne fremme autophagy, noe som gir en overlevelsesfordel i lav glukose-stresset mikromiljøet gjennom undertrykkelse av glukosemangel-indusert økning i ROS-nivåer i tykktarmskreft [26]. I tillegg er det også blitt rapportert at stabil transfeksjon av liten hårnål RNA rettet mot endogene MUC17 i tykktarmskreft LS174T celler resulterte i redusert celle aggregering, redusert celle-celle tilslutning og migrering, og økt mottakelighet for apoptose [15]. Disse funnene tyder på at MUC17 kanskje har noen funksjoner, inkludert celle migrasjon, invasjon, motstand mot apoptose og tilpasning til stressede microenvironments i bukspyttkjertelkreft progresjon.
Endringer av DNA metylering er en av de mest bemerkelsesverdige epigenetiske forandringer i menneskelig kreft . Det akkumulerende bevis tyder på at avvikende DNA-metylering blir ofte observert selv i de tidlige og forstadier stadier av human kreftutvikling, og det kan være en indikator på kreftfremkallende risiko, en tidlig diagnostisk markør for kreft, og et biologisk prediktor for kreft maligniteter [27], [ ,,,0],28]. Det har blitt rapportert at epigenetiske modifikasjoner, inkludert DNA-metylering i stor grad bidrar til ekspresjonen av human mucin familie gener i kreft [19], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Zhu et al. har rapportert en avvikende økning både i uttrykk og hypometylering av MUC4 under Panin-PDAC progresjon [35]. I tillegg har vi utviklet en ny metode for å påvise DNA metylering mønstre kalt MSE, som gjorde påvisning av endrede metylering i bukspyttkjertelen juice og avslørte betydelig ulike metylering mønstre i MUC1 promoter mellom intraductal papillær mucinous svulst og PDAC, noe som indikerer dens potensielle diagnostisk bruk [36]. Selv om videre studier er nødvendig for å klargjøre den clinicopathological betydning og nøyaktige mekanismer for MUC17 uttrykk, er disse funnene øke muligheten for at metylering status for MUC17 promoteren er et epigenetisk markør for diagnose av kreftfremkallende risiko og forutsigelse av resultatene av pasienter med PDAC. Til sammen viser vår studie for første gang at MUC17 uttrykk forsterkes av HIF1α-mediert hypoksisk respons og at DNA metylering av HRE er en viktig faktor for hypoksisk induserbarheten av MUC17 i bukspyttkjertelkreft. I fremtiden vil betydningen av disse funnene i bukspyttkjertelkreft patogenesen bli utforsket.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Syntetiske oligonukleotider brukt i denne studien. Syntetiske oligonukleotider som er oppført sammen med posisjonsnummeret i forhold til transkripsjonsstartsetet. I MSP analyse, * indikerer U primer for unmethylated alleler. ** Indikerer M primer for denaturert alleler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044108.s001 plakater (DOC)
bekreftelser
Forfatterne takker Ms. Izumi Houjou og Yukari Nishimura for deres utmerkede teknisk assistanse.
