Abstract
Behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og tykktarmskreft (CRC) er vesentlig endret i løpet av de siste årene med innføringen av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) i klinisk praksis. Forståelsen av mekanismene som regulerer celler følsomhet for disse stoffene er nødvendig for optimal bruk.
En in vitro modell av ervervet resistens mot to tyrosinkinasehemmere (TKI) rettet mot EGFR, erlotinib og gefitinib, og til en TKI rettet mot EGFR og VEGFR, vandetanib, ble utviklet ved kontinuerlig behandling av det humane NSCLC-cellelinje Calu-3 og human CRC HCT116-cellelinjen med økende doser av hvert medikament. MTT, western blot analyse, migrasjon, invasjon og forankringsuavhengige kolonidannende analyser ble utført in vitro og eksperimenter med etablerte xenograft i atymiske nakne mus ble utført in vivo i sensitive, villtype (WT) og TKI-resistente Calu-3 og HCT116 cellelinjer.
i forhold til WT Calu-3 og HCT116 humane kreftceller, viste TKI-resistente cellelinjer en betydelig økning i nivåene av aktivert, fosforylert AKT, MAPK, og av survivin. Tatt i betraktning den rolle av RAS og RAF som nedstrømssignalene for både EGFR og VEGFR trasé, behandlet vi resistente celler med sorafenib, en inhibitor for c-RAF, b-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, og PDGFR-β. Sorafenib redusert aktivering av MEK og MAPK og forårsaket en hemming av cellevekst, invasjon, migrering, forankrings-uavhengig vekst in vitro og av tumorvekst in vivo av alle TKI-resistente Calu-3, og HCT116-cellelinjer.
Disse dataene tyder på at motstanden mot EGFR-hemmere er hovedsakelig drevet av RAS /RAF /MAPK sti og kan vant ved behandling med sorafenib
Citation. Morgillo F, Martinelli E, Troiani T, Orditura M, de Vita F, Ciardiello F (2011) Antitumor aktivitet av Sorafenib i human Cancer cellelinjer med ervervet Motstand mot EGFR og VEGFR tyrosinkinasehemmere. PLoS ONE 6 (12): e28841. doi: 10,1371 /journal.pone.0028841
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: Mai 25, 2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 09.12.2011
Copyright: © 2011 Morgillo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Milano, Italia. Floriana Morgillo er mottaker av en European Society of Medical Oncology (ESMO) translasjonsforskning fellesskap. finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er en sentral regulator av kreftcelle spredning og progresjon i flere humane krefttyper. Den kliniske effekten av EGFR-hemmere (cetuximab, panitumumab, erlotinib, gefitinib og vandetanib) innført i klinisk praksis for behandling av metastatisk kreft er begrenset til en undergruppe av pasienter med flertallet av kreftpasienter som viser enten indre eller ervervet resistens mot disse stoffene [1].
de siste fremskritt i kunnskapen om kreft biologi og narkotika-resistensmekanismer har identifisert blant de intracellulære signalveier, som fungerer som ned-stream til EGFR, den AKT og RAS /RAF /mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) banene som vesentlig er ansvarlig for utviklingen av kreftcellen resistens mot EGFR-hemmere [2] -. [4]
Men vi nylig demonstrert at, i våre in vitro ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) modell av ervervet resistens overfor erlotinib og gefitinib, behandling med en rekke midler som er kjent for å målrette direkte eller indirekte den AKT signalveien, for eksempel ad LY294002, deguelin og everolimus, var ikke effektivt til å inhibere erlotinib- (ERL-) og gefitinib – (GEF-) resistente kreftcelle spredning [5]
på den andre siden, har mutasjoner i K-RAS-genet blitt beskrevet både i NSCLC og tykktarmskreft (CRC) pasienter som ansvarlig for en dårlig prognose. og dårlig respons på EGFR-hemmere [6]. Disse mutasjoner forårsaker KRAS proteinene å akkumulere i GTP-bundet, aktiv form som fører til konstitutivt, vekstfaktor-reseptor-uavhengig aktivering av KRAS nedstrøms signalisering på tumorceller [7]. Utviklingen av terapeutiske strategier for pasienter med KRAS-mutasjoner er således et viktig klinisk mål. RAF-serin-treonin-kinaser er hoved effektorer av RAS i MAPK signalveien, og er derfor et potensielt mål for cancerterapi. Til dags dato den mest vellykkede kliniske hemmer av RAF aktivitet er sorafenib (Nexavar, BAY 43-9006) [8] – [10], en muntlig tilgjengelig multi-målrettede kinase inhibitor, som blokkerer aktivering av C-RAF, B-RAF (både villtype og det aktiverte V600E mutant), c-KIT, FLT-3, RET, vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR-2), VEGFR-3, og blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor β (PDGFR- β) [8] – [10], som for tiden er godkjent for behandling av metastatisk nyrecellekreft (RCC) og for avansert hepatocellulært karsinom (HCC), og under undersøkelse på andre maligniteter. Sorafenib påvirker tumorvekst ved direkte å inhibere tumorcelleformering og fremme apoptose i forskjellige tumortyper, så vel som ved å inhibere tumor-indusert neoangiogenesis.
Vårt laboratorium har nylig gitt bevis for en synergistisk interaksjon mellom sorafenib og erlotinib eller mellom sorafenib og cetuximab, et monoklonalt antistoff rettet mot det ekstracellulære domenet av EGF reseptor, i et panel av NSCLC og endetarmskreft (CRC) cellelinjer,
in vitro Hotell og
in vivo
, som er ledsaget av en markert og vedvarende inhibering av MAPK- og AKT-avhengige intracellulære signaler [11].
en hypotese om at behandling med sorafenib kunne overvinne den induserte EGFR-TKI-motstand ved dens evne til å blokkere flere vekstfaktor reseptor-drevet signaler. Videre fordi sorafenib blokkene B-RAF, og det kan være effektiv i kreftcellelinjer som uttrykker aktivere K-RAS-mutasjoner.
I denne studien rapporterer vi på utviklingen og på karakterisering av humane NSCLC og CRC cellelinjer med ervervet resistens mot to tyrosinkinasehemmere (TKI) rettet mot EGFR, erlotinib og gefitinib, og en TKI rettet mot EGFR, VEGFR og RET, vandetanib, og på antitumor effekten av sorafenib i disse resistente kreftcellelinjer.
Resultater
Utvikling og karakterisering av TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kreftceller
den menneskelige NSCLC Calu-3 cellelinje og den menneskelige CRC HCT116 cellelinje havn villtype EGFR gen og en aktivering K-RAS (KRASp.G13D) genmutasjon. I motsetning til de andre K-ras-mutasjoner, har denne mutasjonen blitt beskrevet som ikke påvirke følsomheten til anti-EGFR behandling, spesielt cetuximab [11]. Disse kreftcellelinjer tidligere er blitt karakterisert av vår gruppe for ekspresjon av de fire EGF-relaterte vekstfaktorreseptorer (EGFR, ErbB2, ErbB3 og ErbB4) og av tre VEGF-reseptorer (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 ), så vel som for ekspresjon av tre EGFR ligander (amfiregulin, EGF og TGFa) og av tre VEGFR ligander (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C), ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) [12]. Alle testede ligand mRNA ble uttrykt i Calu-3, og HCT116-cellelinjer. Calu-3 celler også uttrykt EGFR mRNA, mens lave nivåer av ErbB2 og ErbB3 mRNA var målbare. VEGFR-2 og VEGFR-3 mRNA-ekspresjon ble påvist i Calu-3-cellelinjen. Uttrykk av EGFR og dens spesifikke ligander antyder at i disse menneskelige kreftcellelinjer en EGFR-drevet autokrint veien er relevant for kreftcelle spredning. Faktisk, Calu-3, og HCT116-celler er vekst-hemmet ved behandling med selektiv EGFR TKI, slik som gefitinib eller erlotinib [13]. Videre har disse kreftceller uttrykker både VEGF-ligander og VEGFRs og er veksten hemmes ved behandling med anti-angiogen TKI [13].
Derfor Calu-3, og HCT116-celler ble valgt som en modell for å utforske ervervet resistens mekanismer til behandling med EGFR TKI erlotinib og gefitinib, eller med den doble EGFR /VEGFR tyrosinkinasehemmer vandetanib.
gefitinib- (GEF-R), erlotinib- (ERL-R) og vadetanib- (VAN -R) resistente cellelinjer ble oppnådd ved kontinuerlig dyrking av Calu-3, og HCT116-celler i nærvær av økende doser av hvert medikament i 12 måneder. Etter etableringen av tre forskjellige TKI-resistente Calu-3, og tre forskjellige TKI-resistent Calu-3 HCT116-cellelinjer, karakterisert vi deres resistent fenotype ved å gjøre cellen proliferasjonsanalyser, i nærvær av hver av disse inhibitorer. Som illustrert i tabell 1, en tilnærmet 10-dobbel økning i IC
50 for hver TKI-resistent cellelinje sammenlignet med foreldreceller ble observert. ERL-R, GEF-R og VAN-R Calu-3 og HCT116 humane kreftcellelinjer var kryssresistente til enten gefitinib, erlotinib eller vandetanib behandling. Vi neste bekreftet etablering av stabile TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kreftceller i et rusfritt kulturmedium. Faktisk kunne alle seks TKI-resistente cellelinjer vokse i fravær av hvert medikament over lengre tid (tre til seks måneder) og opprettholde sin TKI-resistent fenotype (data ikke vist).
for ytterligere å karakterisere de TKI-resistente Calu-3, og HCT116-cellelinjer, undersøkte vi differensial proteinekspresjon mellom villtypen, følsom Calu-3 og HCT116-celler og deres TKI-resistente derivater.
Aktiveringen av EGFR ledningene til en kompleks intracellulær signalisering som omfatter aktivering av pro-overlevelse PI3K /AKT vei og den mitogene RAS /RAF /MEK /MAPK-reaksjonsveien [13], [14]. Vi har derfor undersøkt ved immunblotanalyse disse molekylære stier. Som illustrert i figur 1, ble EGF-stimulert aktivering av EGFR effektivt blokkert i WT og ERL-R, GEF-R og VAN-R-celler som vist ved inhiberingen av EGFR auto-phosporylation (P-EGFR).
Western blotting analyse av EGFR og ned-stream signalveier i foreldremenneske Calu-3 og HCT116-celler (WT) og i deres TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-actin ble inkludert som en lasting kontroll.
Siden de aktiverte, fosforylerte formene for AKT og MAPK er sentrale intracellulære formidlere av vekstfaktor-aktivert celle overlevelse og spredning signaler [13], [14] undersøke aktiveringstilstanden av disse molekylære stier kan være av interesse for å forstå resistensmekanismer. Aktivering av MAPK og AKT med en økning i deres fosforylerte former (P-MAPK og P-AKT), så vel som en økning i Survivin proteinnivåer ble observert i alle tre TKI-resistente Calu-3-cellelinjer og i alle tre TKI-resistente HCT116 cellelinjer som i forhold til foreldre motstykke (figur 1).
samlet utgjør disse resultatene tyder på at i denne kreftcelle modell av ervervet resistens mot tre forskjellige TKI, aktivering av AKT- og MAPK-drevet intracellulære signaler kan være ansvarlig for kreftcellevekst i nærvær av enten selektiv anti-EGFR TKI, slik som gefitinib eller erlotinib, eller i nærvær av bredspektret TKI, slik som vandetanib.
Effekter av sorafenib på TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kreftcellevekst
i lys av rollen til RAF RAS og som nedstrøms mediatorer av både EGFR og VEGFR-signaler fra celleoverflaten, testet vi den anti-proliferative effekt av sorafenib, en multi- målrettet kinase-inhibitor som blokkerer aktivering av c-RAF, b-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, og PDGFR-β [8] i foreldre WT og TKI-resistente Calu -3 og HCT116 kreftceller. En signifikant inhibering av cellevekst ble observert i både WT Calu-3-celler og WT HCT116-celler og deres tilsvarende tre-TKI-motstandsdyktige derivater følgende sorafenib behandling, med en IC
50 som strekker seg fra 0. 1 til 0,5 uM, (figur 2 ) .Vi karakterisert ytterligere effekten av sorafenib behandling på intracellulær signalisering ved Western blotting. Som illustrert i figur 3, har behandling av ERL-R, GEF-R og VAN-R Calu-3, og HCT116-celler med sorafenib i 48 timer ikke påvirke de totale MEK og MAPK proteinnivåer, mens det forårsaket en markert reduksjon av fosforylert, aktiverte former av MEK (P-MEK) og av MAPK (P-MAPK). Videre undersøkte vi aktiveringsstatusen til alle molekylære mål av sorafenib ved å studere de proteinet uttrykket nivåer av C-RAF, b-RAF, c-Kit, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3 og PDGFRp, og deres phosphoryation status ved western blotting analyse. Blant alle målene for sorafenib aktivitet, resulterte bare C-RAF og B-RAF aktivert i resistente Calu-3 og HCT116 kreftcellelinjer, og derfor sterkt hemmet av sorafenib behandling (figur 3).
MTT celleproliferasjon analysene ble utført i foreldre lunge adenokarsinom Calu-3 og kolorektal kreft HCT116-celler. (WT) og i sine TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R), ble behandlet i tre dager med de indikerte konsentrasjoner av sorafenib. Resultater representerer gjennomsnitt (± SD) av tre separate eksperimenter, hver utført i fire eksemplarer.
Western blotting-analyse av C-RAF, B-RAF, MEK og MAPK aktivering etter behandling med den angitte konsentrasjon av sorafenib av lunge adenokarsinom Calu-3 og kolorektal kreft HCT116 cellene TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-actin ble inkludert som en kontroll lasting.
Effekter av sorafenib behandling på invasjon, migrering og forankrings-uavhengig vekst av TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kreftceller
det har blitt foreslått at kreftcellene gjennomgår resistente mot anti-EGFR-medikamenter, kan oppnå en mer aggressiv og metastatiske fenotype med økt evne til å invadere, migrere og til å danne kolonier i halvfast medium [15]. Derfor vurderte vi disse egenskapene i TKI-sensitive WT Calu-3 og HCT116 kreftceller og i deres TKI-resistente derivater. Som illustrert i figur 4, WT Calu-3, og HCT116-celler viste liten eller ingen evne i invasjon og migrasjon. Tvert imot alle TKI-resistente Calu-3, og HCT116-cellelinjer oppviste betydelige invasive og trekkende egenskaper. Dessuten ble deres forankrings-uavhengig koloni vekst økt fra ca. 3 ganger sammenlignet med WT-celler (figur 4). Sammen er disse resultatene tyder på at kreftcellelinjer med ervervet resistens overfor erlotinib, gefitinib og vandetanib har fått en mer invasiv og potensielt mer metastatisk atferd.
Anchorage uavhengig vekst (A), migrasjon (B) og invasjon (C), ble undersøkt i TKI-resistente Calu-3 og HCT116-derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R) etter behandling med de angitte konsentrasjoner av sorafenib. Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, hvert foretatt in triplo. Representative Bildene vises for migrasjon og invasjon evner Calu-3 WT og resistente cellelinjer.
Vi har evaluert ved effekten av sorafenib på invasive og trekk evner av TKI-resistente Calu-3 og HCT116-cellelinjer. Vi har ikke testet effekten av sorafenib behandling på TKI-sensitive WT kreft cellelinjer i betraktning av fravær av trekkfugl og invasiv evne. Det ble observert en signifikant doseavhengig inhibering av invasjon og migrasjon i alle TKI-resistente cellelinjer etter behandling med sorafenib (figur 4).
Effekter av sorafenib på TKI-resistent Calu-3 og HCT116 tumorxenografter
endelig undersøkt in vivo antitumoraktivitet av sorafenib i nakne mus som bærer WT Calu-3 og HCT116 eller TKI-resistente Calu-3, og HCT116-cellelinjer som ble dyrket subkutant som xenotransplantater. I WT Calu-3 og HCT116 tumorxenografter, behandling med sorafenib forårsaket en signifikant reduksjon i tumorstørrelse sammenlignet med kontroll ubehandlede mus. For eksempel, på dag 35 fra starten av behandlingen, den midlere tumorvolum hos mus som bærer WT tumorxenografter og behandlet med sorafenib var henholdsvis 38% og 31% i Calu-3 og HCT116 sammenlignet med kontroll ubehandlede mus (figur 5, 6 ). Også i mus som bærer ERL-R, GEF-R eller VAN-R Calu-3 og HCT116 tumorxenografter, behandling med sorafenib induserte en signifikant reduksjon i tumorvekst (figur 5, 6). I dette henseende, på dag 35 fra starten av behandlingen, den midlere tumorvolum i sorafenib-behandlede mus varierte mellom 27% og 40%, sammenlignet med kontroll ubehandlede mus.
A, foreldre (WT) Calu-3 kreftceller; B, GEF-R Calu-3 kreftceller; C, VAN-R Calu-3cancer celler; D, ERL-R Calu-3-kreftceller. Atymiske nakne mus ble injisert subkutant inn i den dorsale flanke med 10
7 kreftceller. Etter 7 til 10 dager (gjennomsnittlig tumor størrelse, 75 mm
3), ble musene behandlet som indikert i materialer og metoder i 5 uker. Hver behandlingsgruppe besto av 8 mus. Data representerer gjennomsnittet (± SD). Elevens
t
test ble brukt for å sammenligne kreft størrelser mellom ulike behandlingsgrupper på dag 35 etter behandlingsstart. A, Calu-3 WT: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001); B, Calu-3 GEF-R: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001). C, Calu-3 VAN-R: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001); D, Calu-3 ERL-R. Sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001)
A, Foreldre (WT) HCT116 kreftceller; B, GEF-R HCT116 kreftceller; C, VAN-R HCT116 kreftceller; D, HCT116 kreftceller. Atymiske nakne mus ble injisert subkutant inn i den dorsale flanke med 10
7 kreftceller. Etter 7 til 10 dager (gjennomsnittlig tumor størrelse, 75 mm
3), ble musene behandlet som indikert i materialer og metoder i 5 uker. Hver behandlingsgruppe besto av 8 mus. Data representerer gjennomsnittet (± SD). Elevens
t
test ble brukt for å sammenligne kreft størrelser mellom ulike behandlingsgrupper på dag 35 etter behandlingsstart. A, HCT116 WT: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001); B, HCT116: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001). C, HCT116 VAN-R: sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001); D, HCT116 ERL-R. Sorafenib versus kontroll (tosidig p 0,001)
Diskusjoner
Aktivering av EGFR og VEGFR trasé spille en nøkkelrolle i utviklingen og progresjon av flertallet av epiteliale kreftformer inkludert NSCLC og CRC. Men bare en undergruppe av pasienter fordelene med behandlinger med legemidler rettet mot EGFR eller VEGFR trasé [16]. Ja, selv i utgangspunktet pasienter som responderer sekundær eller ervervet resistens oppstår forårsake kreft progresjon og behandlingssvikt. Flere molekylære mekanismer har blitt foreslått for å forklare oppkjøpet av kreft celle motstand mot molekylært målrettede anti-kreft narkotika [16].
Kreft celle motstand mot EGFR-antagonister kan skyldes flere årsaker. Verts relaterte mekanismer, slik som defekt immunsystem-aktivitet, hurtig metabolisme eller dårlig absorpsjon, er ansvarlig for indre eller primær motstand. Videre er genetisk ustabilitet av disse cellene genererer kreft celle kloner med en ervervet resistens følgende langvarig eksponering for EGFR-hemmere. Siden EGFR antagonister forstyrrer aktiveringen av flere intracellulære reaksjonsveier som kontrollerer cellevekst, overlevelse, apoptose, metastaserende evne, invasjon og tumorindusert angiogenese, er det klart at flere forskjellige molekylære endringer kan være ansvarlig for utvikling av resistens mot disse inhibitorene [ ,,,0],16].
i denne studien fant vi at kreftceller som utvikler resistens mot EGFR tyrosinkinasehemmere etter lang tid behandlingen (ervervet resistens) utstillings aktivert RAS /RAF /MAPK og AKT veier. EGFR-uavhengig aktivering av disse nedstrøms reaksjonsveier som gjør kreftceller ufølsomme til EGFR inhibering og representerer en av de mest vanlige rapportert årsaker til motstand mot EGFR-målrettet terapi hos faste tumorer.
konstitutive aktivitet på minst ett av disse to baner er blitt demonstrert å være i stand til definerer en resistent fenotype upåvirket av behandlingen med gefitinib og cetuximab [2], [17].
Vedvarende fosforylering av RAS /RAF /MAPK og /eller AKT trasé kan forklares med aktiveringen av andre enn EGFR celleoverflatereseptorer som insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R) og MET [18] – [21], som er kjent for å være iperexpressed eller aktivert i nærvær vedvarende hemming av EGFR.
Videre økt reseptor-uavhengig aktiviteten av RAS /RAF /MAPK og /eller AKT trasé kan resultatene fra direkte genamplifisering, aktivering /inaktive mutasjoner eller tap av molekylære regulator [ ,,,0],22], [23].
imidlertid, mens hemming av AKT-banen ikke forstyrrer spredning av resistente celler, sterkt reduserer inhibering av RAF /MEK /MAPK-reaksjonsveien ved sorafenib behandling cellevekst og overlevelse . Faktisk, blant alle de molekylære mål av sorafenib, bare C-RAF og B-RAF resulterte aktivert i resistente cellelinjer trolig av oppstrøms reseptorer ennå ikke testet i dette arbeidet; Men denne informasjonen tyder på at aktivering av RAF-avhengige intracellulære signaler kan være en viktig mekanisme i oppkjøpet av resistens mot anti-EGFR terapi.
RAS /RAF /MAPK signalveien er et lovende terapeutisk mål gitt sin sentral rolle i reguleringen av pattedyrcelleformering, videresending av ekstracellulære signaler fra ligand-bundne reseptor-tyrosin-kinaser ved celleoverflaten til kjernen via en kaskade av spesifikke hendelser fosforylering. Mutasjons status av RAS og B-RAF-gener har blitt demonstrert å påvirke sensitiviteten av tumorcellelinjer til inhibitorer av EGFR [24]. Men terapeutisk målretting av RAS veien har så langt vært mislykket. RAF serin-treonin kinaser er de viktigste effektorer av RAS og blir ansett som et viktig mål for kreftbehandling. Midler som sorafenib som omgår RAS og hemmer effektor molekyler nedstrøms av mutant GTPase (f.eks RAF) blir vurdert. Prekliniske data har antydet at sorafenib hemmer cellevekst ved å fremkalle G1 arrest hos NSCLC cellelinjer uavhengig av KRAS genotype [8].
En annen mulig mekanisme for motstand mot EGFR hemming kan være en økt angiogen potensial gjennom økt endotelceller spredning og permeabilization. På grunnlag av denne informasjon, har flere prekliniske studier blitt realisert med den hensikt å utforske effekten av en kombinert målretting av erbB og VEGF-trasé ved hjelp av ulike metoder [25] – [29]. I tillegg til muligheten til å bruke anti-EGFR terapi i kombinasjon med anti-VEGF-legemidler, ble en serie av tyrosin-kinaser som blokkerer både EGFR og VEGF-reseptor TK utviklet, slik som vandetanib, noe som har vist signifikant aktivitet som monoterapi og i kombinasjon med tradisjonelle kjemoterapeutika i flere humane tumortyper [27] – [29]
Ofte EGFR-hemmer bestandig menneskelig kreft cellelinjer utstillingen, som vanlig funksjon, VEGFR overekspresjon, økt sekresjon av VEGF og placenta vekst. faktor, og utvidet migrasjon evner. Sorafenib hemmer flere RTK’er som deltar i neovaskularisering, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) -2 og VEGFR-3 [30]. Inhibering av angiogenese kan således forventes å bidra til hemning av tumorvekst av dette stoffet i tillegg til dens virkninger på RAF signalering. Selv om sorafenib ble tidligere vist å hemme veksten av en rekke humane tumorxenografter i mus [8], har det vært vanskelig å måle de relative bidragene fra dets anti-angiogen aktivitet og dens direkte antitumoraktivitet mediert av RAF inhibering. Videre, i vårt arbeid, utvikling av humane kreftceller som er resistente mot vandetanib, utelukkes muligheten for at sorafenib’efficacy kan være avhengig av inhibering av VEGFR.
Bevis for en positiv interaksjon mellom sorafenib og anti-EGFR-narkotika har nylig blitt gitt av vår gruppe [12]. Prekliniske bevis støttet en sterk anti-proliferative og anti-trekkende effekter i NSCLC og CRC kreftcellelinjer følgende kombinasjon med sorafenib pluss maur-EGFR narkotika [12]. Videre en fersk klinisk fase II studie støttet kombinasjonen av erlotinib og sorafenib hos eldre pasienter med avansert NSCLC i lys av høyere 1-års overlevelse [30].
I denne studien har vi gitt bevis at sorafenib er aktiv i å hemme tumorcellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
av menneskelige kreftceller resistente mot inhibitor av EGFR og /eller VEGFR. Aktiviteten av sorafenib er strengt knyttet til evnen til å blokkere RAF signaliserer gjennom RAS /RAF /MEK /MAPK veien.
Metoder
Cellelinjer, legemidler og kjemikalier
det humane NSCLC Calu-3, og de humane CRC HCT116-cellelinjer ble gitt av American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opprettholdt i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies, Gaithersburg, MD) i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Gefitinib og vandetanib ble gitt av Astrazeneca, Macclesfield, UK; erlotinib ble gitt av Roche, Basel, Sveits; sorafenib ble levert av Bayer Schering Pharma, Leverkusen, Tyskland. Primære antistoffer mot P-EGFR (Tyr1173), EGFR, P-MAPK44 /42 (Thr202 /Tyr204), MAPK44 /42, P-AKT (Ser473), AKT, P-MEK (Ser217 /221), MEK, PB-RAF (ser 445), P- C-RAF (ser 338), survivin ble hentet fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA. Cell invasjon og migrasjon analysesett ble oppnådd ved Chemicon, Millipore, CA, USA. Alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma Aldrich, MO, USA.
Etablering av Calu-3 og HCT116 kreftcellelinjer med ervervet resistens mot ulike TKI
I løpet av en periode på 12 måneder, human Calu -3 lunge adenokarsinom-celler og humane HCT116 kolorektal karsinom-celler ble kontinuerlig utsatt for økende konsentrasjoner av enten gefitinib, erlotinib eller vandetanib, som tidligere beskrevet (12). Startdosen var den dose som forårsaker inhibering av 50% av kreftcellevekst (IC
50) for hver EGFR inhibitor (dvs .: erlotinib, 3 uM, gefitinib, 6 pM; vandetanib, 1 pM). Medikamentdosen ble gradvis økt til 15 uM i omtrent to måneder til 20 uM etter andre to måneder til 25 uM etter ytterligere to måneder, og til slutt til 30 uM for en total av 12 måneder. De etablerte resistente kreftcellelinjer ble deretter holdt i kontinuerlig kultur med den maksimalt oppnådde dose av hver TKI som tillot celleproliferasjon (30 mikrometer for hvert medikament).
Celleproliferering analysen
Kreftceller var seedet i 96-brønners plater og ble behandlet med ulike legemidler, som for eksempel erlotinib, gefitinib, vandetanib eller sorafenib i 72 timer. Celleproliferasjon ble målt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. IC
50 ble bestemt ved interpolering fra dose-responskurvene. Resultater representerer medianen av tre separate forsøk hver utført i fire eksemplarer.
Western blotting-analyse
Etter behandling, kreftcellene ble lysert med Tween-20 lysis buffer (50 mmol /L HEPES, pH 7,4 , 150 mmol /l NaCl, 0,1% Tween-20, 10% glycerol, 2,5 mmol /l EGTA, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /l DTT, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, og 10 ug /ml leupeptin og aprotinin ) og ultralydbehandlet. Like mengder protein ble analysert ved SDS-PAGE. Deretter, proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner og analysert ved hjelp av spesifikke primære antistoffer, som angitt i forsøket. Proteiner ble oppdaget via inkubasjon med pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer og ECL chemiluminescence deteksjonssystemet.
Invasion analysen
Den invasive evne in vitro ble målt ved hjelp av Transwell kamre, i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene sådd ut på membranen i det øvre kammer i transwell ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 /ml i 500 ul av RPMI-medium og ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med de angitte doser av sorafenib i 24 timer. Mediet i det øvre kammer var serumfritt. Mediet i det nedre kammer inneholdt 10% FBS som en kilde av chemo-tiltrekningsmidler. Celler som passerte gjennom Matrigel belagt membran ble farget med Cell Stain løsning som inneholder krystallfiolett leveres i transwell invasjonen analysen (Chemicon, Millipore, CA) og fotografert etter 20 timers inkubering. Absorbans ble målt ved 562 nm med en ELISA-leser etter oppløsning av fargede celler i 10% eddiksyre. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Migrasjon analysen
Cell migrasjon ble vurdert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig chemotaxis analysen. Kort fortalt ble cellene inkubert i RPMI serumfritt medium for 24 hånd var ubehandlet eller behandlet med de angitte doser av sorafenib, etter som de ble løsnet fra kolbene, suspendert i quenching medium (serumfritt medium inneholdende 5% bovint serumalbumin) og EDTA, og sådd ut i Boyden migrering kammerinnsatser plassert i en 24-brønns plate. Innsatsene inneholder en mikroporøs membran med en 8 um porestørrelse. Setter inn ble plassert over brønner som inneholder serumfritt medium pluss kjemoterapi-tiltrekkende (10% FBS). Etter en 48-timers behandlingsperiode, ble celler /media fjernet fra oversiden av migrasjon kammeret innsatsen og kammeret ble plassert i brønnene i en ny 24-brønners plate inneholdende celle løsgjøring oppløsning. Etter inkubering i 30 minutter ved 37 ° C, ble innsatsen kastes, og en løsning av lyseringsbuffer og CyQuant GR fargestoff ble tilsatt til hver brønn. CyQuant er en grønn fluorescerende fargestoff som oppviser sterk forbedring av fluorescens når de er bundet til cellulære nukleinsyrer utgitt av lyseringsbuffer, slik at vurderingen av den relative antall migrerte celler. Fluorescens ble bestemt med en fluorimeter på 480/520 nm. Analyser ble utført in triplo.
Vekst i bløt agar
Cells (10
4 celler /brønn) ble suspendert i 0,5 ml 0,3% Noble agar Difco (Difco, Detroit, MI) supplert med fullstendig kulturmedium. Denne suspensjonen ble lagt over 0,5 ml 0,8% agar-medium basislag i 24 multibrønnskåler (cluster Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sorafenib. Etter 14 dager ble cellene farget med nitro blå tetrazolium (Sigma, St. Louis, MO) og kolonier større enn 0,05 mm ble tellet.
