Abstract
Bakgrunn
Den typiske vestlige dietten er ikke balansert i methyl næringsstoffer som regulerer nivået på metyldonor S-adenosylmethionine (SAM) og dens deriverte metabolitten S-adenosylhomocystein (SAH ), som i sin tur kan styre aktiviteten av visse metyltransferaser. Fôring gnagere med aminosyren definert og metyl-ubalansert kosthold reduserer lever SAM og forårsaker leverkreft. RIZ1 (PRDM2 eller KMT8) er en tumor suppressor og funksjoner i transkripsjonen undertrykkelse av metylering histon H3 lysin 9.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at en metyl-balansert kosthold konferert ekstra overlevelse fordelene sammenlignet med en tumor-induserende metyl-ubalanse diett bare i mus med villtype RIZ1 men ikke i mus som mangler RIZ1. Mens fravær av RIZ1 var tumorigent i mus matet balansert kosthold, sin tilstedeværelse ikke hindre tumordannelse hos mus matet ubalansert kosthold. Microarray og genuttrykk analyse viste at, i motsetning til de fleste av sine beslektede enzymer, ble RIZ1 oppregulert av metyl-balansert kosthold. Metyl-balansert kosthold ikke fullt undertrykke onkogener som c-Jun i fravær av RIZ1. Høyere RIZ1 aktivitet var assosiert med større H3 lysin 9 metylering i RIZ1 målgener som vist ved kromatin immunoutfelling analyse.
Konklusjon /Betydning
Dataene identifisere RIZ1 som en kritisk mål av metyl-balansert kosthold i kreftforebygging. Den molekylære forståelse av kostkreftutvikling kan hjelpe folk å ta informerte valg på diett, noe som kan sterkt redusere forekomsten av kreft
Citation. Zhou W, Alonso S, Takai D, Lu SC, Yamamoto F, Perucho M, et al. (2008) Krav til RIZ1 for Cancer Prevention av metyl-balansert kosthold. PLoS ONE 3 (10): e3390. doi: 10,1371 /journal.pone.0003390
Redaktør: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 02.06.2008; Godkjent: 16 september 2008; Publisert: 13 oktober 2008
Copyright: © 2008 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH bevilgning CA105347 til SH, CA63585 til MP, CA087069 til FY, og DK51719, AA13847 og AT001576 til SCL
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
den typiske vestlige dietten er knyttet til en tredjedel av alle kreftdødsfall i USA [1]. Dietten er rik på kjøtt og lite grønnsaker og frukt. Det er ikke balansert i metyl- næringsstoffer eller lav i folsyre. Diett næringsstoffer, og deres metabolske mellomprodukter og produkter, påvirker direkte aktiviteten av mange cellulære enzymer. En klasse av slike enzymer er SAM-avhengige metyltransferaser, en bred gruppe av enzymer som har en egenskap til felles, ved bruk av S-adenosylmethionin (SAM) som metylgruppedonor. Den cellulære nivået av SAM er avhengig av inntak av metylgruppen donorer, slik som metionin, folsyre, vitamin B6, B12, og kolin. Noen metylering reaksjoner blir hemmet ved lavt nivå SAM eller høyt nivå av produktet inhibitor S-adenosylhomocystein (SAH). Metyl ubalansert diett som er lav i folsyre, metionin, eller kolin er kjent for å senke SAM nivå og SAM /SAH-forhold.
Mate gnagere med aminosyren definert og metyl-ubalanse diett reduserer hepatisk SAM og forårsaker leverkreft [2], [3], [4]. De molekylære mekanismene bak sammenhengen mellom kosthold og kreft er fortsatt dårlig forstått. Vi har tidligere foreslått at metyl-balansert diett forhindrer kreft ved aktivering av histon lysin metyltransferase (KMT) klasse tumor suppressorer som RIZ1 (PRDM2 eller KMT8) [5], [6]. De RIZ1 tumor-suppressor-funksjoner i transkripsjonen undertrykkelse av metylering av histon H3-lysin-9 [7], [8], [9]. Her har vi avgjort om RIZ1 kan være et kritisk mål av metyl balansert kosthold i kreftforebygging. Vi utførte også mikromatriser og analyse av genuttrykk for å studere effekten av kosthold på RIZ1 og andre gener. Effekten av diett på RIZ1 metylering Enzymaktiviteten ble analysert ved immunoutfelling under kromatin assay. Resultatene tyder på at RIZ1 er regulert av kosthold og kan være et kritisk mål av metyl-balansert diett i kreftforebygging.
Resultater
Vi sammenlignet RIZ1 mutant og villtype mus på en metyl-balansert diett (diett 1), mot en ubalansert kosthold mangler metionin og kolin (diett 2). Metyl-ubalanse diett 2 (se tabell Tilsetnings S1) er kjent for å redusere hepatisk SAM og forårsake lever-kreft hos gnagere [2], [3], [4]. Således Dette metyl-ubalanse diett resulterte i leversvulster og redusert overlevelse sammenlignet med metyl-balansert diett (figur 1A). De fleste av de døde eller døende dyr som var egnet for obduksjon analyse ble funnet å ha hepatocarcinomas. I motsetning til dette, i fravær av villtype RIZ1, var det ingen forskjell i overlevelse uavhengig av diett (figur 1B). Disse RIZ1 knockout dyr utviklet hovedsakelig hepatocarcinomas uavhengig av kosthold. Derfor, mens balansert kosthold en overdro ytterligere overlevelsesfordeler sammenlignet med ubalansert diett 2 i mus med villtype RIZ1, det klarte ikke å gjøre det i mus som mangler RIZ1.
A. Levedyktigheten til RIZ1 villtype dyr på diett en mot en diett 2. B. levedyktighet RIZ1 muterte dyr på diett en mot en diett 2. C. levedyktighet RIZ1 villtype og muterte dyr på diett 1. D. levedyktighet RIZ1 villtype og mutante dyr på diett 2. de fleste av de døde eller døende dyr som var egnet for obduksjon analyse ble funnet å ha tumorer. Grafen ble trukket med Prism statistikk program (GraphPad Software) basert på Kaplan-Meyer teori.
P
verdier ble beregnet ved Fishers eksakte test (2 tailed) med overlevelsesraten i alderen 20 til 22 måneder.
Dataene viser også at, i samsvar med tidligere arbeid [7 ], RIZ1 + /+ mus hadde lavere dødelighet og tumor forekomst enn RIZ1 – /- mus når matet metyl-balansert kosthold en (figur 1C). Men når matet ubalansert diett 2, RIZ1 + /+ mus viste lignende dødelighet som RIZ1 – /- mus (figur 1D). Således tumor suppressor funksjon av RIZ1 er avhengig av en metyl-balansert diett. De tilsvarende overlevelse av RIZ1-mangelfulle og villtype dyr på diett 2 (figur 1D) antyder også at kapasiteten på diett en å gi ytterligere overlevelsesfordeler sammenlignet med diett 2 i RIZ1 villtype (figur 1A), men ikke i RIZ1-mangel dyr (Figur 1b) er ikke på grunn av triviell grunn at RIZ1-mangelfulle dyr kan være for syk generelt å svare på diett 1.
for å fastslå effekten av diett på RIZ1, undersøkte vi RIZ1 genekspresjon i leveren målvevet ved hjelp av kvantitativ RT-PCR og Western blot-analyse. RIZ1 mRNA nivået ble nedregulert 4,2 ganger etter behandling med diett 2 for 2 måneder (Supplementary tabell S2). Den downregulation var ikke tydelig på en måned på diett 2, men ble klart på 2, 4 og 6 måneder (Supplementary tabell S2). Den nedregulering av RIZ1 av metyl-ubalanse diett ble bekreftet ved western blot-analyse (Figur 2). I motsetning til RIZ1, jo kortere RIZ2 proteinet som mangler den PR /SET domene [10] ble ikke signifikant påvirket av dietten.
A. Hele celleekstrakter av leveren fra dyr på diett 1 og diett 2 i to måneder ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av et antistoff som reagerer med både RIZ1 og RIZ2 proteiner. Western blot bruker beta-aktin antistoff tjente som lasting kontroll. B. Kvantifisering av protein nivåer av densitometry analyse. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 4 dyr pr undergruppe. *
P
= 0,012 (t-test, to tailed).
Vi undersøkte også andre metyltransferaser og relaterte enzymene ved kvantitativ RT-PCR og DNA microarray analyse. Totalt 25 histon metyltransferaser ble undersøkt, inkludert minst ett enzym som er spesifikt for hver av de aminosyrerester som er kjent for å være metylert. Ingen av disse enzymene, bortsett RIZ1, var signifikant nedregulert ( 2 ganger). Ved 2 måneders diett 2 behandling (Supplementary Tabell S2)
For å kunne fastslå om RIZ1 uttrykk er følsom for SAM nivåer, brukte vi den MATA1 knockout mus modell [11]. Disse dyrene har lavere (3-4 ganger) lever SAM og også utvikle leverkreft. Kvantitativ RT-PCR analyse av dyrene på 4,5-5,5 måneders alder viste at RIZ1 uttrykk i villtype lever (n = 6) var 2,0 ganger høyere enn i MATA1 knockouts (n = 5, p = 0,03, Student t test, to tailed), kan sammenlignes med fold reduksjon for de samme alderen villtype mus på diett 2 (Supplerende tabell S2).
Vi neste undersøkt om RIZ1 målgener ble regulert av kosthold. DNA microarray analyse av leveren hos RIZ1 villtype dyrene på 2 måneder med diett behandling avdekket en liste over 1636 gener som ble berørt av kosthold med mer enn 2 ganger (Supplementary tabell S3). DNA microarray analyse av leveren hos RIZ1 knockout dyr identifisert 97 mulige RIZ1 målgener som viser mer enn to ganger forskjell mellom villtype og knockout (Supplementary tabell S4). Av disse 29 var også til stede i listen over gener reguleres av diett, noe som indikerer en betydelig berikelse av RIZ1 målgener i listen over diett-regulert gener (29/97 versus 1636/48000,
P
0,0001, Chi kvadrat test, to tailed). Genene av interesse som ble oppregulert ved både RIZ1 knockout og metyl-ubalansert kosthold inkluderer c-Jun, c-Fos, og Ctgf. Noen av disse genene kan spille en direkte rolle i leverkreftformer (dvs. c-Jun) [12]. Effekten av RIZ1 knockout eller diett på ekspresjonen av disse genene ble bekreftet ved kvantitativ RT-PCR-analyse (tabell 1). Resultatene tyder på at nedregulering av RIZ1 av dietten 2 ble assosiert med deregulering av RIZ1 målgener.
Siden RIZ1 uttrykk ikke ble vesentlig endret ved diett to på en måned behandling (Supplementary Tabell S2), et uttrykk endringer av målgener av RIZ1 på en måned diett behandling kan gjenspeile endringer i RIZ1 aktivitet snarere enn i uttrykket nivå. Vi valgte syv RIZ1 målgener og bestemmes sine uttrykk nivåer på enten en måned eller 2 måneder diett behandling. Som vist i tabell 1, ble seks av de syv gener funnet oppregulert med diett 2 i en måned diett behandling. Dataene tyder på at kostholdet 2 forårsaket deregulering av RIZ1 målgener før betydelig redusere RIZ1 uttrykket nivåer.
neste brukte kromatin immunoprecipitation (chip) analyse for å undersøke endringer i histone metylering på RIZ1 målgener som følge av redusert RIZ1 aktivitet. Vi brukte en RIZ1-spesifikt antistoff ab9710 (Abcam) som ikke reagerer med RIZ2 (se fig Tilsetnings S1 for en Western blot av RIZ1 av dette antistoff). Som vist i figur 3A, ble det c-Jun promoteren proksimalt bundet av RIZ1 og viste høyere H3 lysin 9 monomethylation i RIZ1 villtype versus knockout lever. RIZ1 bandt ikke til den fjerne regionen av c-Jun promoteren eller promotoren av Elovl3 genet som ikke var undertrykt av RIZ1. På en måned diett 2 behandling, ble H3K9me1 av c-Jun promoter redusert selv om RIZ1 binding ikke ble endret, noe som tyder igjen på at RIZ1 aktivitet ble redusert selv når RIZ1 uttrykk var på normalt nivå (figur 3).
En . Løselig kromatin ble fremstilt fra lever av RIZ1 villtype og knockout dyr. Immunoutfelling ble utført ved å bruke de angitte antistoffer. DNA ble amplifisert ved anvendelse primersett som dekker de proksimale eller distale promoter-regioner av c-Jun og Elovl3 genet. B. Løselig kromatin ble fremstilt fra lever fra villtype dyr på enten diett 1 eller diett 2 for en måned. Immunoutfelling ble utført ved å bruke de angitte antistoffer. DNA ble amplifisert ved anvendelse primersett som dekker de proksimale eller distale promoter-regioner av c-Jun og Elovl3 genet. En representant datasett er vist av fire eksperimenter utført.
Vi har også undersøkt samlede DNA metylering endringer i respons til metyl-ubalansert kosthold i DNA fra lever av dyr på 15 måneders behandling. Mens vi funnet at kostholdet 2 redusert samlet DNA metylering (Supplementary figur S2), fant vi ikke endringer i DNA metylering (enten hyper eller hypo metylering) i enkelt tilfeldig CpG rike regioner (Supplerende Figur S3) ved hjelp av teknikken av
Not1 -Mse1
MS-AFLP (metylering sensitive forsterket fragment lengde polymorfisme) [13]. Ved Western blot analyse, fant vi ikke vesentlige endringer ( 2 ganger). I metylering av H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3, H4K20me1, og H4K20me2 i leveren av dyr som var på diett 2 i seks måneder (data ikke vist)
Diskusjoner
Siden bare RIZ1 og 4 små molekyl metyltransferaser (GNMT, GAMT, NNMT, og TEMT) ble funnet nedregulert med diett 2 i en ikke-partisk screening ved hjelp av både DNA microarray og RT-PCR metoder (se Utfyllende tabell S2), undersøkte vi om disse 5 enzymene delte noen felles egenskaper som kan forklare deres følsomhet for diett. Vi fant fra litteratur Km verdier for SAM for 3 av de 4 små molekyl metyltransferaser og alle tre viste seg å ha høy Km verdi ( 49 mm) (se Tilleggs tabell S5). For det store antallet metyltransferaser som ikke ble regulert ved hjelp av diett, identifiserte vi Km verdier for syv av dem og alle syv har Km-verdier lavere enn 10 um (se tabell Tilsetnings S5). Således er det en signifikant sammenheng mellom høy Km for SAM og nedregulering av diett 2 (
P
= 0,0083, Fishers eksakte test, 2-tailed).
Hepatisk SAM-konsentrasjonen er -60 uM og metyl-ubalanse diett bevirker vanligvis en 1,5 til 3 gangers fall i SAM-nivåer [3], [14], noe som ville være fortsatt er høy nok til å tillate nær maksimal aktivitet for de fleste metyltransferaser med lav Km for SAM, men i vesentlig grad vil inhibere de enzymer med høy km verdier. Fortrinns downregulation av diett to av de metyltransferaser med høy Km for SAM kan gjenspeile et tilbakemeldinger hemming på egenhånd genekspresjon ved unliganded eller ubrukte enzymer. Den kanoniske SET domene deles av de fleste kmts har lav Km for SAM [15]. Men RIZ1 kan være et unntak siden SET domenet er forskjellig fra andre [16], [17].
Mange effekter av metyl-ubalansert kosthold, for eksempel fett opphopning, protein kinase C-aktivering, unormal cellefornyelsen, oksidativt stress, lav SAM /SAH ratio, DNA hypometylering, og uracil inkorporering i DNA eller mutasjon, er forhindret av en metyl-balansert kosthold. I tillegg påvirker en metyl-ubalansert diett ekspresjonen av mange gener som er vist her. Vår observasjon at mangel av et enkelt gen kan nøytralisere kreft forebyggende fordelen av en metyl-balansert diett, viser at i det minste en av de mange effektene av en slik diett kan spille en hastighetsbegrensende rolle i forebygging kreftprosessen.
fra alle disse observasjonene kan det postulert at den molekylære vei av carcinogenese med metyl-ubalanse diett kan være følgende: metyl-ubalanse diett – kronisk lav SAM /SAH-forholdet i de fleste celler av en diett-responsive målvevet og -inhibition nedregulering av RIZ1 i de fleste cellene i målet vev – oppregulering av prosurvival og progrowth onkogener som c-Jun i de fleste cellene i målet vev – stokastiske akkumulerte genetiske og epigenetiske forandringer i en enkelt celle – klonal spredning av én celle – kreft. I denne multi-celleopprinnelse modell av kreft initiering [6], inaktivering av RIZ1 og oppregulering av enkelte onkogener så som c-Jun i de fleste celler av en diett-responsive vev kan ikke være tilstrekkelig til å føre til klonal proliferasjon, men kan tillate at et stort basseng på mindre enn fullstendig normale celler for å være mer utsatt for klonal proliferasjon i respons til stokastisk sterke onkogene mutasjoner i en enkelt celle. I motsetning til dette, fullstendig normale celler kan gjennomgå begynnende alderdom eller celledød som respons på onkogene mutasjoner [18]. Således kan en hastighetsbegrensende trinn i kreftforebygging være vedlikehold av RIZ1 aktivitet i de fleste cellene i et mål vev [6].
Materialer og metoder
Dyr, dietter, og vev
RIZ1 knockout mus i 129Sv /C57BL6 bakgrunn ble krysset til 129Sv mus for 8 generasjoner til å produsere RIZ1 knockout mus i 99,625% 129Sv bakgrunn. Disse RIZ1 – /- mus ble deretter krysset med p53 +/- 129Sv mus (fra Jackson Laboratory) for å generere RIZ1 +/- p53 +/- mus i 129Sv bakgrunn. Dyr av de følgende genotypene ble opprettholdt for eksperimentell bruk: RIZ1 – /- p53 +/- og RIZ1 + /+ p53 +/-. Innføring av p53 heterozygot mutasjon var ment å forkorte ventetiden for tumorutvikling i RIZ1 knockout mus [7]. Hannhunder av hver genotype ble randomisert i to grupper av ~ 30 hver. Starter på ca 4 ukers alder, ble alle dyr matet med en metyl-balansert og aminosyre-definert diett eller diett 1. Etter på denne dietten i en uke, en gruppe dyr fortsatte å bo på diett 1 for den gjenværende perioden av forsøket. Den annen gruppe ble foret med metionin og kolin mangelfull diett eller diett 2. Sammensetningen av dietter (se tabell Tilsetnings S1) var i det vesentlige de samme som de som vanligvis anvendes innen feltet [2], [3], [4]. Dietter ble lagret ved 4 ° C og gitt ad libitum til to ganger i uken erstatning. Animal vekst ble etterfulgt av månedlige kroppsvektmåling for opp til 15 måneder. Ingen signifikant forskjell i kroppsvekt ble notert for forskjellige genotyper. Dyr på diett 2 viste redusert (15% mindre ved 15 måneders alder) kroppsvekt i forhold til dyrene på diett 1. Denne svak effekt av diett 2 på kroppsvekt ble i likhet med hva andre har funnet [2]. Kaplan-Meyer overlevelseskurver ble plottet med Prism statistikkprogram (GraphPad programvare). De levervev ble fiksert for histologisk analyse eller hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil anvendelse for biokjemiske analyser. Vev faste i 10% formalin ble rutinemessig behandlet for parafin embedding, seksjonert og farget med hematoxylin og eosin. For målinger av kosttilskudd effekter på genekspresjon og histon metylering, ble ekstra dyr matet diett 1 eller 2 for 1 til 6 måneder før han ble ofret for vev samling.
Etisk godkjenning for alle arbeider på dyr ble hentet fra Animal forsknings~~POS=TRUNC The Burnham Institute for Medical Research.
Western blotting
Vev ble homoginized i RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,25% Na-deoxycholate, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, pluss proteinaseinhibitorer). Hele Lysatene ble deretter blandet med SDS gel lasting buffer etterfulgt av SDS gel fraksjonering og western blotting. RIZ antistoff var kanin serum KG7.1S mot RIZ1 aa 245-573 som reagerer med både RIZ1 og RIZ2, som beskrevet tidligere (tilgjengelig fra Abcam ab3790) [19]. For western blot mot RIZ1 men ikke RIZ2 brukte vi Abcam RIZ1 antistoff ab9710. Antistoffer for denaturert histoner var fra Abcam og Upstate.
Kvantitativ RT-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av Magna Lyser Grønne perler (Roche) og RNAmini kit (Qiagen). Kvantitativ RT-PCR-analyser (SYBR grønn) ble utført ved hjelp av Mx3000P QPCR system av Stratagene. Alle genspesifikke primere ble bekreftet til å gi et enkelt bånd med forventet størrelse. Cyklofilin A (PPIA) genet fungerte som kontrollgruppe for RNA beløp. Dette genet ble ikke regulert av kosthold eller RIZ1 knockout som indikert av microarray analyse.
DNA microarray analyse
cDNA syntetisert fra total RNA ble hybridisert med Sentrix Mouse-6 Expression BeadChip fra Illumina inneholder 48.000 genet arrays. Data ble erholdt fra replikate biologiske prøver. Data normalisering ble utført ved anvendelse av kubiske spline normalisering.
ChIP analyse
kanin antistoff som er spesifikt for RIZ1 men ikke RIZ2 fra Abcam (ab9710) ble brukt til spon analyse av RIZ1 bindingen til målgener. Antistoffer for methylationed histoner var fra Abcam (ab9045 for H3K9me1, ab8898 for H3K9me3, ab9051 for H4K20me1) og Upstate (07-212 for H3K9me2). Levervev (~ 30 mg per antistoff immunoutfelling) ble hakket i stykker ved hjelp av barberblad og kryssbundede i 1% formaldehyd ved romtemperatur i 15 min. Kromatin ble fragmentert til en midlere størrelse på 700 bp ved hjelp av en Misonix XL2020 sonikator. Brikken analysesett fra Upstate ble brukt. For PCR, brukte vi følgende primerpar: 5′-AAATCTCTGGTTTCCAGGTACAGC-3 «(-801 til -777) og 5’GAGAAAGGGCTGAATGATCTGAGT-3» (-595 til -571) for c-Jun proksimale promoter-regionen, og 5 « -GTGTGGGGGTAGAGGAGTGA-3 «(-4337 til -4317) og 5′- AGTGTCACTGGACCCTCACC -3′ (-4128 til -4108) for c-Jun distal region. For PCR av Elovl3 genet promoter, brukte vi primerpar 5»-CCCCATTTTTCTCTCCAACA-3 «(-768 til -748) og 5′-CCAAGCTGGACCATAAGGAA-3» (-578 til -558) for Elovl3 promoter-regionen, og 5 « -CCAGGCTGTCCTGAAACTAATTCT-3 «(-8325 til -8301) og 5′-CTGTAGACCAGGTGACTGCAAACT-3» (-8132 til -8108) for Elovl3 distal regionen.
DNA metylering analyse
Genomisk DNA ble ekstrahert fra vevene ved hjelp av standardprosedyrer. Analyse av metylering i CpG rike regioner av
Not1-Mse1
MS-AFLP metoden ble som tidligere beskrevet [13]. Genomisk metyl-cytosin innholdet ble analysert ved metylering enzymet Sss1 metoden [20].
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Sammensetning av aminosyren definert og metyl-balansert basal diett (Teklad Produkt nr td 99366). Dette er referert som diett 1. Den metyl-ubalanse diett eller diett 2 formulering ((Teklad Produkt nr td 01513) er det samme som diett 1 med unntagelse av at den inneholder 9,0 g /kg DL-homocystin og mangler metionin og kolin bitartrat.
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0003390.s001 plakater (0,05 MB DOC)
Tabell S2 Kvantitativ RT-PCR Hotell og microarray analyse av noen histone metyltransferaser og relaterte enzymene Wild typen hanndyr var behandlet med diett 1 eller diett 2 (ved å starte fra 3-4 uker gamle) i 1, 2, 4 og 6 måneder før RNA-ekstraksjon fra lever. Nivåer av 25 histon metyltransferaser og 8 andre beslektede enzymer ble bestemt ved enten kvantitativ RT- . PCR eller microarray eller begge, og forholdet (endring) Diet en versus Diet to beregnede data fra kvantitativ RT-PCR representere hjelp av minst 3 dyr per undergruppe * P. 0,05 Diet 1 vs Diet 2 (Students t- test, to tailed). histone metyltransferaser som ikke er oppført her viste ikke signifikant uttrykk i leveren som avslørt av DNA microarray analyse. Data fra microarray analyse representerer hjelp av 2 dyr per undergruppe. DNA microarray analyse viste nedregulering av diett to av fire små molekyl metyltransferaser, GNMT, GAMT, NNMT, og TEMT, som senere ble bekreftet av kvantitativ RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s002
(0,08 MB DOC)
tabell S3.
Gener regulert av diett som avslørt av DNA microarray analyse. Villtype mus ble matet med enten diett 1 eller diett 2 for to måneder før leveren deres ble samlet for RNA ekstraksjon. Data representerer hjelp av 2 dyr per undergruppe. Bare gener som viser mer enn 2 fold endringer er oppført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s003 plakater (0,85 MB XLS)
Tabell S4.
Gener regulert av RIZ1 knockout som avslørt av DNA microarray analyse. De RNA som brukes til analyse var fra villtype og knockout mus av fire måneders alder på balansert kosthold. Data representerer hjelp av 2 dyr per undergruppe. Gener i fet skrift ble også regulert av kosthold. Bare gener som viser mer enn 2 fold endringer er oppført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s004 plakater (0,06 MB XLS)
Tabell S5.
metyltransferaser med høy Km verdi for SAM ble nedregulert av metyl-ubalansert kosthold. Den Km verdi for SAM og Ki verdi for SAH er vist for ulike metyltransferaser. Forholdet (fold endringer) Diett 1 Diett 2 vs. i ekspresjonsnivåene for de metyltransferaser ble beregnet fra kvantitativ RT-PCR. Data representerer middel på minst 3 dyr pr gruppen ved 2 måneder etter behandling diett. * P 0,05 Diet 1 vs Diet 2 (t-test, to tailed)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s005 plakater (0,03 MB DOC)
Figur S1.
Western blot analyse bekrefter anerkjennelse av RIZ1 men ikke RIZ2 av Abcam RIZ1-spesifikt antistoff ab9710. Totalt proteinekstrakter av lever fra enten RIZ1 villtype eller knockout dyr ble løst ved SDS gel etterfulgt av western blot hjelp RIZ1 antistoff ab9710. Lik lasting ble bekreftet ved western blot hjelp beta-aktin antistoff
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s006 plakater (0,07 MB PDF)
Figur S2.
DNA hypometylering i mus matet med diett 2. Totalt genomisk DNA ble isolert fra lever av mus på hver diett 1 eller diett 2 i 15 måneder. Metyleringen nivåene av disse DNA-molekyler ble bestemt ved Sss1 enzymanalyse. Data er middel + SD av 3 dyr pr undergruppe. . * P = 0,03 (t-test, to tailed)
doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s007 plakater (0,02 MB PDF)
Figur S3.
Analyse av metylering endringer i CpG-rike regioner av genomet av MS-AFLP. A. Genomisk DNA isoleres fra MCF7 celler som enten var behandlet eller ikke behandlet med den demethylating midlet Aza-C ble anvendt som en positiv kontroll for MS-AFLP metode. B. De genomiske DNA som brukes til analyse var fra hjerne (B) og leveren (L) vev hos mus på hver diett 1 eller diett 2 i 15 måneder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003390.s008
(1,49 MB PDF)
takk
Vi takker Emily Larson for vevsprøver.
