Abstract
Gull nanopartikler (GNPs) har vist lovende medisinske anvendelser innen kreftbehandling involvert i reguleringen av intracellulære redoks balanse. Tidligere har vi rapportert at GNPs kan utløse apoptose og nekrose i humane lungekreftceller (A549) når L-buthionine-sulfoksiminforbindelser (BSO) ble anvendt for å redusere ekspresjon av intracellulær glutation (GSH). Heri, undersøkte vi cytotoksisitet av GNPs mot lungekreft celler under glutamat cystein ligase katalytisk subenhet (GCLC) ble brakt til taushet av siRNA. Våre resultater viste at GNPs forårsake apoptose og nekrose i celler transfektert med GCLC siRNA ved å heve intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS). Disse funnene viser at reguleringen av glutation syntese av GCLC siRNA i A549 celler kan initiere gull nanopartikler-indusert cytotoksisitet
Citation. Liu M, Zhao Y, Zhang X (2015) knockdown av Glutamat Cysteine Ligase Catalytic subenhet av siRNA Årsaker Gold Nanopartikler-indusert cytotoksisitet i lungekreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10,1371 /journal.pone.0118870
Academic Redaktør: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
mottatt: 25 oktober 2014; Godkjent: 11 januar 2015; Publisert: 19 mars 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81102468 til Y. Zhao). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig interessen for gull nanopartikler (GNPs) for kreftdiagnose og behandling, som stoffet levering bærere [1], celle targeting vektorer [2], bildebehandling [3], bestrålingssensibilisering [4-7] og ikke-invasive ablasjonsterapier [8, 9] har vokst betydelig. GNPs gi fordeler i disse programmene på grunn av deres vevsvennligheten [10], sterkt lys absorpsjon og spredning effekt [11], høy fototermiske konverteringsfrekvens og fotostabilitet [12-14], lettvinte bioconjugation og biomodification [15]. Videre har bruken av GNPs som anti-kreftmidler blitt grundig studert. Ulike forsøk på å innlemme GNPs til kreftbehandlinger har blitt gjort.
Redusert glutation (GSH), den mest tallrike intracellulær tiol, er viktig å opprettholde intra-cellulære redoks balanse og er involvert i avgiftning av eksogene og endogene stoffer slik som xenobiotika, ioniserende stråling, organiske peroksider og tungmetaller [16,17]. Det har blitt vist at en aggressiv tumor kan være følsomme overfor medikamenter ved anvendelse av en terapi basert på modulering av GSH-nivåer i kreftceller [18]. Det er velkjent at glutation er syntetisert fra de respektive aminosyrer i to sekvensielle, katalysert av glutamyl-syntetase (GCL) og GSH syntase. GCL består av en katalytisk subenhet (GCLC) og en moduler subenhet (GCLM), som katalyserer det første og hastighetsbegrensende trinn og spiller en nøkkelrolle i glutation homeostase [19]. De intracellulære GSH nivåer kan bli tømt gjennom spesifikk hemming av GCL. L-buthionine-sulfoksiminforbindelser (BSO), en inhibitor av GCL, er kjent for å tømme intracellulære lageret av glutation og derved føre til oksidativt stress [20]. Endringer i de spesifikke aktivitetene av enzymer involvert i metabolisme GSH i kreftcellene har vært implisert i oksidativt stress og uttømming i GSH kan øke følsomheten av kreftceller til andre skadelige hendelser [21-23]. Vi har tidligere rapportert at GNPs skjerm cytotoksisitet til lungekreftceller når L-buthionine-sulfoksiminforbindelser (BSO) ble anvendt for å redusere ekspresjon av intracellulær glutation [24]. I så fall kan gull nanopartikler anvendes som potensielle terapeutiske midler ved å regulere nivåene av glutation i kreftceller. Mens, er BSO en slags eksogene forbindelser. Påvirkningen av BSO på celler som funksjon er uforutsigbar. I dette arbeidet, vurderte vi effekten av GCLC siRNA på GNPs-indusert cytotoxity i lungekreftceller.
Så vidt vi vet, er det ingen studier på å vurdere rollene til GCLC siRNA i GNPs-indusert celledød. Hovedmålet med denne studien er å karakterisere cytotoxity av GNPs i lungekreftceller når GCLC ble slått ned av siRNA.
Materialer og metoder
Cell kultur
A549 celler (Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection Committee, Chinese Academy of Sciences, katt nummer: TCHu150) ble opprettholdt i RPMI-1640 medium som inneholder 4,5 g /l glukose, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C under en fuktig atmosfære.
Transfeksjon av siRNA i A549-cellelinjen
Gene stanse av GCLC ble utført ved hjelp av en siRNA knockdown system . En ikke-spesifikk kontroll siRNA duplex [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «], GCLC siRNA-en duplex [5′-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (dTdT) -3′], GCLC siRNA-2 duplex [5»-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (dTdT) – 3 «] og GCLC siRNA-3 duplex [5′-GUAGUAUUCUGAACUACCU (dTdT) -3»] ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. I korte trekk, ble A549-cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1,5 x 10
5 per brønn. Neste dag, celler (~ 60-70% samløpet) i hver brønn ble transfektert med den negative kontrollen, GCLC siRNA (75pmol i gratis FBS RPMI 1640) ved hjelp av Thermo Scientific DharmaFECT Transfeksjon Reagenser (Thermo Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. En dag senere ble mediet endret til normal vekstmedium, og cellene ble dyrket i ytterligere 48 timer. De transfekterte celler ble samlet inn og brukt til PCR, western blot analyse, og GSH nivåer måling [25-27].
RNA forberedelse og semikvantitativ RT-PCR
semikvantitativ RT-PCR med β- aktin som en intern kontroll ble utført for å undersøke forandringen i mRNA-ekspresjonen av GCLC i A549-celler transfektert med sirnas. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner [28]. Det isolerte RNA (2 pg) fra sirnas behandlede celler ble reverstranskribert inn i enkelt-trådet cDNA i en reaksjonsblanding inneholdende: 10 mmol /l dNTP, 1 ug oligo (dT) primer, 20IU RNasin og 200IU M-MLV revers transkriptase. PCR-amplifikasjon ble utført med 0.4μg cDNA i et reaksjonsvolum inneholdende 3pmol av hvert enkelt oligonukleotid primer, 10 mmol /l dNTP, og 1.5IU Taq DNA-polymerase. For alle reaksjonene, ble preliminære eksperimenter utført for å bestemme antall PCR-sykluser ved hvilket metning fant sted, og forsøkene som er nevnt ble utført med et antall sykluser som kommer før metning. Sekvensene til primerne for GCLC og β-aktin ekspresjon analyser var: GCLC, forover-primer: 5′-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 «; revers primer: 5»-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 «. Den thermal cycler Enheten ble programmert for 36 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. β-aktin, forover-primer: 5»-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 «; revers primer: 5»-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 «. PCR produktene ble elektroforese på en 2% agarosegel (Sigma-Aldrich) og visualisert etter etidiumbromidfarging løpet UV-lys [29].
Western blotting
For GCLC deteksjon, celler dyrket i seks -vel platene ble inkubert med negativ kontroll dupleks og GCLC siRNA dupleks i 24 timer, deretter dyrket med normal vekstmedium for ytterligere 48 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS, trypsinert og oppsamlet ved sentrifugering. En mengde på 30μg protein fra hver prøve ble blandet med ladningsbuffer, inkubert ved 100 ° C i 5 minutter og separert på en 10% SDS-PAGE. Deretter ble prøvene overført til en PVDF (polyvinylidenfluorid) membran og blokkert med 5% (vekt /volum) skummet melk oppløst i TBS + 0,05% (v /v) Tween-20 (TBST) i en time ved romtemperatur og probet med GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), eller β-aktin (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology) ved 4 ° C over natten. Følgende, ble membranene inkubert med et sekundært antistoff (1: 4000-anti-kanin, Cell Signaling Technology) i en time, vasket 3 ganger med TBST og båndene ble visualisert ved hjelp av ECL-reagens (Thermo Scientific) [30]
.
Totalt intracellulære glutation (GSH) nivåer
Cellular GSH innholdet ble analysert ved hjelp av Glutathione Kvantifisering Kit (Beyotime Institute Biotechnology). 5, 5′-ditiobis (2-nitrobenzosyre) (DTNB) og GSH reagere for å generere 2-nitro-5-tiobenzo-syre og glutation disulfid (GSSG). Ettersom 2-nitro-5-tiobenzo-syre er en gul farget produkt, kan GSH-konsentrasjon i prøvene måles ved 412 nm absorbans med en flerbrønn plateleser. I korte trekk ble celler transfektert med negativ kontroll eller tre GCLC siRNA duplex i 24 timer, deretter dyrket i normal vekstmedium for ytterligere 48 timer. Ved slutten av behandlingen ble cellene høstet og deretter pelletert ved sentrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter, resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende 0,2% Triton X-100. Cellelysatene ble sentrifugert ved 13,000g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble anvendt for bestemmelse av total glutation konsentrasjoner. GSH uttømming i GCLC siRNA behandlede celler ble indikert [31].
Cytotoksisitet måling
Cytotoksisitet ble bestemt via celle telling. Vi observerte at hemming av GCLC siRNA-1duplex er den mest betydningsfulle blant tre GCLC siRNA duplex. Så ble A549-celler inkubert med negativ kontroll eller GCLC-spesifikk siRNA-1, og deretter utsatt for forskjellige doser av GNPs for ytterligere 72 timer. Til slutt, ble cellene vasket med PBS, trypsinert med trypsin /EDTA-oppløsning, og resuspendert til et sluttvolum på en 2 ml cellemedium for ytterligere måling av cellenes levedyktighet. De celle tall i hver prøve ble talt under et mikroskop ved hjelp av et tellekammer Set (Qiujing Inc) [32].
Intracellulær reaktive oksygenarter måling
Produksjonen av ROS ble målt ved hjelp av to, 7-dichlorodihydro fluorescerende diacetat (DCFH-DA, Beyotime Institute bioteknologi). DCFH-DA passivt går inn i cellene, cellulære esteraser virker på molekylet for å danne det ikke-fluorescerende gruppe DCFH, som er ionisk i natur, og derfor fanget inne i cellene. En reaksjon med ROS fører til en oksydasjon av DCFH til den sterkt fluorescerende forbindelse dichloroflourescein (DCF). I korthet ble celler dyrket i 6-brønns plater transfektert med den negative kontroll, GCLC siRNA-1 under anvendelse av Thermo Scientific dharma fekt Transfeksjon Reagenser. En dag senere ble cellene behandlet med GNPs (20 pm), GNPs (20 uM) og eksogen GSH (1 mM) eller GNPs (20 uM) og ROS scavenger N-acetyl-L-cystein (NAC, 1 mM) for ytterligere 72 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS tre ganger, og ble deretter behandlet med 10 uM DCFH-DA. Etter å ha inkubert i 30 minutter, ble cellene trypsinert, oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i PBS. Fluorescensintensiteten i celler (50 000) fra hver brønn ble målt med en fluorescens spektrofotometer (Thermo Scientific), med eksitasjons- og emisjonsbølgelengder på 488 og 525 nm, henholdsvis [33].
Strømningscytometrisk analyse av apoptose og nekrose
celle~~POS=TRUNC telling~~POS=HEADCOMP resultatet viste at GNPs hadde hemmende funksjon på transfekterte celleoverlevelse. Vi undersøkte om årsaken til denne hemmingen er enten tidlig apoptose eller sent apoptose /nekrose. Disse effektene ble bestemt med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket AnnexinV og PI farging (Invitrogen) ved flowcytometrisk analyse. De transfekterte celler ble behandlet med GNPs, GNPs og GSH, GNPs og NAC. Etter 72 timer ble cellene oppsamlet og vasket to ganger med PBS, inkubert med FITC-AnnexinV og PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Apoptotiske og nekrotiske celler ble evaluert ved flow cytometri. Minst 1 x 10
4-celler ble analysert pr prøve, og kvadrant innstillingene var basert på kontrollprøvene. Levende celler er negative for begge propidiumjodid (PI) og Annexin V, tidlig apoptotiske celler er PI negativ, men AnnexinV positiv, mens slutten av apoptotiske /nekrotiske celler er positive for begge PI og AnnexinV. All flowcytometri analysene ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige Cell quest software (BD Biovitenskap).
mitokondrie membran potensial og intracellulær kløyvde caspase-3-analysen
JC-1 (5, 50, 6, 60-tetraklor-1, 10, 3, 30-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin jodid, ble Beyotime Institute Biotechnology) anvendt for å evaluere endringer i mitokondriemembranen potensial som tidligere beskrevet [24]. A549-celler i logaritmisk vekstfase ble sådd ut i 6-brønners cellekulturplater og inkuberes i 24 timer, og deretter transfektert med negativ kontroll eller GCLC-spesifikk siRNA-1. De transfekterte celler ble behandlet med eller uten GNPs (20 pm) i 72 timer, deretter ble cellene høstet og inkubert med JC-1 i 30 minutter i mørke ved 37 ° C. Etter farging ble cellene vasket to ganger med PBS og analysert ved hjelp av strømningscytometri [34].
For intracellulære spaltet caspase-3, ble de transfekterte celler som er behandlet med eller uten GNPs oppsamlet og fiksert med 4% paraformaldehyd. Etter å ha behandlet med 0,1% Triton X-100 og blokkert med 1% BSA, ble celler inkubert med spaltede caspase-3 (Asp175) antistoff (Alexa 488 fluor-konjugat, Cell Signaling Technology) i 30 minutter. Deretter ble de fargede celler analysert ved flowcytometri [24].
Statistisk analyse
statistiske forskjeller ble evaluert ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) og t-test med Prism programvare (GraphPad Software, Inc.). P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant, og dataene ble merket med (*) for p 0.05, (**) for p 0,01, og (***) for p 0.001, respektivt. Hver gruppe ble testet tre ganger, og alle forsøk ble gjennomført minst tre ganger.
Resultater
Effekt av siRNAs mot katalytiske GCL subenheter
For å undersøke knockdown effekten av tre 19-nukleotid-sekvenser for katalytiske GCL-underenheter, ble A549-celler transfektert med negativ kontroll eller GCLC siRNA i 24 timer, etterfulgt av dyrket i ytterligere 48 timer i normal vekstmedium. Semikvantitativ RT-PCR-analyse ble utført for å undersøke den GCLC mRNA-ekspresjon. De mRNA nivåer av GCLC ble betydelig redusert i A549 celler transfektert med GCLC siRNA. I motsetning til dette, negativ kontroll-siRNA var mindre potent (Fig. 1A). I alle celler transfektert med GCLC siRNA, mRNA-nivåer av GCLC var homogen uten et betydelig avvik. I mellomtiden, beregnet vi effekten av GCLC siRNA ved å analysere deres evne til å interferere med de uttrykte proteiner ved Western blot. Som vist på fig. 1B, GCLC siRNA vesentlig hemmet ekspresjon av GCLC protein i A549-celler. De tre forskjellige siRNA for katalytiske GCL subenheter forskjellig forstyrret uttrykk for GCLC sammenlignet med negativ kontroll siRNA og GCLC siRNA-1 var blant de mest effektive.
(A) GCLC mRNA nivåer i A549 celler etter 24 timer transfektert med negativ kontroll siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 og GCLC siRNA-3. GCLC siRNA betydelig redusert de GCLC mRNA nivåer i A549 celler. (B) Representative Western blot gel dokumenter for GCLC og sammenfattet data som viser at effektiviteten av genet Slå av GCLC av siRNA. Cytosoliske proteiner ble isolert fra transfekterte celler. GCLC proteinnivåer i celleekstrakter ble målt ved Western blot-analyse og ble normalisert til p-aktin ekspresjonsnivåer. *** P. 0,001, sammenlignet med negativ kontroll
Effekt av GCLC siRNA på intracellulære GSH nivåer i A549 celler
GCLC er avgjørende for glutation biosyntese, som opprettholder glutation konsentrasjoner i intakte celler. Vi har vist at siRNA rettet mot katalysa GCL-underenheter redusere mRNA-nivåene av GCLC og inhiberer ekspresjon av GCLC protein i A549-celler. For å underbygge ytterligere spesifisitet og effekt av GCLC siRNA, effekten av GCLC siRNA på intracellulære GSH-nivåer ble målt i [32]. Som forventet, sammenlignet med negativ kontrollgruppe, GCLC siRNA åpenbart reduserte GSH-nivåer, og den GCLC siRNA-1 er den mest signifikante (fig. 2), som er korrespondanse med de resultatene som vi har sett ovenfor. På bakgrunn av disse resultatene ble GCLC siRNA-en som brukes i de neste forsøkene. Knock-down eksperimenter demonstrerte at GCLC siRNA påvirker ekspresjonen av GCLC og ført til en betydelig reduksjon av GSH produksjon.
cytosol ble isolert fra celler transfektert med negativ kontroll siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 og GCLC siRNA-3. De intracellulære GSH nivåer ble bestemt ved 412 nm absorbans med en multiwell plateleser. Data representerer gjennomsnittlig prosent av negativ kontroll (n = 3) ± SD for 4 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01, sammenlignet med negativ kontroll
Den GCLC siRNA regulerer celledød indusert av GNPs
Totalt GSH innholdet ble redusert i en betydelig måte i A549-celler transfektert med GCLC siRNA. Når BSO ble brukt til å redusere ekspresjon av glutation i A549-celler, GNPs viste tydelig cytotoksisitet på celler [32]. Imidlertid er effekten av GCLC siRNA på cytotoksisiteten av GNPs fortsatt ukjent. Deretter undersøkte vi om GNPs endret A549 celler overlevelse på siRNA-mediert forstyrrelse av GCLC aktivitet. Basert på resultatene av knock-down eksperimenter ble A549 celler transfektert med negativ kontroll-siRNA eller GCLC siRNA-en, og deretter eksponert for ulike konsentrasjoner av GNPs. Som kontroll eksperiment, gjorde GCLC siRNA ikke indusere bemerkelsesverdig cytotoksisitet på A549 celler (S1 fig.). Mens, observerte vi at GNPs doseavhengig hemmet veksten av A549-celler forbehandlet med GCLC siRNA-1. Sammenlignet med negativ kontrollgruppe, behandling av A549-celler med 50 uM GNPs resulterte i betydelig redusert populasjonen av levedyktige celler etter tappe intracellulært GSH (fig. 3).
A549-celler ble transfektert med negativ kontroll eller GCLC siRNA- 1 til 24 timer, etterfulgt av dyrket i ytterligere 3 dager i fravær av GNPs, deretter høstet og tellet. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (± SD n = 4) av tre bestemmelser. * P. 0,05 versus negativ kontroll
GNPs-indusert cytotoksisitet er forbundet med heving av intracellulær ROS i GCLC siRNA behandlede celler
Siden ROS har blitt foreslått som en kritisk faktor i bestemmelse av celledød modus. Vi videre undersøkt om ROS delta i reguleringen av BNP-indusert celledød når cellene ble transfektert med GCLC siRNA. Som vist på fig. 4, etter å kneble GCLC uttrykk med siRNA-1, GNPs resulterte i en ca 7-dobling av ROS-nivåer sammenlignet med det i negativ kontrollgruppe. Imidlertid, når cellene ble behandlet med GCLC siRNA alene, påvirkning av ROS-produksjon ble ikke observert i fravær av GNPs (S2 Fig.). Eksogene GSH og NAC undertrykte betydelig GNPs-indusert ROS produksjon, noe som kan beskytte GCLC siRNA behandlede celler fra cytotoksisitet av GNPs. Disse resultater innebærer at cytotoksisiteten til GNPs er i det minste delvis forbundet med økningen av ROS-nivåene i GCLC siRNA-1 forbehandlede celler (Fig. 4).
Eksponensielt voksende celler ble transfektert med negativ kontroll og GCLC siRNA- 1 til 24 timer etter behandling med GNPs (20 pm), GNPs (20 uM) og GSH (1 mm), GNPs (20 uM) og NAC (1 mm). ROS nivåer ble målt. Grafer indikere ROS (som bestemt ved DCF) nivå (%) sammenlignet med negative kontrollceller. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (± SD n = 4) av tre bestemmelser. ** P 0,01
GNPs initiere apoptose og nekrose i celler transfektert med GCLC siRNA
Beviset på at GNPs indusere celledød og øke produksjonen av intracellulær ROS bedt oss om å ytterligere undersøke enten GNPs forårsake apoptose og nekrose i GCLC siRNA behandlede celler. Dual farging av celler med Annexin V-FITC og PI ble brukt til å skille apoptotiske og nekrotiske celler fra normale celler. Som vist på fig. 5, økt GNPs andelen AnnexinV-farget cellene når de GSH nivåer ble redusert med lyddemping GCLC uttrykk. Befolkningen i totale PI positive celler, som består av apoptose og nekrose, ble også betydelig økt i GCLC siRNA og GNPs behandlede celler. Behandling med GCLC siRNA alene ikke øker populasjonen av apoptose og nekrose sammenlignet med kontrollgruppen (S3 fig.). Disse dataene viste at GNPs relativt påvirke Annexin V-PI farget celle nummer i celler transfektert med GCLC siRNA. For å teste om apoptose eller nekrose ble aktivert av ROS, benyttet vi den eksogene GSH og NAC. Behandling med GSH og NAC både undertrykte betydelig fremkomsten av Annexin V og PI-positive celler indusert ved GNPs i GCLC siRNA behandlede celler (Fig. 5). Resultatene indikerte at GNPs initiere apoptose og nekrose ved å heve intracellulære ROS-nivåer i lungekreft celler forbehandlet med GCLC siRNA.
Celler ble transfektert med enten ikke-target kontroll siRNA eller GCLC spesifikke siRNA-1. En dag senere ble cellene behandlet med GNPs (20 pm), GNPs (20 uM) + GSH (1 mm) og GNPs (20 uM) + NAC (1 mm) for ytterligere 72 timer. AnnexinV-FITC og PI-celler ble målt ved hjelp av strømningscytometri. (A) Fluorescens mønster av AnnexinV-FITC og PI-farget A549-celler etter behandling. (B) Prosentvise Annexin V positiv eller PI-positive celler for forskjellige behandlinger. Hver søyle representerer middelverdi (± SD n = 3). ** P 0,01, *** P. 0,001, versus kontroll
GNPs føre til depolarisering av mitokondriemembranen potensial i GCLC siRNA behandlede celler
På grunn depolarisering av mitokondriemembranpotensiale (ΔΨm) spiller en sentral rolle i apoptose [35], vi undersøkt om GNPs endret mitokondriemembranpotensialet i cellene transfektert med GCLC siRNA-1. Det fluorescerende probe JC-1 fargestoff ble anvendt for å evaluere endring av mitokondriemembranpotensialet og fluorescens-skift (rød til grønn) av prøvene ble målt ved flow-cytometri. Vi observerte at GNPs forårsaket en økning i grønn /rød fluorescens intensitet i GCLC siRNA behandlede celler (Fig. 6). Mens, celler transfektert med GCLC siRNA i fravær av GNPs viste ingen endring av mitokondriemembranpotensialet som sammenlignet med kontrollgruppen (S4 fig.). Resultatene indikerte at induksjon av apoptose og nekrose av GNPs i GCLC siRNA forbehandlet celler er nært knyttet til mitokondriemembranen potensial.
Etter transfektert med negativ kontroll siRNA eller GCLC siRNA-1 ble cellene behandlet med GNPs (20 uM ) i ytterligere 72 timer og deretter samles opp og farget med JC-1 i mørke ved 37 ° C, skylt med PBS. Fluorescensen skift (rød til grønn) av prøvene ble målt ved flow-cytometri. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (± SD n = 4) av tre bestemmelser. *
p
. 0,05, sammenlignet med negativ kontrollgruppe
GNPs indusere aktivering av caspase-3 i celler transfektert med GCLC siRNA
Mitokondrieavhengig apoptose initieres ved rekruttering og aktivering av caspase [36]. Dermed vi videre spør om caspase-3 aktiveres under GNPs indusert apoptose i GCLC siRNA behandlede celler. Når labile cytosolic GSH bassenget ble tømt av GCLC siRNA ble cellene dyrket med eller uten GNPs. Aktiveringen av caspase-3 ble målt ved anvendelse av spesifikke antistoffer som gjenkjenner den spesielt spaltede og aktivert form ved strømningscytometri. Som vist på fig. 7, GNPs økt betydelig caspase-3 aktiviteter i GCLC siRNA behandlede celler. GCLC siRNA alene påvirkes nesten ikke aktiviteten av cascase-3 sammenlignet med kontrollgruppen (S5 fig.). Derfor GNPs apoptose hovedsakelig gjennom mitokondrie-avhengige caspase svei.
Aktivering av kaspase-3 ble målt ved anvendelse av spesifikke antistoffer ved strømningscytometri. Intracellulær GSH ble oppbrukt av GCLC siRNA-1, etter ca. 72 timer med GNPs behandling, ble cellene oppsamlet, behandlet med 0,1% Triton X-100 og blokkert med 1% BSA og deretter inkubert med spaltede caspase-3 (Asp175) antistoff ( Alexa 488 fluor-konjugat) i 30 minutter. Fluorescensintensiteten ble målt ved flow-cytometri. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (± SD n = 4) av tre bestemmelser. *
p
. 0,05, sammenlignet med negativ kontrollgruppe
Diskusjoner
I løpet av de siste årene, apoptoseinduksjon grunn av endringer i intracellulær redox status av visse oksidative og ikke-oksidative stimuli har blitt et fokus for omfattende forskning [23, 25, 37, 38]. ROS og GSH er de to viktigste faktorer som bestemmer mobilnettet redoks likevekt. ROS ofte forårsaker celleskade og føre til celledød, særlig ved høy konsentrasjon. Farmakologisk GSH uttømming av BSO svært sensitizes kreftceller til apoptose indusert av kjemoterapeutika. Derfor manipulering av cellulære redoks status representerer en levedyktig strategi for apoptose-induksjon av anti-kreft-midler. I mellomtiden har gull nanopartikler i kreftdiagnose og behandling blitt den internasjonale forsknings hot spot. Tidligere har vi funnet at GSH metabolismeveien er direkte involvert i avgiftning av GNPs [24]. Når den intracellulære GSH-ekspresjon ble hemmet av BSO, cytotoksisiteten til GNPs var åpenbare. GNPs indusere celledød av reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjon i A549 celler med lav intracellulær glutation [24, 32]. Geng F og kolleger har rapportert at samspillet av røntgenstråling med GNPs indusert forhøyede nivåer av ROS produksjon er en av de mekanismer som GNPs kan forbedre strålebehandling på eggstokkreft [39]. Oksidativt stress bidrar til gull nanopartikkel-indusert cytotoksisitet i human leukemi (HL-60) og hepatoma (HepG2) celler [40]. Disse resultatene gitt klare bevis for at GNPs kan benyttes ikke bare som bærere seg selv, men også som potensielle legemiddelselskap ved å utnytte deres evne til å redusere intracellulær GSH uttrykk og generere cytotoksiske svar. I denne studien, har vi adoptert GCLC-spesifikk siRNA til å hemme ekspresjon av GCLC og føre til en betydelig reduksjon i GSH produksjon, og deretter detektert cytotoksisiteten av GNPs. Etter behandling med GCLC siRNA, ble ROS detektert i nærvær av GNPs i A549-celler. Resultatet viste at GNPs kan påvirke ROS-nivåene i GCLC siRNA behandlede celler. GSH og NAC kan eliminere ROS for å nøytralisere cytotoksisiteten av GNPs i lungecancerceller transfektert med GCLC siRNA. Disse resultatene siktet at etter banket ned av GCLC ved siRNA, ROS tilskrives den celledød indusert av GNPs i lungecancerceller.
Det er kjent at avvikende celledødsveier eksistere i pattedyrceller og deres aktivering avhenger typen og intensiteten av stimulus. Mye av betydning har blitt gitt til den apoptotiske og nekrotiske celledød i anti-tumor terapi [41-44]. Flere moduser av celledød er samtidig indusert i GNPs-eksponerte lungekreftceller med lav intracellulær GSH, inkludert apoptose og nekrose. Vi observerte at GNPs kan indusere apoptose og nekrose samtidig når GCLC ble brakt til taushet av siRNA i lungekreftceller. Disse funnene antydet at både apoptose og nekrose er viktig mekanisme for GNPs-indusert celledød.
For å konkludere, gull nanopartikler spille mer og mer viktig rolle i anvendelsen av anti-tumor forskning. Gullet nanopartikler når konjugert med GCLC spesifikke siRNA effektivt kan indusere tumorcelledød. Men mer omfattende og dyrestudier med ulike dyrearter for å ta funnene i denne undersøkelsen til kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Effekt av GCLC siRNA på celle overlevelse i A549-celler.
Celler ble sådd før transfektert med GCLC siRNA, og deretter dyrket i normal vekstmedium. Celle tallene ble telt ved 48-timers intervaller for cellene levedyktighet. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (± SD n = 3) av tre bestemmelser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. ROS produksjon i A549-celler transfektert med GCLC siRNA.
Celler dyrket i 6-brønns plater ble transfektert med den negative kontroll eller GCLC siRNA. En dag senere ble cellene dyrket i normal vekstmedium for ytterligere 48 h og ble deretter behandlet med 10 uM DCFH-DA. Fluorescensintensiteten av celler ble målt med en fluorescens-spektrofotometer. Barer representerer gjennomsnittet (± SD n = 3) av tre bestemmelser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. Apoptotiske og nekrotiske respons til A549-celler transfektert med GCLC siRNA.
Etter knockdown av GCLC ekspresjon, ble cellene farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Representative strømningscytometriske Resultatene er vist som dot Tomt Salgs doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s003 plakater (TIF)
S4 Fig. Effekt av GCLC siRNA på mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm) på A549-celler.
Den celler behandlet med negativ kontroll eller GCLC siRNA ble farget med JC-1 i 20 minutter ved 37 ° C. Fluorescensen skift (rød til grønn) av prøvene ble så detektert ved hjelp av flow cytometri. Data representerer gjennomsnittet (± SD n = 3) av tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s004 plakater (TIF)
S5 Fig. Effekt av GCLC knockdown på aktiviteten av caspase-3 i A549-celler.
Tjuefire timer etter transfeksjon med negativ kontroll eller GCLC siRNA, ble cellene opprettholdt i normalt dyrkingsmedium for ytterligere 48 timer. Caspase-3 aktivitet i prøvene ble bestemt ved anvendelse av spaltet caspase-3 (Asp175) antistoff (Alexa 488 fluor-konjugat) ved strømningscytometri. Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s005 plakater (TIF)
bekreftelser
Forfatterne takker Dr Xiaohu Gu og professor Yi Ding fra Shandong University School of Chemistry and Chemical Engineering, for å støtte de gull nanopartikler.
