Abstract
Ptp4a3 plakater (kjent som PRL-3) er en gåtefull medlem av
Ptp4a
familie av prenylated protein tyrosin fosfataser som er høyt uttrykt i mange kreft hos mennesker. Til tross for sterke korrelasjoner med metastase og dårlig pasient prognose, det er svært begrenset forståelse av dette genet familiens rolle i malignitet. Derfor har vi laget et gen-målrettet murine knockout modell for
Ptp4a3
, den mest studerte
Ptp4a
familiemedlem. Mus mangel for
Ptp4a3
var grovt normal. Færre homozygot-null menn ble observert ved avvenning, imidlertid, og de opprettholdt en redusert kroppsvekt. Selv
Ptp4a3
er normalt forbundet med sent stadium kreft og metastasering, vi observert økt
Ptp4a3
uttrykk i tykktarmen av villtype mus umiddelbart etter behandling med kreftfremkallende azoxymethane. For å undersøke hvilken rolle
Ptp4a3
i malignitet, vi brukte mest studerte murine kolitt-assosiert tykktarmskreft modell. Villtype mus behandlet med azoxymethane og dekstran natriumsulfat utviklet cirka 7-10 tumorer per musen i distal kolon. Den resulterende svulstvev hadde fire ganger mer
Ptp4a3
mRNA i forhold til normal tykktarm epitel og økt PTP4A3 protein.
Ptp4a3-
null mus utviklet 50% færre colontumorer enn villtype mus etter eksponering for azoxymethane og dekstran natriumsulfat. Svulster fra
Ptp4a3
-null mus hadde forhøyede nivåer av både IGF1Rβ og c-MYC forhold til svulster replete med
Ptp4a3, etter noe som tyder på en forbedret celle signalveien engasjement i fravær av fosfatase. Disse resultatene gir den første definitive bevis implicating
Ptp4a3
i tykktarm tumorigenesis og fremheve den potensielle verdien av fosfatase som et terapeutisk mål for tidlig stadium ondartet sykdom
Citation. Zimmerman MW, Homanics GE, Lazo JS (2013) Målrettet Sletting av metastaser-Associated fosfatase
Ptp4a3 plakater (PRL-3) Undertrykker Murine Colon Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10,1371 /journal.pone.0058300
Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, Storbritannia
mottatt: 22 november 2012; Godkjent: 01.02.2013; Publisert: 28 mars 2013
Copyright: © 2013 Zimmerman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette var finansiert av National Institutes of Health stipend AA10422 og fellesskap F31AA019597A. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
protein tyrosin fosfatase-4A3 (
Ptp4a3
), sammen med
Ptp4a1 Hotell og
Ptp4a2
, omfatter 4a-familien av protein tyrosin fosfataser. Denne beskjedne genfamilien er ofte referert til som fosfataser for regenerering leveren (PRL), på grunn av oppdagelsen av
Ptp4a1
i de regenererende leverceller fra mus etter partiell hepatektomi [1]. Den betydelige homologi ( 75% aminosyre identitet) finnes blant
Ptp4a
familiemedlemmer kan betegne lignende enzymologi men alle tre familiemedlemmer er bevart gjennom pattedyrarter, noe som tyder på ikke-redundante biologiske roller for hver.
in vivo
egenskaper og funksjoner av disse gåtefulle fosfataser forblir bemerkelsesverdig dårlig forstått.
Interesse for
Ptp4a3
kan tilskrives sin betydelig potensial som en biomarkør og som en terapeutisk målrette for ondartet kreft. Mange humane krefttyper uttrykker høye PTP4A3 nivåer, inkludert tumorer i tarm [2], bryst [3], eggstokk [4], lever [5], mage [6], og stroma [7], og forhøyet PTP4A3 uttrykk ofte korrelerer med økt svulst invasivitet og dårlig prognose [8]. I tillegg øker ektopisk PTP4A3 overekspresjon svulst celle migrasjon og invasjon
in vitro product: [9]. Mens definitive bevis mangler,
Ptp4a3
har blitt foreslått å modulere flere signalveier som involverer SRC [10], Rho GTPases [9], og PI3K-Akt [11] i ulike former for kreft. Kompleksiteten i veien endringer sett når
Ptp4a3
er overuttrykt kan også gjenspeile dens evne til å fungere som en phosphatidylinositol 5-fosfatase [12]. Ingen rapporter har entydig vist en rolle for
Ptp4a3
i fysiologi av normale celler eller vev.
Azoxymethane (AOM) er en procarcinogen at når metabolisert i tykktarmen er mutagene og stasjoner tumorigenesis. AOM i kombinasjon med inflammatorisk middel dekstran-natriumsulfat (DSS) produserer en utbredt murine modell som nøyaktig reproduserer kolon maligniteter som drives av kroniske inflammatoriske tilstander slik som ulcerøs kolitt [13]. Flere signalveier er implisert i patogenesen av AOM-induserte kolonkreft inkludert KRAS [14], β-catenin [15], c-MYC [16], insulinlignende vekstfaktor-1 Receptor β (IGF1Rβ) [17], og transformerende vekstfaktor β (TGFp) [18]. Interessant,
Ptp4a3
har blitt identifisert som en direkte regulatoriske mål av TGFB signalering i tykktarm kreft [19].
I denne studien brukte vi et gen målretting tilnærming til å generere mus mangler
Ptp4a3 Hotell og avhøre den potensielle rolle
Ptp4a3
i tykktarm tumorigenesis. AOM eksponering akutt økt
Ptp4a3
uttrykk i tykktarmen.
Ptp4a3
-null mus var resistente mot tykktarms tumorigenesis implicating dette genet i patogenesen av ondartet sykdom. Videre svulster avledet fra
Ptp4a3
-null mus overexpresssed kreft forbundet IGF1Rβ og c-MYC tyder involvering av disse onkogene signalveier.
Resultater
Opprettelse av Ptp4a3 mutant mus
Vi forstyrret
Ptp4a3
genomisk locus med Cre-lox system av stedsspesifikk rekombinasjon basert på plasseringen av to innsatte loxP nettsteder (fig. 1A og nærmere i fig. S1) . Mutante mus ble backcrossed til C57BL /6J-stammen i minst fem generasjoner. Knockout allelet ble skapt ved å krysse
Ptp4a3-
floxed mus med transgene mus som uttrykker CRE-recombinase drevet fra en generell promoter (EIIA) for å rekombinere målstedet og skape globale knockout mus [20]. Innsetting av 3′-loxP reiser ødelagt et endogent Hindlll setet øke størrelsen av det genomiske DNA-fragment produsert ved restriksjonskutting fra 5,6 til 10,2 kb. Følgende sletting av målsekvensen redusert restriksjonsfragmentstørrelse på fra 10,2 til 6,4 kb. Tydelig bandet størrelser tilsvarer hvert allel er observert analysert ved Southern blot hybridisering med en ~300 bp probe som tilsvarer ekson 6 (Fig. 1B).
A)
Ptp4a3
floxed allel var laget ved å sette inn loxP-seter (røde pilspisser) rundt exon 2. Denne mutasjonen resulterte i brudd av et Hindlll-sekvens som øker størrelsen av DNA-fragmentet fremstilt ved restriksjonskutting fra 5,6 til 10,2 kb. Etter ekspresjon av Cre rekombinase, blir sekvensen mellom loxP-seter fjernes etterlater en enkelt loxP område og redusere størrelsen på restriksjonsfragment til 6,4 kb. Denne mutasjonen fører til sletting av initieringskodonet forårsaker et rammeskift-mutasjon som produserer et ikke-funksjonelle proteinprodukt. B) Southern blot analyse av genomisk DNA ble brukt til å overvåke disse genetiske endringer og genotypen mus inneholdende villtype, floxed, eller knockout allel. Hvert kjørefelt er fra en individuell mus. C) Kvantitativ RT-PCR-analyse på total mRNA fra fosterets hjerte vev viste ingen endring i
Ptp4a1 Hotell og
Ptp4a2
mRNA nivåer mens
Ptp4a3
ble redusert og ikke påvisbare i heterozygot og homozygot-null vev, henholdsvis. (* = P 0,05, n = 4 /genotype). D) PTP4A3 proteinprodukt kunne påvises ved western blot i hele proteinlysatene fra hvete og heterozygot fosterets hjerte vev, men ikke i homozygot
Ptp4a3-
nullprøver.
En analyse av 500 unger som ble produsert av heterozygote parring par indikert alle mulige genotyper ble observert i den resulterende avkom. Mens kvinner ble observert ved den forventede mendelsk forholdstall, bemerket vi en signifikant reduksjon (p 0,05) i antallet
Ptp4a3
-null hanner ved avvenning i forhold til forventede hyppigheten (tabell 1). Gitt dette funnet, er det mulig at knockout hanner enten besatt en overlevelse ulempe eller at
Ptp4a3
-null kjønnsceller hadde en forestilling fenotype.
Ptp4a3
-null hannmus utstilt en omtrentlig 10% reduksjon i kroppsmasse (p 0,003) og 7% reduksjon i kroppsmasseindeks (p 0,004) sammenlignet med villtype kullsøsken på 6 ukers alder (Fig. S2). Dette fenotype også ut til å være begrenset til hannmus som kvinne
Ptp4a3
-null mus viste ikke en signifikant reduksjon i kroppsmasse eller body mass index.
Fordi fosterets hjerte vev hadde tidligere blitt foreslått å ha høye nivåer av
Ptp4a3
uttrykk [21], vi neste utført kvantitativ RT-PCR på total RNA prøver fra fosterhjertevevet (E19.5) for å bestemme den relative mRNA nivåer av
Ptp4a1
,
Ptp4a2, etter og
Ptp4a3.
Mens
Ptp4a1 Hotell og
Ptp4a2
nivåer forble lik mellom genotyper,
Ptp4a3
mRNA ble redusert i heterozygot vev og ikke påvises i prøver fra
Ptp4a3
-null fosterets hjerte vev (fig. 1C). Dermed kompensasjon for
Ptp4a3
tap ved oppregulering av enten familiemedlemmer
Ptp4a1
eller
Ptp4a2
på mRNA-nivået ble ekskludert. Protein lysater fra føtalt hjertevevet ble analysert ved Western blot for tilstedeværelse av PTP4A3 proteinprodukt. Mens påvises i prøver fra villtype embryoer, PTP4A3 var lavere i lysatene fra heterozygote embryoer og homozygot-null vev inneholdt ingen påvisbare PTP4A3 (Fig. 1 D). Bortsett fra de nevnte fenotypiske observasjoner, mus uten funksjonell
Ptp4a3
dukket grovt normal i forhold til villtype kullsøsken.
Expression og knockout av Ptp4a3 i mus vev
Fordi uttrykket av endogen PTP4A3 protein i normalt vev er ikke godt karakterisert, undersøkte vi vev proteinprøver fra hvete og
Ptp4a3
-null mus. Først analyseres vi flere typer vev for PTP4A3 protein ekspresjon av Western blot (Fig. S3). Føtalt hjerte, fetal tarm, voksent hjerte, skjelettmuskel, bukspyttkjertel, lunge, milt, hjerne, thymus, tykktarm, tynntarm og alle uttrykte detekterbare nivåer av PTP4A3 i motsetning til lever og nyrer, som ikke hadde noen påvisbar PTP4A3 protein. Disse resultatene bekrefter også at effekten av den globale genet delesjon tilnærming, som ikke PTP4A3 protein kunne ikke påvises i noen av lysatene fra
Ptp4a3
-null mus. Histologisk analyse ble også utført på hvete og
Ptp4a3
-null vevsprøver (Fig. S4). Ved å undersøke flere vevstyper, ble det ikke utilslørt abnormaliteter observert og alle prøvene viste kvalitativt normal.
Ptp4a3 uttrykk øker umiddelbart etter AOM eksponering
Siden lave nivåer av PTP4A3 var påvises i normal tykktarm epitel, vi analysert
Ptp4a3
genekspresjon umiddelbart etter behandling med tarm procarcinogen AOM (12,5 mg /kg) eller saltvann-kontroll i villtype C57BL /6J-mus. Mus ble avlivet 8 og 24 timer etter injeksjon AOM og tykktarm epitelceller ble samlet for analyse. Totalt mRNA ble isolert og kvantitativ RT-PCR ble utført for å prøve for
Ptp4a3
genuttrykk nivåer. Interessant,
Ptp4a3
ble oppregulert med 78% på 8 timer og 60% på 24 timer i AOM-behandlet normal epitelial forhold til kontroll (Fig. 2C). Protein lysater fra AOM-behandlede mus tyder på at PTP4A3 proteinnivåer er også økt i disse vevene (fig. 2D). Mens rollen som
Ptp4a3
i tykktarmskreft er tradisjonelt tenkt å involvere sent stadium svulster og metastaser, tyder dette funnet en potensiell rolle i tidlig stadium sykdom og tumorigenesis.
A) AOM -DSS behandling paradigme anvendt i denne studien har en enkelt dose av AOM etterfulgt av 3 behandlingssykluser med DSS i drikkevannet. B) Histologisk representasjon av normal colon vev i forhold til tumorvev demonstrerer effekten av AOM-DSS modell. Etter en syklus av DSS behandling, krypt dysplasia og mononukleær celleinfiltrasjon var tydelige. Svulstvev var til stede på både 12 og 16 wk endepunkter. Før avlivning, ble musene behandlet med BrdU i 4 timer og celleproliferasjon ble visualisert ved farging med en BrdU-antistoff. C) Kvantitativ RT-PCR ble benyttet for å analysere
Ptp4a3
genekspresjon i normal tykktarm epitelvev etter behandling med enten AOM eller saltvann-kontroll.
Ptp4a3
ble hevet 73% i tykktarmen vev følgende når målt 8 timer etter injeksjon, og 60% på 24 timer (* = p 0,001; n = 6 /behandlingsgruppen, barer = SEM). D) Western blot av kolon lysatene indikert en økning i PTP4A3 protein følgende AOM eksponering. E) Kvantitativ RT-PCR indikerte endringer i genuttrykk nivåer av
Ptp4a
familiemedlemmer i normal tykktarm og svulstvev.
Ptp4a3
ble løftet 3,7 ganger (** = p 0,01), mens
Ptp4a1 Hotell og
Ptp4a2
nivåene ble betydelig redusert (* = p 0,0001 og p 0,05, henholdsvis) (n = 15, streker = SEM). F) Western blot analyse viser høyere PTP4A3 protein nivåer i colontumorer sammenlignet med normalt vev. G) Western blot kombinert med QRT-PCR-analyse viste også at når man sammenligner
Ptp4a3
mRNA nivåer (nevnt ovenfor hvert kjørefelt) til PTP4A3 protein, høyt genuttrykk syntes å tilsvare høyere protein nivåer.
Knockout av Ptp4a3 undertrykker tarmsvulstdannelse
Hvis du vil utforske en potensiell funksjonell rolle for
Ptp4a3
i tumordannelse, vi utsatt mus til en mye brukt AOM-DSS modell av kolitt-assosiert tykktarmskreft. Villtype og
Ptp4a3
– null-mus ble injisert med en enkelt dose av AOM (12,5 mg /kg) etterfulgt av tre sykluser med 2,5% DSS forbruk (figur 2A.). Denne modellen gir distinkte histologiske forandringer i forhold til normale kontroller, inkludert betennelse svarende til DSS behandling, og etterfølgende dysplasi (Fig. 2B). Svulster var visuelt tydelig i distal kolon av villtype mus på offer på 12 eller 16 ukers etter første AOM behandling og var (Fig. 2B og 3A). Som indikert i figur 3B,
Ptp4a3
-null mus oppviser en 54% reduksjon i tumor nummer (s 0,004) etter 16 ukers behandling. Selv ble observert ved 12 wk i
Ptp4a3
-null mus i forhold til villtype i gjennomsnitt færre svulster, dette var ikke statistisk signifikant (p 0,2). Interessant er antall tumorer (p = 0,05), så vel som tumor-diameter (P 0,001) ble signifikant øket fra 12 til 16 wk, mens
Ptp4a3
-null svulster fant ikke signifikant økning i antall eller størrelse. Den midlere diameter av tumorer fremstilt ved denne modellen var 3-4 mm (fig. 3C).
A) Bildet viser utseendet av villtype og
Ptp4a3
-null tykktarm vev etter 16 ukers behandling med AOM-DSS. B) Det gjennomsnittlige antall tumorer ble registrert i mus med genotype etter 12 og 16 ukers behandling. Det gjennomsnittlige antall tumorer signifikant økt i villtype-mus mellom 12 til 16 ukers tidspunkter (* = p = 0,05). I løpet av denne tiden antall tumorer observert i
Ptp4a3
-null mus var den samme (p = 0,70). Ved 12 uker, hvete mus (n = 6) ikke har vesentlig flere svulster per mus enn
Ptp4a3
-null (n = 5) mus (p = 0,27). På 16 wk, hvete mus (n = 14) viste signifikant mindre svulster per mus enn
Ptp4a3
-null mus (n = 7) (** = p 0,005). C) Tumor-størrelse (målt som gjennomsnittlig tumordiameter for hver mus) ble bestemt på hvert tidspunkt. Tumor diameter ble observert til en betydelig økning i villtype-mus fra 12 til 16 uker (* = p 0,001). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i
Ptp4a3
-null mus fra 12 til 16 uker, eller mellom genotyper i begge tidspunkt. Bars = SEM.
Ptp4a3 er forhøyet i AOM-avledet colontumorer
På grunn av høy uttrykk for PTP4A3 har blitt rapportert i humane primære colontumorer [22], vi undersøkte
Ptp4a3
uttrykk i musemodell for tykktarmskreft. Først ble total mRNA ekstrahert fra tumorvev fra villtype-mus og kvantitativ RT-PCR ble anvendt for å analysere for ekspresjon nivået til hver
Ptp4a
familiemedlem (fig. 2E). I forhold til normal kolon epitel,
Ptp4a3
ble løftet 3,7 ganger i gjennomsnitt (p 0,01). Mens betydelig heterogenitet i
Ptp4a3
uttrykk ble observert, som strekker seg 1,4 til 6,7 ganger oppregulering,
Ptp4a3
mRNA nivåer i svulstvev var gjennomgående høyere enn normalt vev for hver prøve testet (n = 15 ). Interessant, genuttrykk nivåer av
Ptp4a1 Hotell og
Ptp4a2
var begge downregulated 64% og 36% (p 0,0001 og p 0,05), henholdsvis i colontumorer forhold til normalt vev. PTP4A3 protein nivåer i normale kolon epitelceller lysatene var veldig lavt når analysert ved Western blotting (Fig. 2F). I kontrast PTP4A3 var mulig å påvise, men variabel i tykktarm tumorprøver. Som man kunne vente, er det syntes å være noen korrelasjon mellom de PTP4A3 proteinnivåene og mRNA-nivåer (fig. 2G). Mangelen på funksjonelle antistoffer for PTP4A1 og PTP4A2 utelukket evaluere svulst protein nivåer for disse familiemedlemmene.
Tap av Ptp4a3 øker IGF1Rβ og c-MYC uttrykk i tumorer
Vi neste undersøkt lysates hentet fra både villtype og
Ptp4a3
-null colontumorer. Vi først brukt omvendt fase protein array å analysere nivået av over 130 forskjellige proteinprodukter som finnes i hvete og
Ptp4a3
-null svulster (Fig. S5). Mens protein nivåer i disse svulstene utstilt betydelig heterogenitet, to kjente onkogene signalproteiner, den reseptortyrosinkinasehemming IFG1Rβ og transkripsjonsfaktoren c-MYC ble uttrykt på et høyere nivå i
Ptp4a3
-null svulster (fig. 4A). Etter kvantifisering, IGF1Rβ protein var i gjennomsnitt 2,1 ganger høyere (p 0,001) og c-MYC ble om lag 2,5 ganger høyere (p 0,02) i
Ptp4a3
-null i forhold til villtype colontumorer (Fig. 4B-C). I kontrast, gjorde vi ikke observere en betydelig forskjell i AKT aktivering mellom genotyper (fig. 4D). Dette resultatet tyder på at svulster kan potensielt kompensere for
Ptp4a3
mangel om endrede signalveier.
A) Cluster prøve av heatmap generert fra RPPA analyse som ble utført ved hjelp av kolon kreftlysatene fra AOM-DSS behandlet hvete og
Ptp4a3
-null mus. Protein mål var enten høyere (gul), lavere (blå), eller uendret (svart). B) Protein nivåer ble bekreftet ved Western blot analyse tykktarmskreftlysatene fra hvete og
Ptp4a3
-null mus. IGF1Rβ og c-MYC protein ble valgt på grunn av de syntes å være de mest konsekvent oppregulert proteiner i
Ptp4a3
-null prøver. C) Når kvantifisert, IGFIRβ proteinnivået var 2,1 ganger høyere i
Ptp4a3
-null svulster (p 0,001). D) c-myc proteinnivået var 2,5 ganger høyere i
Ptp4a3
-null svulster (p 0,02). E) Nivåene av aktivert AKT, som indikert av fosforylering av Ser473, var ikke signifikant forskjellig ved genotype i forhold til total AKT protein.
Diskusjoner
En rekke gener har vært innblandet i utvikling og progresjon av tykktarmskreft. Forrige genuttrykk profilering studier identifisert 144 gener som er oppregulert i metastatisk leverprøver kolorektal [2]. Den eneste gen, men som konsekvent ble forhøyet i alle de metastatiske prøvene var
Ptp4a3
. Både genamplifisering og forbedret transkripsjonen aktivitet sannsynligvis kausale for høye nivåer. Til tross for den tilsynelatende betydningen av
Ptp4a3
i tumorbiologi, vår forståelse av funksjonaliteten til
Ptp4a3
er arisk begrenset skyldes delvis fravær av informative dyremodeller. Genet målrettet musemodell for avbrudd av
Ptp4a3
genomisk locus som vi har utviklet er nyttig ikke bare for å studere de fenotypiske endringer som skjer med det globale tapet av fosfatase, men også for fremtidige undersøkelser på vev og tidsmessig bestemt gen sletting og samarbeids interaksjoner med andre gener, inkludert de to andre medlemmene av
Ptp4a
familien. Vår modell etablerer at mus som kan overleve i fravær av en funksjonell
Ptp4a3
genet, selv om det var en noe lavere antall hannmus som produseres, og de er i stand til å leve til forfall under normale betingelser uten store helsemessige svakheter . Dette er i motsetning til hva som har blitt rapportert med mus som manglet den svært homolog
Ptp4a2, etter som antas å være den mest allestedsnærværende uttrykt familiemedlem under normale forhold.
Ptp4a2
-null mus viste defekt morkake utvikling og begge kjønn viste veksthemming hos foster og voksne stadier [23].
Ptp4a2
tap reduserer spongiotrophoblast og decidua lag av morkaken svekker næringstransport og forårsaker embryonale vekstretardasjon. Videre tap av
Ptp4a2
resultater i AKT inaktivering, som ikke var tydelig i våre data om
Ptp4a3
tap. Samlet forskjellene i de to genet sletting modellene er konsistente med ikke-overlappende funksjoner av disse to nære fosfatase familiemedlemmer.
Sletting av PTP4A3 protein ble bekreftet ved Western blot analyse ved hjelp av en rekke vev lysatene fra villtype og
Ptp4a3
-null mus. Selv om innledende studier hadde foreslått
Ptp4a3
uttrykk var begrenset til hjerte, skjelettmuskulatur, og bukspyttkjertelen [24], våre data indikerer en mer allestedsnærværende uttrykk mønster. Mens de høyeste nivåene av PTP4A3 ble observert i foster hjerte, proteinet var også påvises ved lavere nivåer i voksen hjerte, skjelettmuskel, milt, bukspyttkjertel, hjerne, lunge, thymus, tykktarm og tynntarm; ingen PTP4A3 protein påvises lever eller nyre.
Fordi menneskelig PTP4A3 er blitt implisert i patogenesen av menneskelig metastatisk kolorektalcancer, undersøkte vi effekten av
Ptp4a3
sletting i en musemodell for tykktarms kreft. Behandling med AOM /DSS er en av de mest populære colon tumor musemodeller og C57BL /6J-stamme som denne modellen ble backcrossed er spesielt utsatt for kolitt-assosiert kreft [13], [16], [17].
Ptp4a3
er tradisjonelt klassifisert som et gen assosiert med metastaser og ikke kjent for å være involvert i de tidlige stadier av kreft progresjon. I denne studien, gir vi dokumentasjon på at
Ptp4a3
mRNA og PTP4A3 protein-nivåene øker raskt etter eksponering for AOM, den innledende skritt i vår tykktarmskreft modell. Dette er viktig bevis som PTP4A3 kan også involvert i preneoplastiske stadium av kreft.
Mus kastes AOM /DSS modell gående utviklet svulster i den distale delen av tykktarmen. Disse primære svulster vises konsekvent høyere nivåer av
Ptp4a3
forhold til normal kolon epitel – lik det som er sett i menneskelige tykktarmskreftpasienter [22]. Spesielt, mus mangel for
Ptp4a3
hadde fram 50% reduksjon i tumordannelse gir ytterligere bevis på at
Ptp4a3
er en viktig formidler av tykktarmskreft progresjon. Likevel er fullstendig fravær av PTP4A3 fosfatase var utilstrekkelig for å avskaffe kolon tumorigenesis, noe som tyder på at en undergruppe av svulstene ikke kan kreve
Ptp4a3
som en driver av sykdommen. Dette støttes av funn at ikke alle svulster i denne modellen hadde høyt. ( 2 ganger oppregulering)
Ptp4a3
uttrykk nivåer
Den dyremodell vi har utviklet presenterer en unik mulighet til å ta rollen som
Ptp4a3
i tumorbiologi. AOM eksponering fører til DNA-skader og gentoksisk stress. En fremtredende svar på DNA-skade er induksjon av
p53
, som kan indusere
Ptp4a3
uttrykk [25] og kan gi en forklaring for induksjon av
Ptp4a3
i tykktarmen av AOM behandlet mus. I tillegg
Ptp4a3
har blitt identifisert som en direkte regulatoriske mål av TGFB signalering i tykktarm kreft celler. Den aktive TGFB signal induserer SMAD3 /4 binding til
Ptp4a3
genomisk locus og dermed hemming av gentranskripsjon [19]. Tap av TGFp er en hyppig observert fenomen i human kolonkreft [26], så vel som AOM musemodell av tykktarmskreft [18]. Det er sannsynlig at denne hendelsen bidrar til forhøyet
Ptp4a3
genuttrykk i kreft gjennom SMAD3 /4 inaktivering. Interessant, en musemodell mangel for
Smad3
har blitt rapportert spontant utvikle tykktarmskreft [27], og
Smad4
mangel sterkt forverret en musemodell for tykktarmskreft [28]. Dannelsen av neoplastiske lesjoner i
Ptp4a3
-null mus kan bli konsekvensen av engasjement av flere vekstfaktor signalveier eller onkogener som IFG1Rβ og c-MYC. c-MYC er kjent for å være økt i svulster etter AOM /DSS behandling og både IFG1Rβ og c-MYC ble markert forhøyet i
Ptp4a3
-null svulster i forhold til villtype avledet svulster.
Mens
Ptp4a3
genprodukt opprinnelig var tenkt å være involvert i tumormetastase og sent stadium sykdommen, våre resultater gir bevis for mulige roller i andre stadier av sykdommen, inkludert pre-neoplastisk transformasjon og tidlig kreftutvikling. Konseptet med terapeutisk målretting
Ptp4a3
kan derfor være attraktive på flere stadier av kreft.
Materialer og metoder
Opprettelse av
Ptp4a3
mutant mus
Den betingede genet målretting vektor ble bygget ved hjelp av en fag-baserte
E. coli
rekombinasjon system [29]. Spesifikke detaljer om vektoren konstruksjon og målretting strategi er beskrevet i fig. S1. Vi har spesielt rettet exon 2, fordi den inneholdt transkripsjonsstartsetet, og som var nødvendig for riktig translasjon av mRNA-transkript. Etter transfeksjon av konstruksjonen i R1 embryonale stamceller [30], ble musene opprettet fra riktig målrettede kloner ved hjelp av standard kimære dyr produksjon teknikker med C57BL /6J blastocyster. Romanen belastningen ble backcrossed til C57BL /6J (The Jackson Laboratory) for 5 generasjoner og mus for eksperimenter ble produsert med heterozygot hekkende par. Genotyping ble utført ved Southern blot-analyse med en radiomerket probe svarende til ~300 bp av exon 6, som var på utsiden av genet targeting vektoren. Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle relevante protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Pittsburgh.
AOM kreft modell
hvete og
Ptp4a3
-null mus (hann, 6 -8 uker) ble administrert en enkelt dose av AOM (12,5 mg /kg) (Sigma) i sterilt saltvann ved intraperitoneal injeksjon. DSS-løsning (2,5%) (MP Biomedicals) ble gitt
ad libitum
etter 7 dager etterfulgt av 14 d av vanlig drikkevann og denne syklusen ble gjentatt totalt 3 ganger, [13]. Eksperimentelle mus ble avlivet ved 12 eller 16 wk etter initiering av behandling, ved hvilket punkt tykktarm vev ble isolert, renset og åpnet i lengderetningen for analyse. Tumor og normalt vev ble enten hurtigfrosset i flytende nitrogen eller neddykket i 10% nøytral bufret formalin. For hver mus, ble enkelte svulster telles og måles med en digital caliper og gjennomsnittlig tumor teller og diameter ble bestemt for hver genotype.
Western blot analyse
Celler og vev ble lysert ved hjelp av RIPA buffer og kvantifisert ved Bradford assay. En total proteinprøve av 40 ug ble separert ved hjelp av SDS-PAGE Novex reagenser (Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner ble blokkert i Odyssey buffer (licor biovitenskap) og inkubert med primære antistoffer over natten etterfulgt av sekundære fluorescerende antistoffer i henhold til produsentens instruksjoner. Vi brukte følgende kommersielt tilgjengelige primære antistoffer: PTP4A3 klone 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-MYC, p-AKT (S473), og AKT (Cell Signaling Technology)
Kvantitativ RT. PCR
Total RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp Trizol reagens som per produsentens protokoll (Invitrogen). En total på 500 ng mRNA ble omdannet til cDNA ved hjelp av iScript første tråd syntese kit (Bio-Rad). Primerne (Tab. S1) som benyttes for target-amplifikasjon ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 500 pM, og sanntids overvåkning av PCR-reaksjonen ble utført på en Biorad iQ5 thermocycler med 2X SYBR grønn Mastermix (Bio-Rad). Følgende program ble kjørt i 40 sykluser: 95 ° C i 0:30; 58 ° C i 1:00; og 72 ° C for 00:30.
Omvendt fase protein array-
Protein lysates (100 ug hver) fra tykktarmskreftprøver (n = 5 /genotype) var denaturert og sendes frosset til MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas) for analyse. Kort fortalt lysatene var to-fold-serie fortynnet i 5 fortynninger og kledd på nitrocellulose-belagt lysbilder, probet med antistoffer, og visualisert ved diaminobenzidin kolo reaksjon. Relative nivåer av protein for hver prøve ble bestemt ved interpolering av hver fortynning kurver fra standardkurven antistoffet lysbilde. Alle datapunktene ble normalisert for protein lasting og forvandlet til lineær verdi. Lineære verdier ble forvandlet til log2 verdi og deretter median-sentrert for hierarkisk klyngeanalyse. Heatmap ble generert i Cluster 3.0 som en hierarkisk klynge bruker Pearson Korrelasjon og et senter metrisk (ytterligere detaljer er gitt er Fig. S5).
statistikker
Statistisk analyse av avkom genotype ble beregnet ved å Chi-squared test sammenligne observerte og forventede resultater. Data fra cellulære tester, western blot og QRT-PCR quantifications ble analysert ved hjelp av 2-tailed t-test. I begge tilfellene ble betydning definert som p≤0.05.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s001 product: (PDF)
Figur S2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s002 product: (PDF)
Figur S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s003 product: (PDF)
Figur S4.
doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s004 product: (PDF)
Figur S5.
doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s005 product: (PDF)
Tabell S1.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0058300.s006 product: (PDF)
Takk
Forfatterne ønsker å takke Carolyn Ferguson for sin tekniske ekspertise og bistand
