Abstract
microRNAs er ikke-kodende RNA som regulerer flere cellulære prosessene under kreft progresjon. Blant ulike microRNAs har MiR-630 nylig blitt identifisert til å være innblandet i mange viktige prosesser i menneske maligniteter. Vi forsøkte å undersøke betydningen og prognostisk verdi av MIR-630 i human magekreft. Magekreft og tilstøtende normale prøver fra 236 pasienter fra som ikke hadde fått neoadjuvant kjemoterapi ble samlet inn. Uttrykket av MIR-630 ble undersøkt av kvantitativ real-time PCR-analyse og sin tilknytning til total overlevelse av pasienter ble analysert ved statistisk analyse. MiR-630 ekspresjonsnivået var signifikant forhøyet i magekreft i forhold til tilstøtende normale prøver. Det er også bevist at MIR-630 ekspresjon var å være forbundet med magekreft invasjon, lymfeknutemetastase, metastaser og fjerne TNM stadium. I tillegg overlevelsesanalyse viste at forhøyet MIR-630-ekspresjon ble assosiert med dårlig total overlevelse av pasienter. Multivariat overlevelsesanalyse viste også at MIR-630 var en uavhengig prognostisk markør etter justert for kjente prognostiske faktorer. Denne studien viste at overuttrykk av MIR-630 og sin tilknytning til tumorprogresjon i human magekreft. Det ga også den første bevis for at Mir-630 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for pasienter med magekreft, som kan være en potensiell verdifull biomarkør for magekreft
Citation. Chu D, Zhao Z, Li Y, Li J, Zheng J, Wang W, et al. (2014) Økt mikroRNA-630 uttrykk på magekreft er assosiert med dårlig Total overlevelse. PLoS ONE 9 (3): e90526. doi: 10,1371 /journal.pone.0090526
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 14. september 2013, Godkjent: 03.02.2014; Publisert: 12 mars 2014
Copyright: © 2014 Chu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No. 81201927, 81272204 og 31270812) og Kina Postdoktor Science Foundation (No. 2012M521862). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste ondartede sykdommer på verdensbasis [1]. Prognosen for magekreft er dårlig og pasienter er vanligvis diagnostisert ved en ganske avansert stadium i de fleste land [2], [3]. Således er den totale 5 års overlevelse på 40%, og den til pasienter med fjernmetastaser er mindre enn 5% [4] – [8]. Omtrent 700.000 mage kreftpasienter dør årlig, og er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Dataene viste at rå dødeligheten av magekreft var 25,2 per 100.000 (32,8 per 100 000 hos menn og 17,0 per 100 000 hos kvinner) [1]. Men det finnes bemerkelsesverdig geografisk variasjon i forekomst av magekreft for østlige land som Kina og Japan har høyest forekomst av magekreft enn vestlige land [9], [10]. I Kina er magekreft den nest hyppigst diagnostisert kreft og den tredje største årsaken til kreftdød, med anslagsvis 464 439 nye tilfeller og 352 315 kreftdødsfall i 2008. Den totale estimerte aldersjusterte insidensraten i 2008 var 29,9 per 100 000 mennesker i Kina [9]. Så gjenstår magekreft et betydelig problem på verdensbasis til tross for en fallende forekomst i ikke bare vestlige land, men også Kina.
microRNAs (mirnas) er en klasse av svært konservert, single-strandet, små ikke-kodende RNA-molekyler, som er kjent som endogene regulatorer av post-transcriptional gene expression regulere uttrykk gjennom translasjonsforskning undertrykkelse og messenger RNA cleavage [11]. De kan hemme genekspresjon på posttranskripsjonelt nivået ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region av mål-mRNA kan resultere i degradering mRNA eller translasjon inhibering, avhengig av graden av komplementær baseparring [12], [13]. Det har blitt allment akseptert at mirnas spille sentrale roller i ulike biologiske prosesser, herunder utvikling, celledeling, differensiering, apoptose og metabolisme [14]. Akkumulert tyder også på at mirnas delta i svulsten angiogenese, invasjon og metastasering av menneskelig kreft [15]. Avvikende miRNA uttrykket har vært forbundet med onkogenese, og noen mirnas fungere som tumor suppressors, mens andre som onkogener, avhengig av deres mål, som kan gi innsikt i diagnose og prognose av menneskelige maligne [16]. Nylig har bevis vist at ekspresjon av mirnas er deregulert i ulike typer humane ondartede sykdommer slik som magekreft, brystkreft, tykktarmskreft, prostatakreft, lungekreft, bukspyttkjertel cancer og kronisk lymfatisk leukemi [17] – [19]. I human magekreft, har flere mirnas med avvikende uttrykk blitt identifisert, for eksempel, MIR-21, MIR-22, MIR-23, MIR-127, MIR-148, MIR-202 og MIR-433, som spilte onkogene eller undertrykkende rolle [20] – [25]. Resultatene indikerte at mirnas kan spille ulike og viktige roller i menneske maligniteter inkludert magekreft. Imidlertid er ekspresjonsprofilen av mirnas høyt vev og krefttype spesifikk og miRNA spesifikk, noe som viser den funksjonelle og kliniske signifikans av et spesifikt miRNA kan gi klinisk relevante innsikt i miRNA funksjon og virkningsfull styring kreft [12], [15]. Så vidt vi vet, til nå, klinisk og prognostisk betydning av Mir-630 uttrykk i magekreft har ikke blitt rapportert ennå.
I denne studien har vi undersøkt uttrykket nivået av MIR-630 i klinisk mage prøver og tilstøtende normalt vev, samt analysere sin tilknytning til total overlevelse av pasienter.
Materialer og metoder
pasienter og prøvene
Denne studien har blitt godkjent av etikkomiteen i den fjerde Military Medical University. Alle medlemmer er involvert har gitt skriftlig informert samtykke. Ferske kliniske mage kreftprøver og tilstøtende normalt vev ble samlet inn fra 236 pasienter som gjennomgikk kirurgi mellom januar 2007 og desember 2008 i Xijing Hospital of Digestive Diseases, fjerde Military Medical University. Ingen av disse pasientene hadde fått kjemoterapi før operasjonen. I tillegg ble det normale vevsprøver tatt fra 18 pasienter som gjennomgikk kirurgi for andre formål enn malignitet som normale kontrollprøver grunner. Den histomorphology av alle vevsprøver ble bekreftet ved Avdeling for patologi, fjerde Military Medical University. Prøvene ble umiddelbart satt inn i flytende N
2 etter kirurgisk reseksjon i 10 minutter, og deretter inn i en -70 ° C fryser for ultra-mRNA-isolering. Pasient klinisk informasjon, slik som alder, kjønn, differensiering status og TNM stadium, ble oppsamlet og lagret i en database. Komplett oppfølging ble gjort tilgjengelig i minst 5 år. Total overlevelse er definert som tiden som har gått fra kirurgi til døden av pasienter med magekreft. Oppfølging informasjon om alle deltakerne ble oppdatert hver tredje måned via telefon besøk og spørreskjema bokstaver. Døden deltakere ble konstatert ved å rapportere fra familien og verifisert av gjennomgang av offentlige registre.
Kvantitativ Real-time PCR
Total RNA ble renset fra alle 236 magekreft og matchende tilstøtende normale prøver av produsenten hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Bare de totale RNA prøver med OD A260 /A280-forhold nær verdi på 2,0, noe som indikerer at RNA er ren, ble deretter analysert. MIR-630 og RNU44 intern kontroll spesifikk cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av genspesifikke primere ifølge fore TaqMan mikroRNA assays protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Revers transkripsjon produktene ble så forsterket og oppdaget av real-time PCR ved hjelp Taqman mikroRNA-analyse (Applied Biosystems) spesifikk for HSA-MIR-630. Hver prøve ble undersøkt i triplikat og rådataene ble presentert som den relative kvantifisering av MIR-630 uttrykk evalueres ved den komparative syklusen terskel (CT) -metoden, normalisert med hensyn til RNU44. Bety normalisert MIR-630 uttrykk ± standard avvik (SD) ble beregnet ut fra tre paralleller analyse. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en ABI 7500 system (Applied Biosystems) og komparativ 2
-ΔΔCt analyse ble utført ved hjelp av SDS 2.2.2 programvare (Applied Biosystems).
Statistical Analysis
Sammenhenger mellom Mir-630 uttrykk og clinicopathological egenskaper ble analysert ved Mann-Whitney test og Kruskal-Wallis test, som passer. Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og forskjeller i overlevelse distribusjoner ble evaluert av log-rank test. Cox proporsjonale farer modellering av faktorer potensielt relatert til overlevelse ble utført for å identifisere hvilke faktorer som kan ha en betydelig innflytelse på overlevelse, og kontrollerer for alder, kjønn og differensiering status. Forskjeller med
P
verdi på 0,05 eller mindre ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
MiR-630 Expression Oppdaget i Gastric Cancer
I den real-time PCR-analyse, 236 tilfeller av magekreft, matchende tilstøtende normale prøver og 18 tilfeller av normale kontrollprøver ble undersøkt. Relativ uttrykk for MIR-630 normalisert til RNU44 i magekreft ble funnet å være 8,51 ± 1,63 (Mean ± SD), mens det i matchende tilstøtende normalt var 3,25 ± 0,63. Statistiske resultater viste at ekspresjon av MIR-630 i magekreft var signifikant høyere enn i tilstøtende og normale kontrollprøver (
P
0,05). Resultatene indikerte at MIR-630 kan spille en onkogen rolle i magekreft. For å lette videre analyse på sammenhengen mellom Mir-630 uttrykk og kliniske funksjoner, vi manuelt definerte magekreft med Mir-630 uttrykk lavere enn 3,88 (Mean + SD uttrykk for MIR-630 i tilstøtende prøver) så lavt Mir-630 uttrykk gruppe mens Prøver med MIR-630 uttrykk ikke lavere enn 3,88 ble definert som høy Mir-630 uttrykk gruppe. Dermed blant 236 tilfeller av magekreft, ble 98 tilfeller tildelt lav uttrykk gruppe mens 138 saker ble tildelt høyt uttrykk gruppe.
Forholdet mellom MiR-630 til Clinicopathological Kjennetegn på Gastric Cancer
som vår undersøkelse viste at Mir-630 uttrykk ble økt i magekreft, som indikerte at MIR-630 kan fungere som et onkogen rolle i magekreft. Vi undersøkt videre foreningen av MIR-630 uttrykk med clinicopathological karakteristika for pasienter å utforske sin potensielle rolle i magekreft progresjon. Statistiske analyseresultater, viste i tabell 1, viste at økt Mir-630 uttrykk var forbundet med avansert magekreft invasjon siden videregående Mir-630 uttrykk var oftere å bli oppdaget i T3 og T4 svulster (
P
= 0,007 ). Såvidt tumormetastase ble vurdert, var forhøyet MIR-630 uttrykk relatert til positive lymfeknutemetastaser og fjerne for høy MIR-630 ekspresjon var oftere som skal påvises i tumorer med positive lymfeknuter (
P
0,001) eller fjernmetastaser (
P
= 0,002). I tillegg, når vi målte pasientenes kliniske funksjoner ved TNM staging system, fant vi at Mir-630 uttrykk var signifikant assosiert med TNM stadium av magekreft fordi høy Mir-630 uttrykk var mer sannsynlig å bli oppdaget i tumorer med avansert TNM stadium (
P
0,001). Disse resultatene antydet at MIR-630 kan spille en onkogen rolle i progresjonen av magekreft. Men den positive rasjon av MIR-630 ble ikke funnet å være assosiert pasientenes kjønn (
P
= 0,788), alder (
P
= 0,471), differensiering status (med
P
= 0.890), tumor hotellet (
P
= 0,835) eller lauren klassifisering (
P
= 0.160).
Forholdet av speil 630 til Total overlevelse av pasienter «med gastric Cancer
Under hele oppfølgingsperioden, 130 av de 236 pasientene (55,1%) med magekreft hadde dødd og median total overlevelse av alle rekrutterte pasientene var 48 måneder. Kaplan-Meier analyse ble brukt for å undersøke den prognostiske verdien av Mir-630 uttrykk for total overlevelse av pasienter med magekreft. Resultatene viste at pasienter med magekreft av høy Mir-630 uttrykk tendens til å ha dårligere total overlevelse (log rank test:
P
0,001, figur 1). Median overlevelsestid for pasienter med lav MIR-630 uttrykk kan ikke beregnes fordi mer enn 50% av pasientene som overlevde i løpet av oppfølgingsperioden. Mens postoperative median overlevelse av pasienter med høy Mir-630 uttrykk var 34 måneder (95% KI: 28,2 til 39,8). Når ujusterte hazard ratio (HR) ble vurdert med lav Mir-630 uttrykk som referanse (1,00), pasienter med magekreft av høy Mir-630 uttrykk hadde en 2,28 ganger høyere risiko for død (95% KI: 1,57 til 3,32;
P
0,001). Såvidt clinicopathological egenskaper ble vurdert, lymfeknutemetastase (log rank test:
P
= 0,002), fjernmetastaser (log rank test:
P
0,001) og TNM stadium (log rank test:
P
0,001) ble også vist seg å være assosiert med total overlevelse siden pasienter med magekreft av lymfeknutemetastaser, fjernmetastaser eller avansert klasse tendens til å ha dårligere total overlevelse og økt risiko for død. Men kjønn (log rank test:
P
= 0,168), alder (log rank test:
P
= 0,572) differensiering status (log rank test:
P
= 0,156), tumor hotellet (log rank test:
P
= 0,632) eller lauren klassifisering (log rank test:
P
= 0,573) hadde ingen prognostisk verdi på total overlevelse av pasienter med magekreft .
som Mir-630 uttrykk ble vist seg å være assosiert med total overlevelse av pasienter i univariat overlevelse analyse, vi videre undersøkt om MIR-630 kan tjene som en uavhengig prognostisk markør for pasienter med magekreft. Fordi lymfeknutemetastaser og fjernmetastaser informasjonen ble inkludert i TNM stadium data, vi utførte Cox-modellen, som er justert etter kjønn, alder og TNM stadium. Resultatene viste at den justerte HR høy Mir-630 uttrykk gruppen var 3,51 (95% KI: 1,83 til 6,72;
P
0,001). Resultatene viste at MIR-630 var en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse for pasienter med magekreft. Dermed økte Mir-630 uttrykk kan være en indikator på dårlig total overlevelse uten hensyn til alder, kjønn eller TNM stadium (tabell 2).
Diskusjoner
Ifølge nyere studier, mer enn 1900 mennesker mirnas har blitt identifisert, som er estimert til å regulere over 60% av genene hos pattedyr [26]. På grunn av sin store betydning i reguleringen av genekspresjon, har det blitt allment akseptert at mirnas er involvert i flere cellulære funksjoner inkludert spredning, apoptose og differensiering, og dermed er det iverksatt i ulike fysiologiske og patologiske prosesser som spenner fra utvikling til kreft [27 ] – [29]. Tidligere undersøkelse kartlagt uttrykk profiler av miRNA i stadium I ikke-småcellet lungekreft for å identifisere mønstre som kan forutsi tilbakefall etter kirurgisk reseksjon fant at mir-630 var en av de mest miRNA blant de 1000 classifiers identifisert [30]. En annen studie på ikke-småcellet lunge funnet at MIR-630 kunne regulere cisplatin-indusert kreft celledød, noe som indikerer MIR-630 var en potensiell modulator av cisplatin respons i ikke-småcellet lungekreft [31]. MiR-630 ble også funnet å være oppregulert i hode og nakke plateepitelkarsinom etter cisplatin behandling og kan modulere protein uttrykk for ATG5, ATG6 /BECN1, ATG10, ATG12, ATG16L1 og UVRAG [32], [33]. Nylig studie viste at oppregulering av MIR-630 i kreft i bukspyttkjertelen celler kan indusere apoptose ved å målrette IGF-1R [34]. Siden individuelle mirnas i forskjellige krefttyper kan ha et stort antall forskjellige gen mål, og dermed har forskjellige funksjoner i forskjellige maligniteter. Så kan den funksjonelle oppdagelsen av individuelle mirnas aktivere dypere innsikt i regulering av genekspresjon og kompleksiteten av kreft progresjon.
I denne studien har vi undersøkt MIR-630 mRNA uttrykk ved real-time PCR-analyse i 236 tilfeller av magekreft fra pasienter som ikke hadde fått neoadjuvant kjemoterapi. Basert relative uttrykk beregning, analyserte vi foreningen av MIR-630 med clinicopathological egenskaper samt prognose for pasientene. Resultatene viste at Mir-630 uttrykk ble økt i magekreft sammenlignet med i tilstøtende og normale kontroll vev for høy ekspresjon av MIR-630 var mer sannsynlig å bli oppdaget i magekreft prøver, noe som indikerer en mulig deltakelse på kreftutvikling. Det er også funnet at MIR-630 ekspresjon var nært knyttet til magekreft invasjon, lymfeknutemetastase, fjern metastase og TNM scene for høy ekspresjon av MIR-630 var mer hyppig for å påvises i tumorer med dyp invasjon, lymfeknutemetastase, fjernt metastaser eller avansert TNM stadium, noe som tyder på mulig deltakelse av MIR-630 på magekreft invasjon og metastasering. Sammen med de ovennevnte bevis, ble det derfor foreslått at MIR-630 kan spille viktige roller i magekreft kreftutvikling og progresjon.
Som Mir-630 uttrykk ble funnet å være assosiert med magekreft invasjon og metastasering, med tanke på invasjonen av kreft til nærliggende vev og metastaser til distale vev er viktige faktorer som påvirker prognosen for pasienter, kan MIR-630 være en potensiell prognostisk markør for pasienter med magekreft. For å undersøke den prognostiske rollen MIR-630 på magekreft, utførte vi Kaplan-Meier analyse av total overlevelse. Resultatene viste at pasienter med magekreft av høy Mir-630 uttrykk tendens til å ha dårligere total overlevelse sammenlignet med pasienter med svulst i lav Mir-630 uttrykk, noe som antydet at Mir-630 uttrykk var en prognostisk markør for pasienter med magekreft. For ytterligere å evaluere den prognostiske verdien av MIR-630 i magekreft, vi utførte Cox modell som ble justert for kjønn, alder og TNM stadium av pasienter. Resultatene viste at økt MIR-630 ekspresjon var en markør for dårlig total overlevelse uavhengig av justert faktorer, således, MIR-630 kunne benyttes til å bestemme pasientens prognose med tanke ut TNM stadium. Resultatene indikerte at MIR-630 kan utgjøre en molekylær prognostisk markør tilsetningsstoff til TNM stadium for pasienter med magekreft, identifisere høy risiko individer som er mer sannsynlig å ha svulst tilbakefall i klinisk praksis, og dermed gode kandidater til å motta mer aggressiv behandling. Disse resultatene var i samsvar med undersøkelser rettet mot ikke-småcellet lungekreft, som angir konsistensen i mir-630 funksjon i disse typer tumor. Dermed blir positiv kobling mellom MIR-630 overekspresjon og dårlig prognose kan ikke bare brukes til å identifisere magekreftpasienter med høyere risiko for tidlig tumor tilbakefall, men også for å tilveiebringe verdifulle ledetråder for å forstå den mulige mekanisme for magekreft invasjon og metastase.
i konklusjonen, har vi bevist at Mir-630 uttrykk ble økt i magekreft og assosiert med tumorprogresjon. Denne studien viste også for første gang at Mir-630 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor av pasienter med magekreft. Derfor er det mulig at MIR-630 kan spille en viktig rolle i invasivitet og metastasering av magekreft. Det er også mulig at MIR-630 tjener som prognostisk markør i klinisk praksis, og selv inhiberingen for MIR-630 ved hjelp av bestemte inhibitorer kan bli en ny terapeutisk metode for behandling av magekreft.
