Abstract
Det er vist at dysregulerte JAK signalering forekommer i en rekke forskjellige krefttyper. Spesielt kan mutasjoner i JAK2 resulterer i konstitutiv aktivering av STAT transkripsjonsfaktorer og føre til onkogen vekst. JAK kinaser er etablert HSP90 klient proteiner og her viser vi at romanen lite molekyl HSP90 inhibitor ganetespib (tidligere STA-9090) viser potent
in vitro Hotell og
in vivo
aktivitet i en rekke solid og hematologiske kreftceller som er avhengig av JAK2 aktiviteten for vekst og overlevelse. Av notatet, ganetespib behandling resulterer i vedvarende uttømming av JAK2, inkludert konstitutivt aktiv JAK2
V617F mutant, med påfølgende tap av STAT aktivitet og redusert STAT-målet genuttrykk. I motsetning til behandling med pan-JAK inhibitor P6 resultater i bare forbigående effekt på disse prosessene. Videre skiller disse modusene for intervensjon, RNA og protein uttrykk studier viser at ganetespib tillegg modulerer cellesyklusregulerende proteiner, mens P6 ikke. Samtidig virkningen av ganetespib på både cellevekst og celledeling signale betyr potent antitumor effekt i musemodeller av transplantater og spres JAK /STAT-drevet leukemi. Samlet sett våre funn støtter HSP90 hemming som en roman terapeutisk tilnærming for å bekjempe sykdommer avhengig JAK /STAT signalering, med multimodal handling av ganetespib demonstrere fordeler fremfor JAK-spesifikke hemmere
Citation. Proia DA, Foley KP, Korbut T: Sang J, Smith D, Bates RC, et al. (2011) Fasetterte Intervensjon av HSP90 inhibitor Ganetespib (STA-9090) i kreftceller med Aktivert JAK /STAT signalering. PLoS ONE 6 (4): e18552. doi: 10,1371 /journal.pone.0018552
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: 26 januar 2011; Godkjent: 04.03.2011; Publisert: 14 april 2011
Copyright: © 2011 Proia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er eller var ansatt i Synta Pharmaceuticals, Inc. og alle unntatt RC Bates og AF Rosenberg hold enten lager eller opsjoner i Synta Pharmaceuticals, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
JAK2 er et ubikvitært uttrykt medlem av Janus-assosiert kinase (JAK) familien av ikke-reseptor-tyrosinkinaser som virker til å mediere signalnettverk nedstrøms av cytokin og vekstfaktorreseptorer [1]. Upassende aktivering av JAK-signalering ligger til grunn for celle-proliferasjon og overlevelse i en rekke forskjellige faste tumorer [2], [3] og hematologiske neoplasmer [4]. Spesielt har en aktiverende punktmutasjon i JAK2 (JAK2
V617F) blitt beskrevet med høy frekvens i kroniske myeloproliferative sykdommer (MPD) [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10] og konstituerende JAK2 aktivering forårsaket av translokasjon har blitt rapportert i ulike typer leukemi [11], [12], [13].
Aktivert cytokin-JAK komplekser rekruttere og fosforylere effektor molekyler inkludert Signal Givere og aktivatorer av transkripsjon (STAT) proteiner [14]. STAT proteiner mediere en rekke biologiske prosesser, inkludert cellevekst, differensiering, apoptose, inflammasjon og immunrespons [15]. To statistikk i særdeleshet, STAT3 og STAT5, representerer de store underlag for JAK2 som styrer myelopoeisis [16], [17] og kan bidra til å mobil transformasjon [18], [19]. Deres vedvarende aktivering har vært knyttet til økt tumorcelle-proliferasjon, overlevelse, metastase og tumor-fremmende inflammasjon i både faste og hematologiske tumorer [20]. Følgelig hemme denne signaleringsakse ved bruk av bestemte lavmolekylære inhibitorer av JAK2 er nylig blitt undersøkt som et punkt for terapeutisk intervensjon i flere humane tumor indikasjoner [3], [21], [22], [23], [24] .
Heat shock protein 90 (HSP90) er en molekylær anstand kreves for post-translasjonell stabilitet i sine protein underlag eller «klient proteiner». Kreftceller inneholder forhøyede nivåer av aktiv HSP90 [25] og, fordi mange klient proteiner spiller avgjørende roller onkogene, kreftceller er spesielt følsomme for hemming HSP90. Dessuten er en unik egenskap ved målretting HSP90 at inhibering resulterer i at samtidig blokade av flere onkogene signalkaskader, overvinne potensiell vei overflødighet, og allergifremkallende kreftceller overfor kjemoterapeutiske midler [26], [27], [28], [29]. Således representerer HSP90 et attraktivt molekylære mål for utvikling av nye legemiddel [28], [30], [31]. Relevans her, er JAK kinaser etablert HSP90 kunder som tyder på at HSP90 hemming kan være effektive i behandling av JAK-rettet neoplastiske lidelser [32], [33].
For å teste denne hypotesen, vi har brukt den syntetiske lite molekyl inhibitor ganetespib (STA-9090), en resorcinol-inneholdende forbindelse som ikke er relatert til geldanamycin, som binder i det ATP-bindende domene av HSP90. I prekliniske studier har stoffet vist lav nanomolar aktivitet
in vitro
mot en rekke humane kreftcellelinjer og potent antitumor effekt mot menneske xenograft modeller [34], [35]. Ganetespib er i kliniske studier for både solid tumor og hematologiske maligniteter. Her viser vi at ganetespib potent induserer apoptose i forskjellige tumorlinjer avhengig vedvarende JAK /STAT-signalisering for vekst og overlevelse. Vi viser videre at medikamentet endrer også mange elementer av cellesyklusregulering i kreftceller, en aktivitet fraværende fra en JAK-spesifikk inhibitor.
In vivo
, ganetespib koordinatsystem innvirkning på både cellevekst og celledeling gir potent antitumor aktivitet i JAK /STAT-drevet modeller av menneskelig leukemi. Dermed hemming av HSP90 aktivitet representerer en lovende metode for å bekjempe sykdommer avhengig konstituerende JAK /STAT signalering, med ganetespib viser potensielle terapeutiske fordeler fremfor JAK-spesifikke hemmere.
Resultater
Ganetespib hemmer JAK2- mediert signaltransduksjon og proliferasjon i hematologiske kreftformer
med lav nanomolar potens, ganetespib nedsatt cellulær levedyktighet i en gruppe av human hematologiske og solide tumorcellelinjer som er valgt for deres avhengighet av JAK /STAT signalering og varierende krefttype (fig. 1A). I hver av de linjene som ble testet, ganetespib var mer potent enn den ansamycin HSP90-inhibitor som 17-AAG. Av notatet ganetespib var større enn 100 ganger mer potent enn 17-AAG i SET-2 og HEL92.1.7 leukemiceller, cellelinjer som bærer konstitutivt aktive JAK2
V617F mutasjoner som fungerer som deres onkogene drivere.
(A) SET-2, HEL92.1.7, MV4-11, ble NCI-H1975 og DU145 cellene behandlet med ganetespib eller 17-AAG over et bredt doseområde (0,0001 til 1 uM) i 72 timer og celleviabilitet vurdert av Alamar blå flekker. (B) Ganetespib viser mer holdbar hemming av JAK /STAT signalering i forhold til P6. HEL92.1.7-celler ble dyrket i nærvær av 250 nM ganetespib eller 1000 nM P6 og høstet mellom 0 og 48 timer. Ekspresjonsnivåene av de angitte proteiner ble bestemt ved Western blot. (C) Ganetespib er vesentlig mer potente enn 17-AAG. SET-2-celler ble dosert med de angitte konsentrasjoner av ganetespib eller 17-AAG i 24 timer og analysert for å fastslå JAK /STAT protein og målrette nivåer ved hjelp av antistoffer er angitt.
Bruk HEL92.1.7 celler , sammenlignet vi JAK /STAT-inhiberende aktivitet av ganetespib til forbindelsen pyridon-6 (P6) [36], en reversibel, ATP-konkurrerende pan inhibitor av Jaks (fig. 1B). Ganetespib og P6 hver blokkert JAK2 avhengige signalering, noe som gjenspeiles ved tap av fosfor-STAT3 og fosfor-STAT5, og ERK signalering. Imidlertid ganetespib var minst fire ganger mer potent og trykkes STAT aliserte lengre enn P6. Ganetespib behandling alene førte til de målrettede, proteasomer avhengige (data ikke vist) tap av JAK2 og fosfo-AKT proteinnivåer (Fig. 1B), begge klient HSP90 proteinene. Dermed ganetespib behandling resulterer i vedvarende hemming av flere onkogene mål i disse cellulære modeller av JAK2-drevet malignitet. Lignende virkninger på JAK /STAT signale ble sett med SET-2 celler, hvor 50 nM ganetespib var i stand til å destabilisere JAK2 tilstrekkelig til å resultere i tap av aktivert (
dvs.
, fosforylert) STAT3 og STAT5 uttrykk (Fig. 1C ). 17-AAG viste sammenlignbare effekter som ganetespib men var 200 ganger mindre potent, i tråd med levedyktighet data som er beskrevet ovenfor. Samlet utgjør disse dataene viser at ganetespib besitter overlegen JAK /STAT hemmende aktivitet både P6 og 17-AAG i form av styrke eller varighet av respons.
Ganetespib opphever JAK /STAT signalering i solide svulster
i tillegg til sin forekomst i hematologisk malignitet, er onkogene STAT-aktivering også utbredt i et spekter av faste tumorer. For eksempel er vedvarende aktivert STAT3 funnet i 50% av lungekreft adenocarcinomer og er primært observert i tumorer mutasjoner i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) [37], [38]. NCI-H1975 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje uttrykker HSP90 klienten EGFR
L858R /T790M, en konstitutivt aktivert og erlotinib-resistent form av EGFR, og ganetespib behandling resulterte i en doseavhengig reduksjon i EGFR ekspresjon i disse cellene (fig. 2A). Videre ganetespib også induserte sterk nedbrytning av JAK2 og tap av fosforylert STAT3 på en doseavhengig måte. Inaktivering av AKT og GSK3P, proteiner viktige i regulering av apoptose, ble observert med en tilsvarende dose respons på det av JAK2 /STAT3 signalering. Nylig ble det vist at JAK2 kan modulere aktiviteten av ytterligere apoptotic regulatorer som BAD og BCL-XL for å fremme celle overlevelse [21]. I samsvar med dette, har vi oppdaget at en samtidig reduksjon i nivået av fosforylert BAD (fig. 2A), og reduserer således den pro-apoptotiske aktivitet av dette proteinet. Disse dataene antyder en mulig mekanisme for å redegjøre for den cytotoksiske respons observert med ganetespib behandling (Fig. 1a).
(A) Klienten protein downregulation i NSCLC. NCI-H1975-celler ble dosert med de angitte konsentrasjoner av ganetespib i 24 timer, og deres cellelysater analysert for å bestemme JAK /STAT og HSP90 klient proteinnivåer ved hjelp av antistoffene som er angitt. (B) Ganetespib blokker IL-6 indusert og konstituerende STAT3 aktivitet i NSCLC celler. HCC827 lungecancerceller ble behandlet med økende konsentrasjoner av ganetespib eller P6 i 24 timer fulgt av en 15 min stimulering med eller uten 50 ng /ml humant rekombinant IL-6. Nivåene av JAK2, total og fosfo-STAT3, og PIM2 ble analysert ved hjelp av western blot. GAPDH inngår som en lasting kontroll. (C) Client protein nedbrytning i prostatakreftceller. DU145 cellene ble dosert med graderte konsentrasjoner av ganetespib i 24 timer og cellelysater lagt western blot å bestemme JAK /STAT og målrette proteinnivåer ved hjelp av antistoffer indikert. (D) Funksjonell HSP90 er nødvendig for JAK2, men ikke JAK1, stabilitet i DU145-celler. DU145 cellene ble behandlet med DMSO (kontroll, C), 15 nM, 60 nM eller 240 nM ganetespib for enten 24 eller 48 timer og lysatene autosøk av western blot med de angitte antistoffer.
JAK /STAT signale aksen er en nøkkel modulator av cytokin-signalisering og en foreslått mekanisme for avvikende STAT3 aktivering i lungekreft involverer oppregulering av autokrine og /eller parakrin IL-6 signal [2]. Derfor undersøkte vi om ganetespib kunne hemme denne signal i NSCLC celler. I fravær av ytre ligand, HCC827 celler behandlet med ganetespib viste en nedgang doseavhengig i JAK2 uttrykk, som fører til et tap av aktivitet STAT3 og ekspresjon av nedstrøms STAT target PIM2 (Fig. 2B). Biokjemisk hemming av JAK2 ved P6, om enn ved høyere konsentrasjoner, på samme måte nedregulert konstitutive STAT3 aktivitet, men påvirket ikke de totale JAK2 proteinnivåer. Tilsvarende begge forbindelser blokkert JAK /STAT signale stimulering når veien ble aktivert av eksogene IL-6 behandlinger (Fig. 2B).
feilregulert IL-6 /JAK2 signale har også vært innblandet i prostatakreft tumorigenesis [39 ], [40]. Den DU145 prostatakreft-cellelinje uttrykker en autokrin IL-6 signalsløyfen [41] og ble nylig rapportert å være følsomme for virkningene av en ny lite molekyl JAK2 inhibitor
in vitro
og
in vivo
[3], [41]. Ganetespib var en potent induser av celledød i denne linje (fig. 1A). Biokjemisk karakterisering av DU145-celler viste tilsvarende hemmende effekter på signalisering JAK2 følgende ganetespib behandling (Fig. 2C). Tap av JAK2, fosfor-STAT3 og fosfor-SHP2, en JAK2 samspill fosfatase viktig for JAK2 signaloverføring, ble observert etter tilsetning av ganetespib. Interessant, den beslektede JAK1 kinase uttrykkes i denne cellelinjen ble ikke målrettet for nedbrytning, men i stedet viste seg å øke etter ganetespib eksponering (fig. 2D). Lignende resultater ble oppnådd for PC-3 prostata cancer cellelinje (data ikke vist). Disse data viser at selektiv nedbrytning av JAK2 i DU145 prostata celler var tilstrekkelig til å oppheve påfølgende aktivering av STAT3 signalering.
HSP90 hemming nedregulerer transkripsjon av JAK /STAT signal mål og cellesyklusgener
I HEL92 .1.7 erytroleukemia celler, biokjemiske hemming av JAK2 av P6 behandling resulterte i et tap av mobilnettet levedyktighet, men med 30 ganger mindre styrke enn ganetespib (IC
50 verdiene 600 vs 20 nM) (fig. 3A). Å sammenligne den cellulære virkningene av hver inhibitor, vi først identifisert under hvilke vilkår JAK2 aktiviteten ble redusert til tilsvarende nivåer av hvert legemiddel basert på deres kinetiske og potens forskjeller. Som vist i figur 3B, 4 timers P6 (1000 nM) og 24 timers ganetespib (250 nm) behandlinger ble valgt på grunn av sammenlignbare effekter på STAT3 /5 signalering. RNA uttrykk profilering på disse tidspunktene avslørt, som forventet, at mange JAK /STAT målgener (som farlige stoffene og PIM familiemedlemmer) ble nedregulert av både narkotika (Fig. S1, Tabell S1). Imidlertid ble ytterligere gener endret av ganetespib behandling som var upåvirket i de P6-behandlede celler (fig. 3 C, D). I tillegg fører til den forventede oppregulering av mange heat shock protein gener, ganetespib behandling også selektivt endret uttrykk for et stort sett av gener som er involvert i cellesyklusrelaterte aktiviteter, inkludert DNA replikasjon og reparasjon (BRCA1 /2), cellesyklusregulering (CDC2 , CDC25), sentrosomen /spindel aktiviteter (BUB1 /3, CENPE /M, KIF14, FAM33A), kromosom kondens (TOP2A, NCAPG), og replikering (RFC3 /4, MCM familie) (fig. S1). Faktisk, analyse av endrede gener ved hierarkisk clustering og berikelse poengsum avslørte at modulatorer av celledeling var de mest fremtredende prosesser redusert med ganetespib behandling (tabell 1).
(A) Sammenlignbare effekter av ganetespib og P6 på HEL92 .1.7 svulst celle levedyktighet. HEL92.1.7 celler ble behandlet med ganetespib eller P6 over et bredt doseområde (0,0001 til 10 UM) i 72 timer og celleviabilitet vurderes av Alamar blå. (B) Temporale og doseavhengige effekter på JAK /STAT mål etter ganetespib og P6. HEL92.1.7 celler ble behandlet med ganetespib eller P6 for 4 og 24 timer og cellelysatene lagt western blot å bestemme JAK2 /STAT og target proteinnivåer ved hjelp av de angitte antistoffer. (C) Affymetrix Genechip analyse av celler behandlet med ganetespib og P6. HEL92.1.7-celler behandlet med 250 nM ganetespib i 24 timer eller 1000 nM P6 i 4 timer. Gene uttrykk nivåer i DMSO behandlet (dvs. kjøretøy kontroll) celler (X-aksen) er tegnet opp mot de av legemiddelbehandlede celler (Y-aksen). (D) Venn-diagram over antall gener forskjellig regulert av ganetespib og P6.
Modulation av cellesyklus protein uttrykk ved ganetespib induserer vekst arrest
For å utvide disse funnene, vi så eksperimentelt på effekter på cellesyklusen. Ganetespib indusert en timelig G
1 og G
2 /M arrest i HEL92.1.7 celler, med samtidig tap av S-fasen (fig. 4A). I motsetning til dette, P6 behandling induserte akkumulering i G
1 fase bare, uten tap av S-fase eller G
2 /M arrest. Vi undersøkte også de målrettede effekter av ganetespib på kritiske formidlere av cellesyklus divisjon på proteinnivå. Vi har observert redusert proteinnivåer av cyklinavhengig kinase 1 (Cdk-1), en sentral regulator av G
2 /M sjekkpunktet, etter en 24 timers eksponering for ganetespib, en effekt som varte inntil minst 48 timer (fig. 4B). I motsetning til dette, P6 hadde ingen virkning på Cdk1 uttrykk. Videre ble nivået av fosfo-Chk2, en annen i ett kontrollpunkt kinase, redusert med ganetespib behandling. Lignende resultater ble funnet for fosfor-Chk1 (data ikke vist). Som vist på figur 4C, ble destabilisering av cyklin kinaser også forbundet med en tidsmessig opphopning av cykliner A1 og B1 i respons til medikamenttilsetningen. Videre ble det observert disse effektene av ganetespib på både JAK2 /STAT signalering og cellesyklusregulering i flere typer kreft, inkludert brystkreft (MCF-7), gastrointestinale stromal (GIST882), bukspyttkjertel (HPAF) og prostata (DU145) tumorcellelinjer ( fig. 4D). Samlet er disse ekstra påvirkninger på celledeling maskiner tyder på at ganetespib besitter bestemte fordeler i forhold til JAK-spesifikke hemmere for kontroll STAT-drevet malignitet.
(A) HEL92.1.7 celler ble behandlet med 250 nM ganetespib eller 1000 nM P6 (eller DMSO som en kontroll) og cellesyklusfordelingen bestemmes ved hjelp av strømningscytometri ved 3, 5, 9 og 24 timer etter behandling. (B) HEL92.1.7-celler ble dosert med ganetespib (250 nM) eller P6 (1000 nM) i 48 timer. Cellene ble høstet på angitte tidspunkter og nivåene av total og fosfor-Cdk1, fosfor-Chk2 og GAPDH analysert ved western blot. (C) Kinetikk av ganetespib virkninger på JAK /STAT og cellesyklus proteinekspresjon. HEL92.1.7 celler ble behandlet med 100 nM ganetespib, høstet hver time i løpet av en 11 timers tid selvfølgelig, og med forbehold om western blot med de angitte antistoffer. (D) MCF-7, GIST882, HPAF og DU145 cellene ble dosert med graderte konsentrasjoner av ganetespib for 24 timer og analysert ved western blot hjelp de angitte antistoffer.
Ganetespib forlenger overlevelse i en JAK2
V617F-mutant musemodell for human leukemi
for å avgjøre hvorvidt disse to aktivitetene ganetespib på JAK2 /STAT signalering og cellecyklusprogresjonen observert
in vitro
sette til antitumor effekt
in vivo
, vi etablert en orthotopic leukemi modell ved hjelp HEL92.1.7 celler. Dette resulterte i disseminert sykdom med sykelighet typisk som følge av bakben paralyse forårsaket av ryggsøylen metastaser (data ikke vist). For å studere effekten av ganetespib på overlevelse, begynnende en dag etter tumorcelle implantasjon, stoffet ble dosert intravenøst ved sitt høyeste ikke-alvorlig toksisk dose (HNSTD) på 25 mg /kg på en 5 x /uke plan til og med dag 19. Som vist i figur 5A, ganetespib behandling mer enn doblet median total overlevelse (. 76,5 dager
vs
34 dager,
P
0,0001). Den ganetespib Behandlingen ble godt tolerert, med ingen signifikant tap av kroppsvekt funnet etter 3 uker med dosering (fig. S2). Den økte overlevelse av de behandlede dyr som korrelerte med dramatisk redusert tumorcellebelastning i deres benmarg og ryggmargen, som bestemt ved histologisk analyse (Fig. 5B).
(A) Kaplan-Meier-analysen av total overlevelse i en leukemi modell etablert av iv injeksjon av HEL92.1.7 celler i SCID-mus, noe som resulterte i utvikling av disseminert sykdom. Begynnelsen en dag etter tumorcelle implantasjon, ganetespib var intravenøs dosert ved sin HNSTD (25 mg /kg) på et fem-ganger per uke plan i 3 uker ved dag 19 (n = 10 /gruppe). *
P
0,0001; 2-sidig log-rank test. (B) Ganetespib hemmer dramatisk tumorcelle byrde i ryggmargen og tilstøtende benmarg. Immunohistochemistical farging (H E) av lumbalcolumna tverrsnitt fra kjøretøykontroll (venstre panel) eller ganetespib behandlet (høyre panel) dyr. Innfellinger er utvidet i de nedre panelene. Original forstørrelse: 40 × i øvre panelene; 200 × i nedre paneler.
Ganetespib viser potent
in vivo
effekt hos STAT5 drevet AML xenoimplantater
MV4-11 akutt myelogen leukemi celler uttrykker konstituerende STAT5 aktivitet som en konsekvens av en indre tandem-duplisering (ITD) mutasjon i FLT3 reseptor tyrosinkinase, en annen klient HSP90-proteinet [42], og som derfor representerer en alternativ modell av STAT-drevet onkogenese. Disse cellene er meget følsomme for ganetespib
in vitro plakater (fig. 1A), og vi evaluerte deres dose-respons til ganetespib behandlinger i xenografter. Ganetespib ble administrert intravenøst til tumorbærende SCID-mus på enten daglig eller ukentlig HNSTD på 25 mg /kg eller 150 mg /kg, henholdsvis. Som vist i figur 6A, den ukentlige behandlingsskjemaet resulterte i signifikant og doseavhengig tumorvekst-inhibering, mens den daglige doseringsregime (25 mg /kg 5 x /uke, slik det brukes i ortotopisk modell ovenfor) resulterte i betydelig tumorregresjon ( 84%). I begge doseringsregimer, ble tumorvekst undertrykt i opptil en uke eller mer når behandlingen ble avsluttet. Utover denne perioden, noe som gjenspeiles av den en gang per uke behandling kohort, tumorvekst kan sette i gang.
(A) SCID mus ble subkutant implantert med MV4-11 akutt myelogen leukemi celler. Mus med etablert MV4-11 xenografter (100-200 mm
3, n = 8 mus /gruppe) var intravenøst dosert (pilspisser) med ganetespib på enten 25 eller 150 mg /kg én gang i uken i 3 uker, eller ved HNSTD på 25 mg /kg fem ganger per uke, som angitt. % T /C-verdier, er angitt til høyre for hvert vekstkurven og feilstolpene er de S.E.M. (B) ganetespib hemmer STAT-5 fosforylering og Cdk1 uttrykk i tumorxenotransplantater i SCID-mus. SCID-mus med MV4-11 tumorer (n = 4 mus /gruppe) ble behandlet med bærer eller ganetespib på enten 25 mg /kg eller 150 mg /kg ved de angitte tidspunkter mellom 6 timer og 144 timer (6 dager). Svulster ble resected og nivåene av p-STAT5, Cdk1, Hsp70 og GAPDH ble bestemt ved western blot.
For å avgjøre hvorvidt disse tumorrespons korrelert med target modulasjon
in vivo
, ytterligere mus som bærer MV4-11 xenotransplantater ble behandlet med en enkelt dose av kjøretøyet alene eller ganetespib ved 25 eller 150 mg /kg. Svulster ble høstet mellom 6 og 144 timer senere og farmakodynamiske analyser ble utført ved å undersøke uttrykk nivåer av fosfor-STAT5, Cdk1 og Hsp70 (Fig. 6B). I samsvar med
in vivo
tumorvekst data, ble det observert doseavhengige effekter på varigheten av målet hemming innenfor svulster. En enkelt 150 mg /kg dose av ganetespib trykt aktivering av STAT5 og undertrykket ekspresjon av Cdk1 i mer enn tre dager, i samsvar med dens effekt i en gang-per-uke dosering. Ved 25 mg /kg, ble potent inhibering av STAT5 aktivitet oppnådd i løpet av 6 timer som var tap av Cdk1 ved 24 timer etter ganetespib administrering. Av notatet, STAT5 aktivitet gjenfunnet i disse svulstene etter 24 timer, mens Cdk1 uttrykk forble undertrykt gjennom minst 48 timer selv med denne lave dosen (Fig. 6B). Mens relativt rask gjenvinning av STAT5 aktivering bør ha tillatt tumor å starte på nytt vekst, synes det mer holdbar undertrykkelse av cellesyklus regulatorer for å ha holdt veksten av tumorer arrestert før neste medikamentdosering. Disse funnene gir sterke bevis for at den koordinere tap av cellevekst og celledeling signaler orkestrert av ganetespib konto for potent antitumor aktivitet av stoffet i denne modellen.
Diskusjoner
Vedvarende JAK /STAT aktivering er onkogene og karakteristisk for mange menneskelige malignitet og dermed gir en attraktiv punkt intervensjon for molekylært målrettede behandlingsformer. I denne studien, viser vi at ganetespib har dyp antitumor aktivitet i en rekke JAK /STAT-drevet kreft, og enda viktigere, kan oppheve avvikende signale gjennom flere mekanismer. Ganetespib er rettet mot en effektiv oppstrøms regulatoren JAK2, inkludert det konstitutivt aktiv JAK2
V617F mutant, for degradering i en rekke hematologiske og fast tumortyper med påfølgende lang tap av STAT3 og STAT5 signalering. Funnene ikke bare understreker den patogene rollen STAT signalering i tumorigenesis, men støtter den potensielle terapeutiske nytten av ganetespib for en rekke humane kreftformer. I denne forbindelse, den vedvarende inhibering av JAK2 /STAT signaliseringsaksen oppnås ved ganetespib var mer effektiv enn det som sees med det pan-JAK-inhibitor P6, og ganetespib var jevnt mer potent enn den ansamycin basert HSP90-inhibitor som 17-AAG i våre analyser.
JAK2 mutasjon er en vanlig måte for å stimulere onkogene STAT aktivitet, forstyrrelser i andre signaleringsnett, slik som de som er mediert av EGFR, IL-6 /IL-6R eller FLT3, kan også bidra til å aktivert STAT signalisering i kreftceller [2], [43]. Våre resultater viser at HSP90 hemming forstyrrer effektivt disse også, med ganetespib potent nedverdigende EGFR og blokkerer både IL-6- og FLT3-mediert aktivering av STAT proteiner. Således, mens ganetespib pålegger sine farmakologiske effekter på HSP90 direkte nedstrøms konsekvensene klart innebære et betydelig utvalg av klient proteiner og biokjemiske mekanismer. På denne måte kan HSP90-hemming ganetespib ses på som en multi-nodal modalitet snarere enn en mål-spesifikk terapeutisk tilnærming, slik som den som skapt ved en JAK2 eller annen kinase inhibitor (figur 7).
Ganetespib utøver potente antitumor effekter gjennom forstyrrelse av flere signalkaskader, inkludert JAK /STAT signalaksen og cellesyklus meklere. (A) JAK /STAT veien er en hovedsignaleringsmekanisme for et bredt utvalg av cytokiner og vekstfaktorer. Hyperaktive av denne veien, gjennom ligand-aktiverte reseptor-tyrosin-kinaser (EGFR eller FLT3), cytokin-reseptor-mediert aktivering av JAK2, eller aktiverende mutasjoner som for eksempel JAK2
V617F, er ofte forbundet med onkogenese. Regulering av cellesyklus innebærer en rekke svært koordinert og viktige prosesser, herunder sjekkpunkt kontroll og avdekking /reparasjon av genetisk skade, kritisk for riktig progresjon og celledeling. (B) Inaktivering av HSP90 etter ganetespib resultater i proteasome-mediert degradering av oppstrømssignalkomponentene (angitt i grått) kritisk for STAT, MAPK og AKT aktivisering, og dermed resultere i veksthemming. I tillegg ble samtidig nedregulering av viktige cellesyklusregulerende gener som induseres av ganetespib (som vist i tabell 1) resulterer i cellesyklusarrest i G
1 og G
2 /M-fasene av cellesyklusen, og etterfølgende tap av S-fasen.
i ytterligere støtte for dette, mens både ganetespib og P6 endre et felles sett av JAK /STAT mål, bare ganetespib behandling utøves medfølgende effekter på cellesyklusen regulatoriske maskineri. I de leukemiske celle data som presenteres, eksponering for ganetespib resulterte i G
1 og G
2 /M arrest, blant annet gjennom nedbrytning av Cdk1 og atypisk opphopning av cykliner A1 og B1. Videre ble S-fasen avskaffet. I tillegg til gener assosiert med DNA-replikasjon og cellesyklus, flere komponenter i sentrosomen og spindelen ble påvirket på transkripsjonsnivået ved ganetespib, i overensstemmelse med tidligere funn at disse komponentene er syntetisert i S-fasen, og som HSP90 er avgjørende for sentrosomen sammenstilling [44], [45]. Viktigere var dette en generell reaksjon i alle celler studert, som vi har observert liknende kombinatoriske effekter på JAK /STAT inhibering med tap av cyklin-avhengig kinase-aktivitet i AML, bryst, mage stromal, bukspyttkjertel og prostata tumortyper.
Ganetespib viste også potent
in vivo
aktivitet. I mus med etablert MV4-11 (STAT5-drevet) xenografter, ukentlig administrering av ganetespib signifikant hemmet tumorvekst i en doseavhengig måte. Videre er en daglig doseringsplan av ganetespib var også svært effektivt og resulterte i betydelig tumorregresjon under legemiddeladministrering. I denne modellen, vises tumorvekst omtrent en uke etter behandling ble stoppet (for høy dose, 1 x /uke kohort). Viktigere, vår farmakodynamisk analyse viste at disse tumorresponser korrelert med graden og varigheten av STAT5 og Cdk1 proteintap indusert av de varierende doseringsregimer. Den tette binding av STAT5 nedregulering med inhibering av tumorvekst seks timer etter legemiddeladministrering enten dose indikerer rask respons av denne signalveien til den legemiddeladministrering. På /kg dose 150 mg, STAT5 signalering, men ikke Cdk1 uttrykk, returneres av seks dager. Den vedvarende tap av Cdk1 og andre cellesyklusproteiner opprett antagelig cellesyklus-stans og hindrer vekst fra re-forekommende mellom dosene på ukentlig plan, selv i nærvær av re-emergent STAT5 aktivitet. Tilsvarende ble Cdk1 ekspresjon undertrykket lenger i forhold til STAT5 ved /dose 25 mg kg, og er sannsynligvis ansvarlig for den potente aktiviteten til ganetespib på hyppigere 5 x /uke regime. Disse dataene antyder sterkt at ganetespib administrasjon på hver rute var nok til å avskaffe både overlevelse og cellevekstsignaler lenge nok til å hindre tumorvekst. Fordi ganetespib antagelig fører til tap av enda flere klient proteiner, dens potente antitumoraktivitet sannsynligvis gjenspeiler den kombinerte effekten på disse ekstra målproteiner også.
I et system som mer nøyaktig etterligner patologien til leukemiske sykdom, effekten av ganetespib ble også undersøkt i en disseminert sykdom modell ved hjelp HEL92.1.7 celler. Ganetespib effektivt økt overlevelse i denne ortotopisk modell, mer enn det dobbelte av median overlevelsestid for musene. Langvarig overlevelse var assosiert med dramatisk redusert tumorbyrde i benmargen, som dokumentert av betydelig redusert infiltrasjon av humane leukemiceller og redusert ryggsøylen metastaser. Kollektivt, disse dataene er konsistent med en direkte effekt av ganetespib på leukemicellevekst
in vivo Hotell og demonstrere potensialet terapeutiske nytten av denne forbindelsen for JAK2
V617F-drevet malignitet.
årsakssammenheng mellom konstitutiv JAK2 aktivitet og neoplasi har resultert i utviklingen av en rekke sterke og selektive JAK2 lavmolekylære inhibitorer [46].
