Abstract
Nyere studier har antydet at avvikende K-ras signalering er ansvarlig for å utløse immunologiske reaksjoner og betennelser drevet tumorigenesis. Interleukiner IL-17, IL-22 og IL-23 er blitt rapportert i en rekke typer av kreftformer, men den nøyaktige mekanistiske rollen til disse molekylene gjenstår å bli belyst. Med den rollen K-ras og involvering av interleukiner i kolorektal tumorgenese, har forskningsinnsats rapportert for første gang, viser det differensielt uttrykte interleukin IL-17, IL-22 og IL-23-nivåer er assosiert med K-ras i en scene-spesifikk måte sammen kolorektal kreft progresjon. Nærmere bestemt a) virkningen av K-ras signale ble undersøkt i den totale ekspresjon av interleukiner i pasienter med kolorektal kreft og friske kontroller, og b) en forbindelse ble etablert mellom muterte K-ras og cytokiner GM-CSF og IFN-γ. Resultatene indikerer at spesifikke interleukiner er differensielt uttrykt i K-ras-positive pasienter og bruk av K-ras-inhibitor Manumycin A avtar både interleukin nivåer og apoptose i Caco-2-celler ved å hemme celle-levedyktighet. Endelig er betennelse-drevet GM-CSF og IFN-γ nivåer modulerte gjennom interleukin-ekspresjon i tumorpasienter, med interleukin-ekspresjon i tarmlumen og kreftvev mediert av avvikende K-ras-signalering. Samlet funnene a) viser at interleukin uttrykk er påvirket av ras signalanlegg og spesifikke interleukiner spiller en onkogen promoter rolle i kolorektal kreft, fremhever den molekylære koblingen mellom betennelse og tumorigenesis, og b) fremhever de sammenvevde molekylære sammenhenger som fører til nye terapeutiske tilnærminger i fremtiden
Citation. Petanidis S, Anestakis D, Argyraki M, Hadzopoulou-Cladaras M, Salifoglou A (2013) Differential uttrykk av IL-17, 22 og 23 i utviklingen av tykktarmskreft hos pasienter med K-ras mutasjon: Ras Signal Hemming og Høring med GM-CSF og IFN-γ. PLoS ONE 8 (9): e73616. doi: 10,1371 /journal.pone.0073616
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 21 juni 2013; Godkjent: 23 juli 2013; Publisert: 06.09.2013
Copyright: © 2013 Petanidis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delfinansiert av EU-ESF og greske nasjonale midler gjennom NSFR-Heracleitus II-programmet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest mest utbredte formen for kreft på verdensbasis. Foreløpig, i de fleste utviklingsland, er det ingen organisert screening og feilsøkingsprogrammer [1], [2]. Tidligere studier har vist at kolorektal kreft er en multifaktoriell sykdom, hvori ekspresjon av mange spesifikke gener, kjent som onkogener eller tumor-suppressorer, er unormalt endret [3]. I denne forbindelse, PIK3CA-genet, som er involvert i den PI3K /AKT signalveien, er oppregulert i tykktarmskreft. Den tumorsuppressorgenet fosfatase og tensin homolog (PTEN) er nedregulert på grunn av en genetisk mutasjon eller sletting [4]. Men molekylære mekanismer for kolorektal kreftutvikling gjenstår å bli belyst. Mot slike tiltak, er det viktig å identifisere spesifikke molekylære markører for påvisning og identifisering av mekanismer som bidrar til tykktarmskreftutvikling. En slik representative biomarkør er K-ras, et onkogen med guanosin trifosfat (GTP) bindende egenskaper [5]. På grunn av sin evne til å interagere med nøkkelsignalmolekyler, inkludert signal transduseren og aktivator av transkripsjon (STAT), fosfoinositid 3-kinase (PI3K) og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), leverer K-ras-genet en viktig funksjon i celledeling, cellevekst og differensiering. Dermed er mutasjoner i K-ras-genet (spesielt, single nucleotide erstatninger) innblandet i de fleste typer svulster, inkludert lunge adenokarsinom, lungekreft, ductal carcinoma i bukspyttkjertelen, og tykktarmskreft [6].
i løpet av de siste årene har bevis vist at interleukiner utføre viktige funksjoner i tumorutvikling, celledifferensiering, inflammasjon og metastase [7], [8]. I dette henseende, IL-17, noe som i stor grad er fremstilt av aktiverte T-lymfocytter minne, stimulerer både medfødt immunitet og vertens forsvar, og spiller en aktiv rolle i inflammatoriske sykdommer, autoimmune sykdommer og kreft. Mer spesifikt, IL-17 induserer ekspresjon av nukleær faktor-kappa B (NF-kB), kjemokiner CXCL8, CXCL6 og CXCL1, vekstfaktorer G-CSF, GM-CSF (granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor), IL-6 og adhesjonsmolekyler (ICAM-1), som fører til forsterket nøytrofil akkumulering, granulopoeisis, og inflammatoriske responser [9], [10]. På den annen side, IL-22 virker som en formidler av cellulære inflammatoriske responser ved å aktivere intracellulære kinaser (JAK1, Tyk2, og MAP-kinaser), og transkripsjonsfaktorer slik som STAT3 [11]. Videre, IL-22 viser anti-apoptotiske og tumorogene funksjoner, med nylige data som viser at over-ekspresjon av det molekylet beskytter lungecancer-cellelinjer fra apoptose via a) aktivering av STAT3 og nedstrøms anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl- xL, og b) inaktivering av ekstracellulære signalregulerte kinaser [12]. Likeledes spiller IL-23 en nøkkelrolle i kronisk intestinal inflammasjon og dets opp-regulering i maligne vev paralleller utvidet nivåer av «metastatisk biomarkør» matriksmetalloproteinase MMP-9, tumornekrosefaktor TNF-alfa, og økte nivåer av angiogenese [13 ], [14], [15].
i et forsøk på å oppdage molekylære forbindelser mellom tumorigen og immuno-betennelse veier i kreft fysiologi, ble forskning lansert i våre laboratorier for å sondere i samspillet og potensielle sammenvevde roller som de nevnte molekylære mål kan spille i kolorektal flertrinns kreft progresjon. For å oppnå dette, rapporterer vi heri for første gang at a) den spesifikke interleukinene blir oppregulert i kolorektal karsinom sammenlignet med friske kolorektal vev, b) interleukiner er over uttrykt i alle K-ras-pasienter, og kan fremme cellevekst og inhibere celle apoptose i Caco-2 tykktarmskreftceller gjennom ras signalveien, c) bruk av K-ras inhibitor Manumycin En avtar interleukin nivåer, og reduserer apoptose i Caco-2 tykktarmskreftceller ved å hemme celle levedyktighet, og d) GM-CSF og IFN-γ (interferon gamma) moduleres gjennom interleukin uttrykk enten positivt eller negativt. De kollektive observasjoner kaster lys på den funksjonelle sammenhengen mellom interleukiner i betennelse, ras-signalering og tykktarms tumorigenesis, og dermed potensielt hjelpe til med utviklingen av fremtidig kreft gjenkjenning og behandlingsformer.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført med godkjenning av Institutional Review Board av AHEPA Hospital, Medical School, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki. Papiret tilfreds PLoS ONE retningslinjer vedrørende menneskelige subjekt forskning. En skriftlig informert samtykke ble mottatt fra hver pasient. Skriftlig samtykke ble innhentet, før operasjonen, fra pasienter frivillig involvert i bruk av vev utelukkende for forskningsformål. Pasientene hadde lest og forstått pasienten informasjonsdokument gitt, og mål og metoder for denne studien hadde vært fullt forklart dem. Pasientene som deltok hadde gitt skriftlig informert samtykke til forfatterne av dette manuskriptet for publisering av disse dataene. Den kliniske undersøkelsen ble gjennomført i henhold til retningslinjene uttrykt i Helsinkideklarasjonen.
Reagenser
Manumycin A ble kjøpt fra Sigma (Sigma Tyskland, Europa). DMEM-HEPES, PBS (fosfatbuffer saltvann) FBS (føtalt bovint serum), og Trypsin-EDTA-reagenser ble kjøpt fra Invitrogen (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). DMSO (dimetyl sulfoksyd) og Tris-EDTA (Tris-etylendiamintetraeddiksyre) ble anskaffet fra Applichem (Applichem, Darmstadt, Tyskland). K-ras (A-18) geitepolyklonalt IgG-pepperrot (HRP), mus anti-geit IgG-HRP, og GAPDH (L-20) geitepolyklonalt IgG-HRP antistoffer for Western blot analyse ble hentet fra Santa Cruz ( Santa Cruz, California, USA). Den humane IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF og IFN-γ ble påvist ved anvendelse av anti-humane monoklonale antistoffer fra Santa Cruz. For fremstilling av vandige stamløsninger (1,0 u), ble Manumycin A oppløst i 10 mM Tris, pH 7,4. Den Manumycin En stamoppløsning ble filtrert gjennom en 0,22 um sprøytefilter og deretter porsjonert og lagret i mørke ved romtemperatur. Tris-EDTA (TE) buffer ble fremstilt av en 1 M Tris, pH 8, og en 100 mM EDTA-stamløsning. Sluttkonsentrasjonene var 50 mM Tris og 1 mM EDTA. Den så forberedt lager ble filtrert gjennom et 0,22 mikrometer filter, deretter porsjonert og lagret i mørke ved romtemperatur.
Pasient
En totalt 92 kolorektalcancer (CRC) pasienter, 37-88 år, var fra AHEPA Hospital, Medical School, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki (tabell S1). Av disse pasientene, 28 næret K-ras mutasjoner (24 med G12V og 4 med G12D). Disse pasientene gjennomgikk reseksjon av tykk- og endetarmskreft (stadier B1-D) mellom 2009 og 2012. I tillegg 56 friske frivillige som a) møtte kravene til å ha matchet kjønn og samme alder med prøver av CRC pasienter, og b) utstilt ingen colonic adenomer, ble valgt som kontroller. Pasienter med inflammatoriske tilstander, inkludert smittsomme eller kollagen sykdommer, ble ekskludert. Alle pasientene ble klassifisert i henhold til UICC scene klassifikasjoner som bruker resected prøver. Blodprøver ble oppnådd ved venepunksjon før kolorektal inngrep. Hver prøve ble sentrifugert ved 3000 g i 5 minutter og deretter frosset ved -80 ° C inntil analyse.
DNA og RNA ekstraksjon
Formalin-fast, parafininnstøpte pasienttumorsnitt ble utvalgt av en patolog for å bekrefte diagnosen og definere tumor beriket områder for disseksjon. De isolerte kreftceller ble lysert i buffer (0,2 M tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% SDS, 1 M natriumacetat) inneholdende proteinase K ved 60 ° C i 72 timer og DNA-ekstraksjon ble utført med bruk av Qiagen DNA og RNA Purification Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Aten, Hellas). For RNA-ekstraksjon, kreft celler ble resuspendert i 400 ul RNA lyseringsbuffer (0,5 M EDTA, 10% SDS, 1 M Tris pH 7,5) supplert med 300 mg proteinase K, og inkubert ved 60 ° C i 16 timer inntil vevet hadde blitt fullstendig løst. RNA ble renset ved Trizol reagens (Invitrogen, Paisley, UK) og ble deretter behandlet med DNase for å unngå genomisk DNA-forurensning, og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Enzym-bundet immunosorbentbestemmelser (ELISA)
Før analysering, frosne vevsprøver ble brakt til romtemperatur. Deretter ble de vasket i en isotonisk oppløsning av natriumklorid (Sigma), kuttet i biter, veid og homogenisert ved 4 ° C i lyseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT 1). Prøvebehandling fant sted i en masse skala fra 1 g vev /10 ml lyseringsbuffer. De homogeniserte vev holdt ved -20 ° C i 24 timer og deretter sentrifugert ved 20000 g i 15 min ved 4 ° C. Supernatanter (10 ul per brønn) ble brukt for kvantitativ stadium-spesifikke (B1, B2, C1, C2, D) påvisning av IL-17, IL-22 og IL-23 ved enzymbundet immunosorbentanalyse fra Cytoscreen (Biosource International , Camarillo, CA). Deteksjonsgrenser for ELISA kits, som spesifisert av produsenten, var 9 pg /ml (IL-17), 8 pg /ml (IL-22) og 4 pg /ml (IL-23). Manumycin En behandling ble påført på alle scene D pasientprøver for alle de tre undersøkte interleukiner.
revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
RT-PCR ble utført på pasient vevsprøver for IL -17, IL-22, IL-23, GM-CSF og IFN-γ. GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase) ble anvendt som en intern kontroll. Amplifikasjon ble utført i et totalvolum på 20 ul per reaksjon, inneholdende 10 ul av PCR-Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Storbritannia), 5 ul av primere (1 pmol /ul), og 5 pl av cDNA (40 ng RNA) . RT-PCR-primere for IL-17, 1L-22, IL-23, GM-CSF, IFN-γ og GAPDH er oppført i Tabell S2. PCR-reaksjonsparametre ble satt som følger: 95 ° C i 15 minutter etterfulgt av 40 sykluser med PCR-reagerende ved 94 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Smelting kurve analyse av amplifiseringsprodukter ble utført ved slutten av hver PCR-reaksjon ved å øke temperaturen 60-95 ° C med en temperaturovergangshastighet på 0,1 ° C per sekund, slik at vi kan skille ekte produkter fra ikke-spesifikke produkter og primer dimerer. PCR-produktene ble også separert på en 1,5% agarosegel for å visualisere dannelsen av korrekte PCR-produkter. Den relative kvantifiseringen (RQ) av genuttrykk ble beregnet ved 100% effektiv PCR, hvor hver CT verdien av reaksjonene var normalisert til GAPDH mRNA uttrykk.
K-ras mutasjon Detection og sekvensanalyse av K-ras G12 kodon
Alle pasientkreft vevsprøver var snap-frosset og bevart i flytende nitrogen før bruk. Parafinsnitt ble deretter fremstilt og en seksjon fra hvert tilfelle ble valgt for Hematoxylin-eosin-farging. En erfaren patolog analysert Hematoxylin-Eosin delen for å bekrefte tilstedeværelse av svulstvev. Deretter ble vevsprøver fra minst fem seriesnitt macrodissected for å sikre at prøvene inneholdt minst 80% tumorceller. DNA ble isolert fra disse vevsprøver ved å bruke Qiagen DNA-ekstraksjon Kit (Qiagen, Berlin, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble mutasjoner i kodon 12 i K-ras exon 1 detektert i disse genomiske DNA-prøver ved PCR-baserte direkte sekvensering. PCR primere for K-ras som ble brukt var K-ras-Forward: 5′-AAGGCCTGCTGAAAGTGACTG-3 «og K-ras-Omvendt: 5′-CTGGTGCAGGACCATTCTTCAG-3». PCR-reaksjonen ble utført i et totalvolum på 50 ul inneholdende 150 ng av det ekstraherte genomiske DNA. PCR-amplifikasjon betingelsene var som følger: initial denaturering ved 94 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 55 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 s, med en endelig forlengelsestrinn ved 72 ° C i 5 minutter i en TP-600 thermal cycler (Takara). PCR-produkter ble deretter analysert ved hjelp av 2,5% agarosegelelektroforese og renset for videre direkte DNA-sekvensering gjennom en ABI-3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Europa).
Immunhistokjemisk analyse av IL-17, IL-22, og IL-23
Voks deler av humane tykktarm biopsier fra pasienter med kolorektal kreft ble behandlet med anti-humant IL-17, anti-humant IL-22, og anti-humant IL-23 monoklonale antistoffer (mAb) ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Farging med mus lgG1 isotype ble anvendt som den negative kontroll. Bilder ble innhentet gjennom en Carl Zeiss mikroskop ved hjelp av bildeanalyse programvare (Carl Zeiss, Berlin, Tyskland).
Western blot analyse av IL-17, IL-22 og IL-23
Collected kolorektal pasient vevsprøver ble vasket to ganger med iskald PBS og lysert i 100 mL iskald lyseringsbuffer per 1 × 10
6 celler. Lysatene ble inkubert på is i 10 minutter, vortex-blandet i 45 s og holdt på is i ytterligere 10 min. Etter sentrifugering ved 14.000 g og 4 ° C i en periode på 15 minutter, ble supernatanten oppsamlet og proteiner ble kvantifisert ved Bradford-metoden. Lysatet proteiner oppløst i 6xLaemmli prøvebuffer ble separert (30 ug /spor) ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (10% akrylamid) og elektro-overført til PVDF (polyvinyliden difluorid) membraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk i TBST-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,6), ble membranene inkubert i 90 min med den passende fortynning av det primære antistoff i TBST pluss 1% fettfri melk. Etter vasking ble membranene inkubert med passende fortynning av pepperrotperoksidase-konjugert sekundært antistoff i TBST pluss 1% ikke-fettholdig melk. Til slutt ble blottene utviklet av ECL (forbedret kjemiluminescens) og digitalisert ved en BioSpectrum 500 Imaging System. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll i alle forsøkene.
ELISA SPOT for GM-CSF og IFN-γ
IFN-γ-produserende celler fra pasientblodprøver ble kvantifisert med en IFN-γ ELISPOT kit (Diaclone, Besançon, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner, med mindre modifikasjoner. Membraner ble belagt med humane IFN-y-antistoff og inkubert over natten ved 37 ° C. Deretter, 1 x 10
5 PBMC (mononukleære celler fra perifert blod) fra pasienter med kolorektal kreft ble tilsatt til platene og inkubert i 26 timer ved 37 ° C med 5% CO
2. Celler ble fjernet, og de biotinylerte antistoffer mot humant IFN-γ ble tilsatt på membranene. Flekker ble tellet ved hjelp av en automatisk plateteller fra Applied Biosystems (Applied Biosystems, Europa)
GM-CSF-produserende celler fra PBMC fra pasienter ble kvantifisert ved anvendelse av en GM-CSF ELISPOT-kit (R blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time i en 5% CO
2 fuktet kammer, og deretter farging ble utført. Observeres gjennom et Carl Zeiss fluorescens mikroskop, med påvisning ved 570 nm, er normale celler ikke er farget, mens apoptotiske celler har en sterk rød fluorescens.
Statistical Analysis
Student «s t-test og enveis og to-veis ANOVA tester ble anvendt for statistisk analyse av dataene. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad 5,1 (GraphPad, La Jolla, USA). Saker med P verdier av 0,05 eller 0,01 ble ansett som statistisk signifikant (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).
Resultater
interleukinhemmere og K-ras Korrelasjon i Colorectal Cancer Stage Progresjon
De nivåer av IL-17, IL-22 og IL-23 i kreftpasienter og friske kontroller ble bestemt ved hjelp av menneskelig interleukin ELISA Immunoassay, Western blot, og RT- PCR-teknikker.
IL-17
i begynnelsen var IL-17 uttrykk nivåer målt ved påfølgende stadier av tykktarmskreft og hos friske kontroll vev ved hjelp av ELISA. Resultatene viste at IL-17 ekspresjonsnivåene var generelt høyere i K-ras positive kreftvev (fra 170 pg /ml i B1 til 247 pg /ml i D) sammenlignet med K-ras negative prøver (fra 150 pg /ml i B1 til 225 pg /ml i D) (P 0,05) (figur 1A). Analyse av IL-17 proteinnivåer langs kreft trinn B1-D i pasienter viste at de var signifikant høyere i forhold til a) tilsvarende nivåer av K-ras-negative pasienter (62% vs. 38%), og b) friske kontroller ( 62% vs. 16%) (figur 2A). I tillegg ble mRNA nivået av IL-17 bestemt i K-ras-positive prøver. En betydelig økning i mRNA IL-17 nivåer ble observert (figur 2B). For å undersøke virkningen av K-ras-mutasjon (G12V) på interleukin ekspresjon, ble den ras-farnesyltransferaseinhibitor Manumycin A påført på normale og stadium D pasientprøver, på grunn av den selektive overekspresjon av det interleukin på det aktuelle tidspunkt. Ved slutten av den Manumycin En behandlings (10 μΜ), en signifikant reduksjon (P 0,001) i IL-17-nivåer ble observert (figur 1A). En tilsvarende nedgang i K-ras positive stadium D Prøvene ble eksemplifisert ved protein og mRNA nivåer (P 0,001 for protein nivåer, P 0,01 for mRNA nivåer) (figur 3A-B). Forsøkene indikerer viktigheten av muterte K-ras signale i IL-17-ekspresjon.
Bestemmelse av interleukin (A) IL-17, (B) IL-22, og (C) IL-23-konsentrasjoner (pg /ml) i tumorvev av K-ras positive, K-ras negative kolon kreftpasienter og kontrollpasienter i de ulike stadier av tykktarmskreft progresjon. Manumycin A ble påført på normale og stadium D-pasientprøver. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av prøver for hver gruppe som er involvert. Stor bar viser sammenligning mellom pasient scenen D og scene D + Manumycin behandlingsprøver.
(A) Protein uttrykk nivåer av IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF og IFN -γ. GAPDH ble anvendt som en lastekontroll for Western blot-analyse. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Densitometrisk analyse av hvert proteinnivået ble beregnet fra gjennomsnittet av tre forsøk. Hver verdi ble uttrykt som forholdet mellom den målte protein til GAPDH nivå (P 0,001). (B) mRNA ekspresjonsnivåer av IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, og IFN-γ fra colon cancer vev som utføres ved hjelp av RT-PCR-analyse. 5 ug av total-RNA ble isolert fra cancervev. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Effekt av Manumycin En behandlings (10 uM) på (A) mRNA-ekspresjonsnivåene av IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, og IFN-γ i K-ras-positive pasienter med kolorektal kreft som utføres ved hjelp av RT-PCR-analyse. Pasienttrinnet D tykktarmceller ble behandlet med Manumycin A (10 uM) i 24 timer, før RT-PCR. 5 ug av total-RNA ble isolert fra behandlede kolon celler. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (B) protein expression nivåer av IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, og IFN-γ i K-ras positive pasienter med kolorektal kreft som utføres av Western Blot-analyse. Pasienttrinnet D tykktarmceller ble behandlet med Manumycin A (10 uM) i 24 timer, før protein kvantifisering. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
IL-22
Tissue IL-22 nivåer ble betydelig hevet i K-ras negative gruppen sammenlignet med pasienter som bærer K-ras mutasjon (fra 94 pg /ml vs. 80 pg /ml i B1 til 216 pg /ml vs. 150 pg /ml i D) (P 0,05 for B1-C1, P 0,01 for C2-D) ( Figur 1B). I tillegg, protein og mRNA-nivåer av IL-22 var signifikant høyere i K-ras negativ gruppe. Spesielt blant disse pasientene, ble protein IL-22 nivåer forhøyet i K-ras negative gruppen (84% vs. 60%) (P 0,001) (figur 2A). Dessuten, IL-22 mRNA-nivåer i K-ras-positive gruppen var lavere i forhold til K-ras negativ gruppe (P 0,001) (figur 2B). Tilsetning av Manumycin A 10 μΜ for normale og trinnet D pasientprøver forårsaket en reduksjon i IL-22 nivåer (P 0,001 for proteinnivåer, P 0,01 for mRNA-nivåer). (Figur 1B, 3A-B)
IL-23
ELISA, mRNA og protein analyser viste at K-ras-positive pasienter viste en økning i IL-23 uttrykk i forhold til K-ras negative (P 0,01 for B1, P 0,05 for B2-D) og friske kontrollgruppen (P 0,001) (figur 1C, 2A-B). For å bestemme sammenhengen mellom K-ras tilstedeværelse og IL-23 uttrykk, ble Manumycin A lagt til normale og scene D pasientprøver og IL-23 protein og mRNA nivåer i K-ras-positive pasienter ble bestemt (figur 1C, 3A-B) . Resultatene viser at inhibering av K-ras fører til en betydelig reduksjon i IL-23 nivåer (P 0,001 for proteinnivåer, P 0,01 for mRNA-nivåer), for derved å etablere en korrelasjon mellom K-ras og IL-23 nivåer
GM-CSF
for å undersøke mulige mekanismer for GM-CSF engasjement i ulike stadier av tykktarmskreftutvikling, ble uttrykket av GM-CSF overvåket og kvantifisert ved ELISPOT, Western blot, og RT- PCR-metoder. For GM-CSF ELISPOT ble celler fra nylig isolerte PBMC fremstilles og anvendes for GM-CSF deteksjon. Funnene viser en gradvis økning av GM-CSF nivåene under tykktarmskreft progresjon, spesielt i faser C2 og D (P 0,001) (Figur 4A, Figur S1). Videre GM-CSF protein og mRNA nivåene var signifikant høyere positive i K-ras, scene D pasienter (P 0,001) (figur 2A-B) sammenlignet med K-ras negative og friske kontrollpasienter, noe som indikerer en indusert GM-CSF aktivering i løpet av tykktarmskreft stadium progresjon tumorigenesis (figur 4A, Figur S1). De observerte resultatene er i samsvar med de siste resultatene indikerer viktigheten av GM-CSF i K-ras positive tykktarmskreft tumorigene prosesser (se nedenfor). Manumycin A ble tilsatt til normale og trinnet D pasientprøver (figur 4A) og GM-CSF-protein og mRNA-nivåer i K-ras-positive pasienter ble bestemt (figur 3A-B). Resultatene viser at inhibering av K-ras fører til en betydelig nedgang i GM-CSF-mRNA og proteinnivåene (P 0,001 for proteinnivåer, P 0,05 for mRNA-nivåer), for derved å etablere en korrelasjon mellom de to molekyler
i (A) GM-CSF ELISPOT av PBMC ble oppnådd fra pasienter før kirurgi. Mononukleære celler ble stimulert og ble undersøkt for GM-CSF-sekresjon. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av de ulike gruppene. (B) IFN-y ELISPOT av PBMC ble oppnådd fra pasienter før kirurgi. Mononukleære celler ble stimulert og ble undersøkt for IFN-γ sekresjon. Alle forsøk ble utført in triplo. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av de ulike gruppene. Stor bar viser sammenligning mellom pasient scenen D og scene D + Manumycin behandlingsprøver.
IFN-γ
For å undersøke effekten av K-ras mutasjon på IFN-γ under progresjon stadier av kolorektal kreft, ble det ekspresjonsnivået av IFN-γ bestemt. Som vist (figur 4B, 2A-B, fig S1), er IFN-γ nedregulert i colon cancer pasienter sammenlignet med friske kontroller. I tillegg er det en signifikant reduksjon i IFN-y-protein og mRNA-nivåer mellom K-ras negative og K-ras positive individer (P 0,001), for derved å peke på virkningen av K-ras-signalisering på IFN-y-nedreguler . Videre behandling med Manumycin A forårsaket en økning i IFN-γ ekspresjonsnivåer, som vist ved Western Blot og RT-PCR eksperimenter (P 0,001 for proteinnivåer, P 0,01 for mRNA-nivåer) (Figur 3A-B). Resultatene tyder på en K-ras tilbakemeldinger signalering mekanisme på IFN-γ, som spiller en viktig rolle i kolon kreftutvikling.
Manumycin en undertrykkelse av levedyktighet og cellevekst av Caco-2 celler
de observerte resultatene viser for første gang at ras inhibitor Manumycin A reduserer celleviabilitet i Caco-2 tykktarmskreftceller. Effekten av denne spesifikke formen av inhibitoren på levedyktigheten til tykktarmskreftceller ble undersøkt etter inkubering i et medium inneholdende Manumycin A med konsentrasjoner i området 10-300 uM i 24 timer. Celler inkubert i mediet i fravær av Manumycin A tjente som kontroller. Anvendelse av MTT-analysen viste at inhibering av cellelevedyktighet i alle Caco-2 kolon adenokarsinom-cancercellene testet forekom på en doseavhengig måte (figur 5A-B). I detalj, redusert cellelevedyktighet vesentlig fra 90% (ved 10 μΜ) til 40% (ved 300 μΜ) (P 0,001), sammenlignet med kontrollen. De observerte mønstrene av hemming som funksjon av Manumycin En konsentrasjon avsløre antitumor-egenskapene til ras-inhibitorer i K-ras-induserte kolonkreft-signalering.
(A) MTT-analyse som viser virkningen av Manumycin A på kreftcellelevedyktighet i Caco-2 celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Manumycin A i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble målt med en ELISA-plateleser ved 570 nm. Bilde forstørrelse × 200. (B) Resultatene indikerer at Manumycin A hemmer levedyktigheten av human tykktarm adenokarsinomceller Caco-2-celler på en doseavhengig måte. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Manumycin En induserer apoptose i (C) Caco-2 menneskelige kolon adenokarsinom kreftceller. Caco-2 celle apoptose ble oppdaget ved hjelp tunel påvisningsmetode fra Roche. Manumycin A konsentrasjoner: 10, 50, 100, 200, og 300 μΜ. Kreftcellelinjen ble utsatt for Manumycin A ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer og flekker. Røde apoptotiske celler ble sett ved hjelp av en Carl Zeiss (Zeiss Europa) fluorescerende mikroskop. Bilde forstørrelse × 200. (D) Grafene representerer de kvantitative resultatene av apoptose.
