Abstract
Om lag 50% av pasienter med primær kolorektal kreft utvikler levermetastaser. Forstå de genetiske forskjeller mellom primær kolonkreft og deres metastaser i leveren er avgjørende for å utforme en bedre terapeutisk tilnærming for denne sykdommen. Vi utførte hele exome sekvensering og kopinummeranalyse for 15 tripletter, hver omfattende normal tykktarms vev, primær kolorektal karsinom, og dens synkrone matchet levermetastaser. Vi har analysert likheter og forskjeller mellom primære kolorektal kreft og matchet levermetastaser i forhold til somatiske mutasjoner og somatisk kopiantall alterationss. Den genomisk profilering demonstrert mutasjoner i APC (73%), KRAS (33%), ARID1A og PIK3CA (6,7%) gener mellom primære kolorektal og metastatisk leversvulster.
TP53
mutasjon ble observert hos 47% av de primære prøver og 67% i levermetastatisk prøver. De grupperte parene, i hierarkisk clustering viste lignende somatiske eksemplar nummer endring mønstre, i motsetning til de ugrupperte parene. Mange mutasjoner (inkludert de av kjente nøkkel kreft driver gener) ble delt i de grupperte par. De ugrupperte parene utstilt forskjellige mutasjonsmønstre med ingen delte mutasjoner i viktige driver gener. Fire ugrupperte levermetastaser prøver hadde mutasjoner i DNA mismatch-reparasjonsgener sammen med hypermutations og et betydelig antall eksemplar nummer endringer. Våre resultater tyder på at om lag halvparten av metastatisk kolorektal karsinom hadde samme klonal opprinnelse med sine primære kolorektal karsinom, mens resterende tilfellene var genetisk forskjellig fra deres primære karsinomer. Disse funnene understreker behovet for å evaluere metastaselesjoner separat for optimal behandling, heller enn å ekstrapolere fra primærsvulstene
Citation. Lee SY, Haq F, Kim D, juni C, Jo HJ, Ahn SM, et al. (2014) komparativ genomisk analyse av primære og Synkron metastatisk kolorektal kreft. PLoS ONE 9 (3): e90459. doi: 10,1371 /journal.pone.0090459
Redaktør: Harriet Wikman, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 30 september 2013; Godkjent: 30 januar 2014; Publisert: 05.03.2014
Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT Future Planning (No. 2012R1A1A1013369). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den nye konseptet polyclonality er stadig viktigere i kreft biologi [1]. Det monoklonale utviklingen av en svulst fra en enkelt kreftcelle er blitt grundig undersøkt, og er generelt ansett å omfatte den selektive klonal ekspansjon av tumor dominerende kloner. Mer nylig har den alternative konseptet med polyklonalt evolusjon dukket opp. Denne modellen består av to nøkkelbegreper: selv seeding hypotese og mutator fenotype modell. Den tidligere foreslår at kreft kloner forlate primære stedet, skriv systemiske sirkulasjonen via tumor blodkar, og kolonisere et fjernt sted, og dermed etablere en ny undergruppe [2], [3]. Den mutator fenotype modellen foreslår et lite antall svært ulike tumorcellekloner (polyklonale) i stedet for noen konkurrerende klonale subpopulasjoner; faktisk flere solide tumortyper, inkludert tykktarm kreft, har vært foreslått å være svært polyklonale [4].
Identifisere opprinnelsen til kreft er sentral i forståelsen av genetiske hendelser som er involvert i startfasen og progresjon [5] . Som med primær cancer, metastaser kan også ha enten en enkelt eller polyklonal opprinnelse [6], [7]. Vanligvis metastaser bære lignende mutasjoner til de av de primære kreft hvorfra de stammer, men ytterligere mutasjoner forekommer etter transformasjon [6], [8]. Den stadige, og ofte akselererende forekomst av mutasjoner fører til genetisk heterogenitet mellom primære og metastatisk kreft; dette for det meste øker motstanden mot terapi i den sistnevnte, som er den dominerende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [6], [9].
kolorektalt karsinom (CRC) er den tredje vanligste malignitet og den annen ledende årsak til kreft dødsfall i mange land [10], [11]. Nesten 50% av CRC pasienter utvikle kolorektal levermetastaser (CLM) [12]. Uten behandling pasienter med CI MS ha en median overlevelse på bare 5-10 måneder, med mindre enn 0,5% overlevende utover 5 år [13]. Flere studier har adressert klonal opprinnelse og genetisk heterogenitet av CRC [14], [15]. Ingen klar konsensus har dukket opp fra dette som, selv om en rapport konkluderte med at svulster i hovedsak stammer fra en enkelt klon [15], resultatene fra andre studier antydet at flertallet av svulster har en polyklonal opprinnelse [16], [17]. Nylig har hele genomsekvensering av matchet primære og metastatisk acral melanom også avdekket betydelig genetisk heterogenitet mellom primær- og metastatiske svulster, som dokumentert av
de novo
, ikke-synonyme enkelt nukleotid variasjon [18]. Bukspyttkjertelkreft metastaser har også blitt sekvensert for å evaluere de klonale forholdet mellom primære og metastatisk kreft, som fører til identifisering av klonal populasjoner som ga opphav til fjernmetastaser [19], [20]. Det er derfor viktig å forstå ulike begreper knyttet til opprinnelsen til kreft og genetiske heterogenitet mellom en primær tumor og dens fjernmetastaser for å utvikle effektive terapeutiske strategier [21], [22].
For å kunne vurdere polyclonality og genetisk heterogenitet i CRC, vurderte vi det genetiske og klonal forholdet mellom primær CRC og deres matchet CI MS ved å utføre målrettede exome sekvensering og høy oppløsning kopi antall variant (SCNA) analyse av 15 trillinger av normal kolorektal vev, primært CRC, og matchet CLM prøver. Våre resultater gir verdifull innsikt i den klonale forhold og genetiske forskjeller mellom primær CRC og deres matchet CI MS, og vil dermed bidra til å definere potensielle mål for systemisk behandling.
Resultater
Pasient kohort beskrivelse
median alder for pasientene i studien var 61 (tabell 1). Kohorten inkluderte en T2 stadium, 10 T3 scenen, og 4 T4 CRC svulster, som alle er primære reseksjon prøver. Seks pasienter hadde enkelt levermetastaser, mens 9 pasienter hadde to eller flere levermetastaser ved reseksjon. Klinisk og histo-patologiske informasjon for kohorten settet som brukes i studien er gitt i tabell 1.
SCNA analyse
Vi utførte SCNA analyse på 15 trillinger av normal kolorektal vev, CRC og CLM prøver. Ved hjelp av paret analyse (dvs. normal kolorektal vev vs. CRC eller normal kolorektal vev vs. CLM) identifiserte vi somatiske SCNAs i enten CRC eller CLM prøver (Tabell 2 og Figur S1). CRC og CLM pairer fra 11 pasienter viste et tilsvarende antall SCNAs (tabell 2); Men de resterende 4-par (# 250, # 262, # 526 og # 721) viste en betydelig økning i det totale antall av SCNAs i CLM prøver, spesielt de som involverer homozygot kopi tap og tap av heterozygositet (LOH) (tabell 2).
Vi utførte unsupervised hierarkisk clustering av de somatiske SCNA data fra 15 par av CRC og CLM prøver for å vurdere genetisk mangfold mellom primær- og metastatisk CRC. Unsupervised hierarkisk clustering av SCNA data har blitt brukt tidligere for å bestemme de genetiske forholdet mellom primære og metastatisk kreft [23]. Denne analysen var basert på en forutsetning om at genetisk like CRC og deres matchet CI MS vil være nært beslektet i hierarkisk clustering. Femti-tre prosent (8 av 15) av de primære CRC var nær knyttet til deres matchede CI MS, noe som indikerer klonal og genetisk likhet i disse CRC-CLM-par. De resterende 47% (7 av 15) av CRC-CLM parene var bare fjernt beslektet, noe som tyder på forskjellige genetiske sammenhenger mellom disse CRC og deres matchet CI MS (figur 1).
I 8 CRC-CLM-par (53 %), blir hvert par nærmest beslektet i det hierarkiske treet (rød); i 7 CRC-CLM par (47%), blir hvert par fjernt beslektet, noe som indikerer at primær CRC og deres matchet CI MS har forskjellige genetiske egenskaper (blå). De somatiske mutasjoner i kreftrelaterte gener er også nevnt.
Av notatet. SCNA mønstre av 8 nært beslektede parene var de samme, mens de av de 7 fjernt beslektede CRC-CLM-par var tydelig (figur S2). Vi har også beregnet og sammenlignet den gjennomsnittlige antallet en kopi gevinster, en kopi tap, høye kopi gevinster, homozygot tap og LOH mellom gruppert og ugrupperte CRC-CLM-par (Figur S3). Grundig sammenligning av hierarkisk clustering og genetiske likheter er beskrevet i den neste delen av resultatene.
Exome sekvense
Vi fullført hele exome sekvensering på 15 trillinger av normal kolorektal vev, CRC, og CLM prøver . Ved hjelp av en PCR-basert mikroanalyse, fikk vi bekreftet at alle 15 primær CRC-prøvene var mikro-stabil. Mutasjoner ble funnet og filtreres i henhold til våre interne bioinformatikk arbeidsflyt (figur S4). I alt ble 1079 og 4366 mutasjoner identifisert i CRC og CLM prøver, henholdsvis (Tabell S1). Mutasjonen spektra observert i CRC og CLM prøvene var i samsvar med tidligere observasjoner i solide svulster og var ikke signifikant forskjellig mellom CRC og CLM prøver (figur S5) [24].
hyper og SCNA
Fire CLM prøver (# 250, # 262, # 525 og # 721) ble hypermutated (tabell S2). For å identifisere årsaken til hyper, vi evaluert mutasjoner i DNA polymerase gener (POLN, POLL, POLQ, POLH, pol, POLD1 og Polg) og DNA mismatch repair pathway gener, inkludert
MLH1
,
MLH3
,
MSH2
,
MSH6
,
PMS2
,
PMS6
,
ERCC2
,
ERCC5
,
ERCC6
,
MUTYH
,
RAD9A
,
EXO1
,
SLX4
,
ATR
og
BLM
. Resultatene viste at bare de fire hypermutated CLM prøver (# 250, # 262, # 526 og # 721) har hatt en eller flere av missense mutasjoner i DNA-polymerase gener og DNA-mismatch-reparasjonsgener (Tabell S3). Disse fire hypermutated prøvene viste også en høy grad av SCNAs forhold til sine matchet primære CRC (tabell 2), og det var spesielt bemerkelsesverdig at hyper var signifikant assosiert med en høy frekvens av LOH (
P
= 2,782 × 10
-9) (figur 2).
Prøver med hyper inneholder også høy LOH frekvens (P-verdi = 2.782e-09).
Somatiske mutasjon profiler og betydelig endrede trasé
Vi fant at 2,224 gener hadde minst en ikke-synonyme, spleising, eller rammeskifte mutasjon i CRC eller CI MS (tabell S5). Disse data ble så brukt til å undersøke den mutasjonsstatus av de store signalveier endret i CRC (dvs. de som er sentrert på P53, Wnt, TGF-beta, og VEGF), ved å sammenligne frekvensene som gener som er involvert i disse banene ble muterte (figur 3). Dette viste at
APC
ble mutert i 73% av både CRC og CLM prøver,
TP53
i 47% av CRC prøver og 67% av CLM prøver, og
KRAS
i 33% av både CRC og CLM prøver.
SMAD4
,
FAT4
, og
BRAF
ble også mutert i CRC og CLM prøver med varierende frekvenser. I VEGF signalveien, har vi funnet mutasjoner i
KDR product: (0% og 27%),
FLT1 plakater (7% og 7%), og
FLT4 product: ( 0% og 7%) gener fra CRC og CI MS, henholdsvis (figur 3). Mutasjoner i VEGF pathway gener ble i hovedsak begrenset til CLM prøver, det mest slående eksempel på noe som blir
KDR
gen som bare ble mutert i hypermutated CLM prøvene (tabell 3).
vurderer genetiske relasjoner på grunnlag av mutasjoner og SCNA
for å evaluere genetiske relasjoner mellom de 15 parene av CRC og CLM prøver, evaluert vi om de samme genotypiske endringer og mutasjoner i store kreft driver gener oppsto i hvert par. Denne evalueringen ble basert på en forutsetning om at CRC og CLM par med lignende genetiske endringer er sannsynlig å dele mutasjoner i de store driver gener. I åtte tilfeller, CRC-CLM paret gjorde faktisk dele mutasjoner i viktige CRC-relaterte gener (
APC
,
KRAS
,
TP53
,
SMAD4
,
BRAF
, og
FAT4
) (tabell S4). I disse parene ble det ikke observert noen signifikant forskjell i antall mutasjoner mellom CRC og CLM prøver (
P
= 0,28) (tabell 4). Omvendt, i de resterende syv tilfeller ingen av CRC-CLM parene delte en mutasjon i viktige CRC-relaterte gener; Men det totale antall mutasjoner signifikant forskjellig mellom CRC og CLM prøver (
P
0,05) (Tabell 4 og Tabell S4)
Viktigere, konkordans analyse av. mutasjon data forsonet med SCNA dataanalyse. Alle CRC-CLM par, som var nært knyttet i unsupervised hierarkisk clustering av SCNA data, delte mutasjoner i viktige CRC-relaterte gener (53%). Men de syv CRC-CLM parene som var bare eksternt relatert i den hierarkiske clustering av SCNA data, ikke dele en mutasjon i viktige CRC-relaterte gener (47%).
Til sammen tyder disse funnene at i 53% av tilfellene, hver CRC-CLM paret hadde lignende genetiske forandringer, mens de i de resterende 47% av tilfellene hadde forskjellige genetiske endringer.
Diskusjoner
Ved å sammenligne SCNA data og mutasjons profiler av 15 paret CRC og CLM prøver, fant vi at om lag halvparten av dem, viste genetisk heterogenitet med hensyn til deres tilsvarende primær CRC. Så langt vi kjenner til, er dette den første omfattende studien å bruke genomisk profilering av primær CRC og deres matchet metastaser og å definere distinkte trekk ved metastatiske lesjoner i form av deres mutasjon og SCNA profiler.
Femti -Tre prosent av CRC-CLM par i klynger gruppen delte et høyt antall mutasjoner, inkludert noen i
APC
,
KRAS
,
TP53
, og
SMAD4
gener (Tabell 4, Figur 1). Nærværet av mange delte mutasjoner (30-65%) indikerte at somatiske mutasjoner kan akkumuleres inne i mikromiljøet av en primær cancer før formidling til deres metastaser, noe som ofte referert til som den lineære modellen progresjon av tumorutvikling [22]. De resterende 47% av CRC-CLM-par, som var gruppert uavhengig av hverandre, viste signifikante forskjeller i deres mutasjon profiler og SCNA data. De hadde ingen felles mutasjoner i kreft initiering gener og ingen signifikante forskjeller i SCNA profiler (figur 1). Den distinkte forhold og fremtredende genetisk heterogenitet i disse parene indikerer at CI MS kan ha sin opprinnelse fra en gruppe av genetisk distinkte primære CRC kloner samspill i umiddelbar nærhet med polyklonale modell for tumorprogresjon.
Seks CRC-CLM parene hadde somatisk KRAS mutasjoner i minst en prøve. Tre par hadde de samme KRAS-mutasjoner, og de tre andre ikke. Derfor er uoverensstemmelse frekvensen av KRAS mutasjon mellom CRC-CLM parene var 50% (3/6) (figur 1 og tabell S4). Knijn og kolleger [25] rapporterte høy samstemmighet av KRAS-mutasjoner mellom primær- CRC og CLM svulster. Derimot har en rekke studier vist høy disharmoni rente, mellom CRC-CLM par av KRAS-mutasjoner som varierer fra 8% -60% [26] – [28]. I vår studie, ble de tre CRC-CLM par med uharmoniske KRAS mutasjonsstatus også gruppert utpreget ved SCNA analyse. Den disharmoni av KRAS mutasjon, sammen med distinkte SCNA clustering mønstre, mellom disse CRC-CLM parene støtter vår hypotese om at primær CRC og tilhørende CI MS kan ha ulike klonal opprinnelse i disse prøvene.
polyklonale tumorprogresjon modell kan hjelp direkte~~POS=TRUNC terapeutiske strategier [4]. Den store ulempen med et monoklonalt svulst opprinnelse modellen er antagelsen om at de fleste av de første hendelsene som førte til den primære kreft vil også bli funnet i metastasized celler, som har utsikt over muligheten for at små populasjoner av kreftceller med forskjellige genetiske egenskaper i umiddelbar nærhet til hverandre, kan være ansvarlig for den metastase [4]. Slike metastatiske celler som stammer fra primære svulster, kan ha en annen respons på behandling.
hyper forårsaket av tap av DNA mismatch reparasjon aktivitet betegnes MSI [29]. Vi fant at fire CLM prøvene var ustabil mikro, noe som resulterer i hypermutations.
KDR
genet, en betydelig prognostisk markør i kolorektal kreft [30], ble mutert bare i hypermutated prøvene. Det er også verdt å merke seg at det var en tydelig sammenheng mellom hyper og kromosom ustabilitet. Nylig har en distinkt kopiantall status av DNA misparringssystemet
MLH1
ble vist å være assosiert med forhøyede nivåer av mutasjoner i kreft i bukspyttkjertelen [31]. Tidligere studier viste motsier bevisene om MSI svulster og kromosom ustabilitet i kolorektal kreft. Noen studier har rapportert at MSS svulster viser høyere forekomst av kromosom ustabilitet enn MSI svulster [32] – [35]. Andre studier viser betydelig overlapping mellom MSI svulster og kromosom ustabilitet [32], [35] – [38]. Av notatet, ble alle disse studiene gjort ved hjelp av primær CRC prøver, og forholdet mellom MSI og kromosom ustabilitet i CLM prøvene er ennå ikke avslørt. Vi fant at MSI tumorer var assosiert med et stort antall gener delesjoner /amplifikasjoner og økt frekvens av LOH, med andre ord, kromosomal ustabilitet i CLM tumorer. Videre forskning er nødvendig for å avdekke forholdet mellom MSI, kromosom ustabilitet og metastasering av primær CRC.
Angiogenese er regulert i hovedsak av interaksjoner mellom vaskulær endotelial vekstfaktorer og VEGF reseptorer og spiller en sentral rolle i kreft vekst og metastase [ ,,,0],39], [40]. Flere studier har rapportert den genetisk polymorfisme av KDR-genet impliserte risikoen for koronare arteriesykdommer [41], [42]. Men den klare rollen som individuell KDR SNPs og deres fysiologiske funksjoner i kreft progresjon og prognosen er fortsatt ukjent. I denne studien, alle pasientene med KDR SNPs (dvs. rs187037 og rs2305948) hadde tilbakefall etter kurativ reseksjon av CRC og leveren (p = 0,925; data ikke vist). Men på grunn av liten prøve KDR-mutasjonen var ikke statistisk signifikant. Et større antall prøver for å validere KDR mutasjon og sin karakteristiske rolle i tumorresidiv.
bety overlevelse av pasienter med metastatisk CRC har økt fra 6-8 måneder til mer enn 2 år på grunn av Fremveksten veksten~~POS=HEADCOMP av målrettet behandling og forbedrede kirurgiske reseksjoner. Likevel, til terapeutisk alternativ for ikke-respondere oksaliplatin eller irinotecan-basert kjemoterapi, med eller uten cetuximab eller bevacizumab, er svært begrenset. Derfor bedre behandlingsstrategier for metastatisk CRC må utvikles. En voksende mengde bevis tyder på at primær CRC kan manifesteres som polyklonale av natur og at de resulterende metastaser kan derfor ha en genetisk forskjellig fra flertallet av den primære tumor. I slike tilfeller kan biologi og genetiske profil av primærtumor være vesentlig forskjellig fra metastaser. Dette vil være et viktig anliggende i målrettet, personlig terapi. Våre resultater tyder på at mutasjons profilene til omtrent 50% av metastatisk leversvulster kan være forskjellig fra den i den primære tumor, noe som understreker behovet for å evaluere metastaser separat for identifisering av potensielle mål for systemisk terapi.
Materials og metoder
Study befolkningen
Mellom juni 2009 og juni 2011, 53 pasienter gjennomgikk kurativ reseksjon av CRC og levermetastaser ved Gachon Universitets Gil Hospital (Incheon, Sør-Korea). Kriteriene for inkludering i denne undersøkelsen var som følger: (1) nedsatt levermetastaser fra CRC bekreftet av spiral abdominopelvic computertomografi; (2) levermetastaser som den første manifestasjon av sykdommen M1 uten dokumentert disseminert sykdom, bestemt ved preoperativ avbildning; (3) ingen tidligere historie med neoadjuvant chemoradiation eller kjemoterapi, inkludert molekylær målrettede midler; (4) kurativ reseksjon utført for både primære kolorektal og leverlesjoner; (5) de resected prøver skal være synkrone svulster (samtidig reseksjon,
n
= 11, to-trinns reseksjon innen 6 måneder,
n
= 4); og (6) mikro stabile primære CRC. Vi valgte 15 pasienter med CRC og matchet levermetastaser basert på følgende inklusjonskriterier. De grunnleggende karakteristika hos de pasientene er vist i tabell 1. Alle tumorer ble vurdert av en enkelt patolog, og bare eksemplarer med ved 70% tumor-innhold ble inkludert i analysen. Studien protokoller ble godkjent av Institutional Review Board of Gachon Universitets Gil Hospital (IRB godkjenningsnummer: GIRBA 2535). Skriftlig informert samtykke var nødvendig fra alle deltakerne. Informasjon, som kjønn, alder, tumorstadium, ble hentet fra den kliniske database for dette kullet.
PCR-basert mikro analysen
Et sett med mikro markører som består av to mononukleotid gjenta markører ( BAT25 og BAT26) og tre dinucleotide gjenta markører (D2S123, D5S346, og D17S250), som anbefalt av National Cancer Institute Consensus Group, ble benyttet for å bestemme svulst på mikro ustabilitet (MSI) status. Aliquoter som inneholdt 50 ng DNA ble amplifisert i 20 ul reaksjonsblandinger inneholdende 2 ul av 10 x buffer (Roche, Mannheim, Tyskland), 1.7 til 2.5 mmol /l MgCl
2, 0.3 M av hver primer par, 250 uM deoksynukleotidtrifosfater , og 2,5 U DNA-polymerase (Roche, Mannheim, Tyskland). PCR ble utført med en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med 1 minutt ved 94 ° C, 1 minutt ved 55 ° C, og 1 min ved 72 ° C, og en avsluttende forlengelsestrinn på 10 min ved 72 ° C. Prøvene ble analysert på en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer bruker 0,7 mL av forsterket prøve kombinert med 0,3 mL av Genescan 500 Størrelse Standard og 9 mL av hidi Formamide henhold til produsentens retningslinjer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data ble analysert ved hjelp av ABI Prism 3100 datainnsamling programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
DNA-ekstraksjon, bibliotek forberedelse og målrettet exome sekvense
DNA ble ekstrahert ved hjelp av en DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). DNA-kvalitet ble undersøkt ved 1% agarosegelelektroforese, og DNA-konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av en PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). AtVelg sekvense bibliotekene ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner (Agilent atVelg All Exon Kit 38 Mb, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ved hjelp av en Bravo automatisert væskebehandler. Kvaliteten på de forsterkede bibliotekene ble verifisert ved kapillær elektroforese (Bioanalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), hvoretter paret avanserte DNA-sekvenser ble oppnådd fra bibliotekene ved hjelp av Illumina HiSeq plattform (Illumina, San Diego, CA, USA).
Bioinformatikk analyse
Sekvensdata data~~POS=HEADCOMP ble justert til den menneskelige referansen genom GRCh37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human /index.shtml) ved hjelp av Burrows-Wheeler Aligner [43] med standard parametere. Vi sekvensert ved gjennomsnittlig dybde på 52.44X for målrettede regioner. PCR duplikater ble fjernet ved hjelp av Picard algoritmen (https://picard.sourceforge.net). Vi utførte omstilling og kvalitet rekalibrering for sekvensdata ved hjelp av Genome Analysis Toolkit (GATK) [44]. Etter justering, brukte vi Varscan [45], Strelka [46], og Mutect [47] for å ringe mutasjoner, inkludert innsettinger og slettinger (indels), for hver kromosom posisjon og også brukt GATK [44] for Indel deteksjon med 15 triplet prøver bestående av normal kolorektal vev, primært CRC, og matchet CI MS. Vi kommenterte mutasjonene som bruker ANNOVAR [48] med Ensembl Gene merknaden database for menneskelige genom bygge 37 (https://www.ensembl.org/) og søkte etter kamper i dbSNP137 (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/index.shtml), 1000 genom data [49], og COSMIC database [50]. Vi filtrert mutasjonene fra målrettede regioner og utvalgte ikke-synonyme, synonymt, gevinst eller tap av stoppkodon, rammeskifte indels, ikke-rammeskifte indels og skjøting sete-mutasjoner.
SCNA analyse
Den enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) rekke CytoScan ™ HD (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) ble brukt. SCNA analyse av CytoScan ™ HD Array ble utført ved hjelp BioDiscovery Nexus Kopier nummer 6.1 (https://www.biodiscovery.com/software/nexus-copy-number/) programvare. SNP-Fast Adaptive States Segmentering Teknikk 2 segmentering algoritme ble brukt sammen med standard parametere.
Clustering
Komplett kobling hierarkisk clustering ble utført for å evaluere samsvar mellom de primære CRC og CLM prøver. Gjennomsnittlig og enkel kobling hierarkisk clustering ble også brukt; Men alle clustering metoder ga lignende resultater. Sammenkoblet
t
-test og to-utvalg
t
-test ble brukt for statistiske analyser, og
P
. 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans
data Link
Hele exome sekvense data: Sequence Hent Archive (SRA) tiltredelse tallet er SRP034161
Cytoscan rekke data:.. GEO sjonsnummer er GSE53799
Hjelpemiddel informasjon
Figur S1.
Arbeidsflyt for kopiantall variasjon (CNV) analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
SCNA mønstre av CRC-CLM par. Gevinst er representert i blå, tap i rødt og LOH i brunt. 8/15 CRC-CLM gruppert par viste høy likhet i SCNA mønstre i forhold til resten av 7/15 CRC-CLM ugrupperte par
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Gjennomsnittlig SCNA frekvenser av gruppert og ugrupperte CRC-CLM par. (A) Høy kopierings gevinster, homozygot tap og LOH er svært variabel i ugrupperte CRC-CLM par. Høye kopi gevinster i gruppert CRC-CLM viste også variasjon. (B) En kopi tap i ugrupperte CRC-CLM parene viste variasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Arbeidsflyt for hele exome sekvensering analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Mutasjon spektra av CRC og CI MS. (A) Mutasjon spektrum av CRC og deres matchede CI MS unntatt hypermutated prøver. (B) Mutasjon spekteret av fire hypermutated CLM prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s005 plakater (TIF)
Tabell S1. .
Antall somatiske mutasjoner i CRC og CI MS
doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s006 plakater (docx)
Tabell S2. .
Totalt antall mutasjoner i hvert CRC-CLM par
doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s007 plakater (docx)
tabell S3.
mutasjonsstatus av DNA mismatch reparasjon pathway gener og DNA polymerase gener i CRC og CI MS
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s008 plakater (docx)
Tabell S4.
mutasjons samsvar mellom CRC og CLM par. Alle nærstående CRC-CLM par i hierarkiske clustering delte mutasjoner i viktige CRC-relaterte gener
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s009 plakater (docx)
Tabell S5.
Mutasjoner og muterte gener i CRC og CI MS (tabellen er gitt som excel-filer)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s010 plakater (XLSX)
