Abstract
Svak celleoverflate adhesjon av cellelinjer til vev kulturoverflater er et vanlig problem, og presenterer de tekniske begrensningene til utforming av eksperimenter. For å overvinne dette problem er forskjellige overflatebeleggprotokoller blitt utviklet. Imidlertid har et komparativt og nøyaktig måling i sanntid av deres innvirkning på celle atferd ikke utført. Prostatakreft-cellelinjen LNCaP, avledet fra en pasient lymfeknutemetastase, er en vanlig brukt i modellsystem prostatakreft forskning. Imidlertid har cellenes karakteristisk svak tilknytning til overflaten av vevkulturbeholdere og dekkglass hindret deres manipulasjon og analyser og bruk i high throughput screening. For å forbedre vedheftningen av LNCaP-celler til kulturoverflaten, sammenlignet vi forskjellige belegg reagenser (poly-l-lysin, poly-L-ornitin, kollagen type IV, fibronektin og laminin) og dyrking av betingelser og analysert deres virkning på celleformering, vedheft, morfologi, mobilitet og genuttrykk ved bruk av real-time teknologi. Resultatene viste at fibronektin, poly-L-lysin og poly-L-ornitin forbedret LNCaP-celler tilslutning og provosert cellemorfologi endringer, slik som økning av kjernefysisk og cellulære område. Disse overtrekks reagenser også induserte en høyere ekspresjon av F-aktin og redusert bevegelighet celle. I kontrast, gjorde laminin og kollagen type IV ikke bedre etterlevelse men fremmet celle aggregering og berørte celle morfologi. Celler dyrket i nærvær av laminin som vises høyere mobilitet enn kontrollceller. Alle belegg betingelser i vesentlig grad påvirket cellelevedyktighet; Men de gjorde ikke påvirke uttrykket av androgen reseptor-regulert gener. Våre komparative funnene gir viktig innsikt for valg av de ideelle belegg reagensstasjonene og dyrkningsforhold for kreftcellelinjer med hensyn til deres effekt på spredning rate, vedlegg, morfologi, migrasjon, transkripsjonen respons og cellulær cytoskjelettet arrangement.
Citation: Liberio MS, Sadowski MC, Soekmadji C, Davis RA, Nelson CC (2014) Differensial Effekter av vev kultur Coating Underlag om Prostate Cancer Cell Etterlevelse, morfologi og atferd. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10,1371 /journal.pone.0112122
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 6 august 2014; Godkjent: 12 oktober 2014; Publisert: 06.11.2014
Copyright: © 2014 Liberio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Midler til studien ble gitt av Eskitis Institute Griffith University og den australske Prostate Cancer Research Centre-Queensland gjennom midler fra den australske regjeringen Department of Health . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i flercellet organisme vev det ekstracellulære rommet som omgir cellene er fylt med en kompleks blanding av makromolekyler referert til som den ekstracellulære matriks (ECM). ECM er sammensatt av polysakkarider og proteiner, slik som laminin, fibronektin, elastin, kollagen, og deres relative mengder er vevsspesifikk. Disse proteiner er innleiret i en polysakkaridgel. [1] Til tross for de første tanker til å tjene kun som et stillas for celler, er det nå kjent at ECM er ikke bare strukturelt, men rikt, å være ansvarlig for å regulere cellulære oppførselen og påvirke deres proliferasjon, form, funksjon, migrasjon, overlevelse og utvikling [2] -. [5]
Mange av ECM proteiner har viktig tilslutning funksjon. [1] De fleste cellene er forankringsavhengige og trenger å feste til ECM for å overleve og formere seg. [6] Integriner er transmembrane proteiner i form av αβ heterodimerer integrert for ECM-protein-cellefesting. Dette samspillet genererer en kaskade av intracellulære signaler som også kan kontrollere differensial genuttrykk. [7], [8] Den signalrespons er relatert til ECM molekylære sammensetning som endrer seg i henhold til den celleresponsen til deres mikromiljø. [9], [10] På denne måten er ECM i konstant forandring for å lette celle kravene i utviklings plastisitet. [11] Ikke desto mindre, er lite kjent om de molekylære detaljer som er involvert i signaltransduksjon. Den celleresponsen til de ECM-komponenter er variabel og avhengig av hvilke integrin subenheter er uttrykt av cellene. Mange forskningsgrupper har brukt ulike ECM proteiner i vev kultur for å endre celle atferd, primært celle vedlegg. [12] – [15] Imidlertid, i tillegg til å øke feste, belegg proteinene kan påvirke andre aspekter av cellebiologi, som påvirker de endelige resultatene av analysen [16]
androgen-følsomme human prostata adenokarsinom. cellelinje, LNCaP, er en av de mest vanlig anvendte modellsystemer i prostatakreft (PCA) forskning. Det ble avledet fra et metastatisk lesjon i lymfeknuten til en 50 år gammel kaukasisk mann i 1977. [17] Svak celleoverflate adhesjon av cellelinjer er et vanlig problem med vevskultur forskning og presenterer tekniske begrensninger på utformingen av eksperimenter . Deres karakteristisk svak tilknytning til overflaten av vevkulturbeholdere og dekkglass har hindret deres manipulasjon, analyse og bruk i high throughput screening siden LNCaP-celler kan lett forskyves gjennom beskjedne mekaniske krefter som fluidskjærspenning. For å forbedre vedheftningen av LNCaP-celler til kulturoverflaten, sammenlignet vi forskjellige belegg reagenser (poly-l-lysin, poly-L-ornitin, kollagen IV, fibronektin og laminin) og dyrking betingelser, f.eks celletetthet, og analyserte deres virkning på celleformering, adhesjon, mobilitet og morfologi med en sanntids celle analysator (RTCA). Våre funn er et nyttig verktøy for valg av de ideelle belegg reagensstasjonene og dyrkningsforhold for LNCaP cellelinje med hensyn til deres effekt på spredning rate, vedlegg, morfologi og cellulær cytoskjelettet arrangement.
Materialer og metoder
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
LNCaP-celler (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) ble rutinemessig dyrket i RPMI vekstmedium uten fenolrødt (Invitrogen) supplert med 10% (v /v) FBS (Invitrogen) . LNCaP celler ble spredd for ikke mer enn 40 passeringer.
Coating forhold
Alle belegg reagenser ble utarbeidet som anbefalt av produsentene. Volumet og konsentrasjonen av de stoffer som brukes for å belegge brønnene ble 1,3 mL laminin (LAM, 0,5 mg /ml i H
2o, Invitrogen), 1 pl kollagen fra human placenta type IV (COL, 1 mg /ml i H
2o, Invitrogen), 0,4 mL fibronektin (FN, 1 mg /ml i H
2o, Invitrogen), og 0,32 mL poly-L-lysin (PLL, 1 mg /ml i H
2o, Invitrogen). Disse belegg reagenser ble blandet med H
2o til et totalvolum på 50 ul per brønn av en 96-brønns plate. 50 ul poly-L-ornitin (PLO, 0,01% i H
2o, Sigma-Aldrich) ble direkte tilsatt til brønnene, og platene ble inkubert over natten ved 37 ° C i 5% CO
2. Inkubasjonstiden for LAM og FN var 4 timer ved bruk av de samme betingelser som beskrevet ovenfor. De belagte brønner ble vasket en gang med DPBS, etterfulgt umiddelbart av celle poding. Volumet av belegg stoffer ble justert i henhold til vekstområde når ulike kultur fartøyene ble brukt.
Sanntids celle analysator (xCELLigence System)
sanntid celle analysator (RTCA) xCELLigence system ( Roche Applied Science) består av fire hoveddeler: RTCA analysator, RTCA SP stasjonen, som holder seg inne i en vev-kultur inkubator, det RTCA datamaskin med integrert programvare, og en 96-brønns E-plate. Bunnen av engangs 96-brønners E-plate er ca. 80% dekket med gull mikroelektroder som overvåker den elektroniske impedans, detektering av fysiologiske forandringer i cellene. Celler i kontakt med elektroden vil virke som isolatorer, som fører til en økning i impedans. Dermed elektrode impedansforandringene proporsjonalt med endringer i antall, størrelse og etterlevelse av celler som vokser i en mono [18], [19].
Endringer i impedans er oversatt som dimensjonsløs sikt
celle hovedside
(CI). CI = (Zi-Z0) /15, hvor Zi er impedansen ved en enkelt tidspunkt i løpet av eksperimentet og Z0 er impedansen ved starten av forsøket. Således er CI en kvantitativ og sammensatt mål av den generelle tilstand av cellene i en elektrode inneholdende vel [18], [19].
Først, 100 ul av fullstendig medium ble tilsatt til hver brønn for måling av bakgrunnen. Deretter ble LNCaP-celler sådd ut i en 96-brønns E-plate ubelagt eller belagt med de angitte reagenser som beskrevet ovenfor, ved en tetthet mellom 9,4 x 10
3 og 6,25 x 10
4 celler /cm
2 i tre eksemplarer. E-platen ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter og plassert på leseren i inkubatoren for kontinuerlig opptak av celle index. E-platen ble inkubert i 96 timer ved 37 ° C i 5% CO
2, og festing av cellene ble overvåket via CI i 4 timer hvert 2 min. Etter denne perioden ble den CI målt hver time i 92 timer.
celleproliferasjon og levedyktighet
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ubelagte eller belagt med de angitte reagenser ved en densitet på 1,25 × 10
4 celler /cm
2. Vekst som en funksjon av økende samløpet ble målt ved bruk av levende innhold cell imaging IncuCyte HD system (Essen BioScience). Bilder ble tatt med et 10x objektiv på 2 timers mellomrom fra 3 separate brønner per belegg tilstand, og mener ± SD av Confluence prosenter ble beregnet. Metabolsk aktivitet av cellene dyrket på de forskjellige belegg ble målt med AlamarBlue etter 96 timer i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, USA). Kinetisk analyse ble utført med GraphPad Prism (GraphPad Software). Gjennomsnittsverdier av tre paralleller ble beregnet etter bakgrunnskorrigering.
Adhesjon og kvantifisering av morfologiske parametere
LNCaP-celler ble sådd i en 96-brønns plate, ubelagt eller belagt med de angitte reagenser ved en tetthet av 3,12 × 10
4 celler /cm
2. Etter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter på is, permeabilisert med 0,2% (v /v) Triton X-100 /PBS i 10 min, og farget med CellMask Deep rød plasmamembran Stain (2,5 ug /mL, Invitrogen) og 1 ug /mL DAPI (Invitrogen). Vurderingen av celleadhesjon ble foretatt måling av antall celler som igjen er festet til platen etter vasketrinnene via Content Operetta høy Imaging System (PerkinElmer). Den morfologiske parametere celleområdet og kjerner området ble kvantifisert.
Time-lapse bildebehandling
Overflater på en 6 brønn /plate ble belagt som beskrevet ovenfor. LNCaP-celler ble sådd ut ved en densitet på 1,58 x 10
4 celler /cm
2 og overvåket i 96 timer. Hvert 15. min et bilde ble tatt med en Zeiss Axio Observer lysmikroskop (mål 20 ×) for å følge formen endringer og migrasjon gjennom tidene. Videoene kan bli funnet som Video S1-S6.
Distribusjon av F-aktin
LNCaP celler ble dyrket på glassdeksel slips ubestrøket og belagt med de angitte reagenser for 24 timer og 96 timer. Cellene ble deretter fiksert og permeabilisert som beskrevet ovenfor, etterfulgt av farging med rhodamin-phalloidin (01:40, Invitrogen) og 1 ug /mL DAPI (Invitrogen). De immunofluorescence komplekser ble visualisert med et Olympus (FV1000 Spectral) konfokal mikroskop ved hjelp av en 60 × linse. Optisk seksjonering ble utført ved å kjøpe en bunke med bilder på forskjellige brenn posisjoner langs z-aksen.
Scratch såret analysen
LNCaP celler (3,12 × 10
4 celler /cm
2) ble sådd i en 96-brønns plate Essen ImageLock (Essen BioScience) ubelagt eller belagt som beskrevet tidligere, og ble dyrket til konfluens i en CO
2 fuktet inkubator. Etter 24 timer ble scratch gjort ved hjelp av 96-pin WoundMaker (Essen BioScience). Sårbilder ble tatt hver en time i 36 timer, og dataene ble analysert ved den integrerte metriske Relativ Wound tetthet del av levende innhold cell imaging system IncuCyte HD (Essen BioScience). Forsøket ble gjort i tre eksemplarer.
Følsomhet for simvastatin
Påvirkningen av FN, PLO og PLL belegg på cellen følsomhet for simvastatin ble undersøkt. LNCaP-celler ble sådd ut i triplikat og dyrket i en 96-brønners E-platene som beskrevet ovenfor. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av simvastatin (Sigma-Aldrich) og overvåket hver 1 time i 60 timer ved hjelp av RTCA system. IC
50 for 24 timer, 48 timer og 72 timer behandling ble beregnet ved hjelp av programvaren GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).
QRT-PCR
Overflater på en seks godt plate ble belagt som beskrevet ovenfor, og LNCaP-celler ble sådd ut ved en densitet på 1,05 x 10
4 celler /cm
2. Etter 72 timer ble vekstmediet erstattet av trekull-strippet (androgen-fratatte) serum RPMI-media (CSS, Invitrogen, USA) supplert med 5% (v /v) CSS og cellene ble dyrket i 48 timer. Til slutt, LNCaP-celler ble behandlet med 20% (v /v) etanol som kontroll eller androgener R1881 (1 nM) og DHT (10 nM) i 30 timer.
Totalt RNA ble oppnådd ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Mengden og kvaliteten av RNA ble målt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer UV (ThermoFisher Scientific, USA). Prøver med en 260/280-forhold høyere enn 2,0 ble anvendt for etterfølgende prosedyrer. Prøvene ble behandlet med DNAse Amp klasse I, og 2 mikrogram av total RNA ble revers-transkribert ved bruk av cDNA-syntesemetode for qPCR sett (Invitrogen). QRT-PCR ble utført med SYBR Grønn mester mix (Invitrogen) ved hjelp av 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Data ble analysert med SDS2.3 programvare (Applied Biosystems). MRNA ekspresjonsnivåer ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt fremgangsmåte og normalisert i forhold til uttrykket nivåer av huset holde genet (GAPDH eller RPL32) av den respektive behandling og beregnet i forhold til den ikke-belagte kontroll etanol. Sekvensene av primerne brukt, er oppført i tabell S1.
Resultater
FN, PLO og PLL forbedre celle-substrat tilslutning
sanntid celle analysator (RTCA) xCELLigence er en etikett-fri metode som måler spredning rate, etterlevelse og morfologi basert på impedans endringer. Endringer i impedans er oversatt som dimensjonsløs sikt
celleindeks plakater (CI). Vi utførte RTCA analyse av LNCaP-celler utsådd i brønner forhåndsbehandlet med de forskjellige belegg på celletettheter mellom 9,4 x 10
3 til 6,25 x 10
4 celler /cm
2 i en 96-brønners plate, og undersøkt både feste fase (24 timer etter såing) (fig. 1) og proliferasjonen fase (24 timer til 96 timer post seeding) i cellekulturen (fig. 2). Det ble antatt at festingen av celler ut av suspensjon på substratet og cellemorfologi forandringer assosiert med denne prosessen var de viktigste bidragsytere til den CI løpet av de første 24 timer av eksperimentet (fig. 1). Derfor var bidraget av proliferasjon til CI for denne perioden anses marginal, som ble ytterligere støttet av det faktum at LNCaP-celler dyrket under lignende betingelser viste en doblingstid på 36 timer. [20] Faktisk, sammenligning av de forskjellige seeding tettheter av kontrollen og belegget reagenser ved 3,12 x 10
4 celler /cm
2 i en 96-brønners plate etter 24 timer viste at PLL øket CI til en tilsvar utstrekning som dobling av antall seeded celler, dvs. fra 3,12 × 10
4 til 6,25 × 10
4 celler /cm
2 (fig. S1). Ved alle celletettheter, belegg med fibronektin (FN) resulterte i det høyeste CI etter 24 timer, fulgt av poly-l-lysin (PLL) og poly-L-ornitin (PLO). PLL og PLO økt CI på svært lignende priser opp til 3,12 × 10
4 celler /cm
2, mens PLO redusert skråningen på alle celletettheter (fig. 2). Den laminin (LAM) belegg påvirket ikke CI i forhold til kontroll, mens kollagen type IV (COL) forårsaket CI å stige langsommere. Interessant nok var denne rekkefølgen ikke påvirket ved å øke antallet av seeded celler. Disse resultatene antydet at FN, PLL og PLO markert forbedret festing av LNCaP-celler, med ECM-proteinet å være overlegne i forhold til de poly-amino-syrer.
Cellene ble overvåket i 24 timer for å analysere celle-substrat fra tilslutning tids celler ble tilsatt til brønnene (t = 0) ved hjelp av et sanntids celle analysator (xCELLigence, Roche). Hvert datapunkt er representert av dets midler (n = 3) ± SD.
Cellene ble overvåket i 72 timer for å analysere virkningene av beleggene på LNCaP-celler 24-96 timer under anvendelse av en ekte -time celle analysator (xCELLigence, Roche). Dataene ble normalisert ved 24 timer for sammenligning av bakkene. Hvert datapunkt er representert av dets midler (n = 3) ± SD.
Fase proliferasjonen ble målt fra 24 timer etter utsåing av cellene til 96 h (fig. 2). De viktigste bidragsytere til denne fasen av endringer i den CI er celleproliferasjon, tilslutning og morfologi. Ved alle celletettheter som ble testet, LNCaP-celler dyrket på LAM vises en hastighet på CI-økningen som var umulig å skille seg fra kontrollen. I kontrast, LNCaP celler dyrket på COL substrat viste et etterslep fase hvor CI ikke øke opp til 48 timer etter såing, og en samlet redusert sats på CI økning (fig. 2B-E). Disse effektene var uavhengig av antall seeded celler. I det hele tatt celletetthet PLL underlaget forårsaket en påviselig nedgang i CI økningen. Den samme effekten var synlig på PLO substratet på det høyeste seeding tetthet (6,25 x 10
4 celler /cm
2, fig. 2E), mens CI økes raskere på PLO-belagte substrat ved lavere seeding tettheter (Fig . 2A og B). Bortsett fra den laveste celletetthet (9,4 x 10
3 celler /cm
2), CI hastighetsøkning på celler dyrket på FN substratet var konsekvent høyere enn kontrollen (Fig 2B-E.); en effekt som syntes å være upåvirket av økning i antall seeded celler. Tatt sammen, høye celletettheter ( 4,69 x 10
4 /cm
2) negativt påvirket CI når LNCaP-celler ble dyrket på substrater belagt med poly-aminosyrer (PLL og PLO), men var upåvirket med ECM proteiner (COL, LAM og FN). Denne observasjonen er spesielt viktig for cellekultur eksperimenter hvor en høy celle sammenfletting er ønskelig. Videre, en seeding tetthet på 9,4 × 10
3 celler /cm
2 var generelt skadelig for cellekultur av LNCaP celler, noe som resulterer i mangel på celleproliferasjon, som var sannsynligvis på grunn av knapphet på celle-celle kontakter.
Alle beleggingsbetingelsene redusert celleproliferasjon, men ikke sterkt påvirker LNCaP cellelevedyktighet
celle-indeksen er et kombinert mål på formeringshastigheten, tilslutning og morfologien av cellene. Derfor ble effekten av belegget reagensene på hver av disse parametrene undersøkt hver for seg. Celletettheten av de belagte brønnene økes langsommere enn de ubelagte brønnene. Celler dyrket på FN, PLL, PLO og LAM vises tilsvarende vekstrater (Fig. 3A). Kollagen type IV var belegget stoff som negativt påvirket celleproliferasjon mest. Undersøkelse av levedyktighet /metabolsk aktivitet i LNCaP celler dyrket i 96 timer på de ulike belegg substrater av AlamarBlue analysen viste at alle belegg reagenser redusert celle levedyktighet, med COL litt dårligere enn de andre belegg (fig. 3B). Denne effekten var tilsvarende de resultater som ble oppnådd for brønnløpet på forskjellige belegg (fig. 3A). Tatt sammen, disse resultatene viste at belegget reagensene påvirkes celleproliferasjon og metabolisme aktivitet av LNCaP-celler.
LNCaP-celler ble sådd ut på 1,25 x 10
4 celler /cm
2 på en polystyren 96 brønn -plate ubelagt eller belagt med poly-L-ornitin, poly-L-lysin, kollagen type IV, laminin eller fibronektin. (A) Wells konfluens ble overvåket hver 2 timer til 96 timer ved hjelp av IncuCyte system. (B) Metabolsk aktivitet /cellenes levedyktighet ble målt ved AlamarBlue analyse etter 96 timer. Hvert datapunkt er representert av dets midler (n = 3) ± SD. Betydelige resultater (p 0,05). Er merket med en stjerne
COL og LAM indusert LNCaP celler til å aggregere
IncuCyte bilder avslørte at LNCaP celler ble festet til overflaten i alt belegg betingelser etter (4A fig.) 24 timer. Cellene dyrket i brønner forbelagt med FN, PLL, PLO, LAM, så vel som vist styre en fibroblast-lignende form typisk for LNCaP-celler. [21] I motsetning til dette, LNCaP-celler dyrket på COL hadde en rundere form. Celler dyrket på COL og LAM også en tendens til å aggregere. I tillegg brønnene belagt med LAM og FN inneholdt flere runde celler når sammenlignet med de andre belegging av substrater (Fig. 4A). Det samme ble observert etter 96 timer (fig. 4B). Etter 96 timer, mesteparten av cellene ervervet en spindel form i alle belegg forhold. Celler på COL vokste i aggregater etter 96 h (fig. 4B).
LNCaP-celler fotografert etter 24 timer (A) og 96 t (B) med IncuCyte system, 10 x. Scale bar = 300 mikrometer. (C) Snap shots fra 96 h time-lapse mikros video av LNCaP celler. Pilene viser lamellipodia av polariserte celler. Scale bar = 50 mikrometer (20 ×, Zeiss Axio Observer).
For å undersøke effekten av belegget reagenser på celle mobilitet og morfologi mer detaljert i sanntid, LNCaP celler ble undersøkt ved høy forstørrelse time-lapse mikroskopi. Ligner på IncuCyte eksperiment, time-lapse mikroskopi viste at COL og LAM (fig. 4C) forårsaket LNCaP celler til å danne aggregater. I tillegg celler dyrket i LAM-belagte brønner viste tilstedeværelsen av mange polariserte celler, karakterisert ved nærværet av asymmetriske celler. De PLL- og PLO-behandlede prøver viste en lignende morfologi når sammenlignet med kontrollen. Likevel, LNCaP seeded på følgende underlag syntes å feste raskere enn kontrollcellene og migrere mindre. Videoer av time-lapse mikros over en periode på 96 timer kan bli funnet i Video S1-S6.
LNCaP celler feste bedre til overflater belagt med FN, PLO og PLL, som også påvirker cellemorfologi
Tilbehør og celle morfologi, som komponere del av CI, ble undersøkt av høyt innhold screening (HCS). HCS av LNCaP-celler målt en betydelig høyere celletetthet (bedre festing) etter forbehandling av brønner med PLO eller PLL sammenlignet med kontroll, FN, COL eller LAM ved alle tidspunkter (fig. 5A). Celler dyrket i nærvær av FN festet bedre enn kontrollcellene i 72 timer og 96 timer. I forhold til cellemorfologi forandringer, ble det område av kjernen, og det totale celleområdet påvirket av alle belegg (fig. 5B og 5C). -Celler dyrket på PLO, PLL og FN i 96 timer viste økt kjerne- og cellulære områder på minst 8% og 18%, respektivt, når sammenlignet med kontrollen. I forhold til kontrollgruppen, og COL LAM minsket de nukleære og cellulære områder med 7% og 10%, og 15% og 14%, respektivt.
Celler ble analysert for celletettheten (A), kjerneområdet (B ) og celleområdet (C) på fire forskjellige tidspunkter ved hjelp av et høyt innhold screening instrument (operette).
de forskjellige belegg reagenser påvirket F-Actin organisasjon
For å undersøke endringene i cellemorfologi og mobiliteten av LNCaP-celler i mer detalj, utførte vi konfokal fluorescens mikroskopi og undersøkt F-aktin organisering av LNCaP-celler, som for eksempel nærvær av lamellipodia ved 24 timer (fig. 6A) og 96 timer (fig. 6B) post-seeding. Disse strukturene består av parallelle pakket aktin filamenter som tester underlaget for å bestemme hvor og hvordan de fokale sammenvoksninger bør etableres for vedlegg. I tillegg er disse filamenter bidrar til dannelse av actin spennings fibre. [22], [23] Den vedheft og spredning av celler innebærer ombygging av cytoskjelettet. Dynamiske strukturer som kalles fokale kontakter form rundt inte ved vedheft områder. Integrinene er bundet til ECM-komponenter på den ene siden, og til aktin filamenter som kalles belastnings fibre på den andre siden. Påføringen av kraften i den ene siden forårsake reaksjon på den andre, og dette, sammen med integrinsignalveier, bestemmer celleformen. [3] I samsvar med resultatene observert i time-lapse mikros forsøket, observerte vi mange polariserte celler etter 24 timer på Fn og LAM-behandlet glass dekkglass (Fig. 6A). I tillegg, etter 96 timer ble det observert at fibrene ble mer uorganisert med noen kortikal aktin opphopning rundt cellelegemet og et redusert antall spennings fibre i nærvær av FN (fig. 6B). Videre FN forårsaket en betydelig økning i aktin-farging, og cellene mistet sin polaritet (fig. 6B).
Celler ble dyrket på glass dekkglass uten belegg (kontroll), eller belagt med fibronektin (FN), laminin (LAM), poly-l-lysin (PLL), poly-L-ornitin (PLO), eller kollagen type IV (COL IV). Etter 24 timer (A) eller 96h (B), ble cellene farget for F-aktin med rhodamin-phalloidin, motfarget med DAPI, og analysert ved konfokal mikroskopi fluorescens (60 x, Olympus). Pilene viser lamellipodia av polariserte celler og pil hoder markere filopodia. Målestokk = 50 um.
Celler dyrket i nærvær av PLL og PLO (fig. 6) viste en mer diffus aktin mønster med noe konsentrert aktin flekker på celle periferien ved 24 timer og 96 timers . Det ble observert at tilstedeværelsen av mange actin bunter og radialt utvidet aktin filamenter rundt celler, som kalles filopodia,. Kjerner av celler dyrket på PLL viste en sterk DAPI intensitet ved 24 timer (fig. 6A), som ble redusert ved 96 h (fig. 6B). Videre er kjernene økt i størrelse etter 96 timer.
I 24 timer, cellene i brønnene belagt med COL (Fig. 6A) viste en actin mønster som ligner på kontrollen. Ikke desto mindre, etter 96 timer med vekst, aktin filamenter ble mer organisert enn i kontrollgruppen (fig. 6B).
PLL, PLO, eller FN-belagte brønner øke festing av LNCaP-celler og svakt redusert cellemobilitet , mens LAM øker migrasjons
Morfologiske endringer er vanligvis forbundet med endringer av andre celle egenskaper, herunder motilitet, differensiering og metabolsk aktivitet. [24] For å møte denne muligheten, ble motiliteten i LNCaP-celler dyrket på polystyren behandlet med de forskjellige belegg reagensene vurdert i en sårtilheling assay (fig. 7). LNCaP-celler ble sådd i 24 timer i brønner belagt med FN, LAM, PLL, PLO eller COL, og cellemonolaget ble skrapet ved anvendelse av en 96-pinners WoundMaker. Kvaliteten på sår som genereres på PLL, PLO, eller FN-belagte brønner var overlegen i forhold til kontrollen (uten belegg) og LAM, bedømt ved hjelp av den relative mykhet av kantene av bunnen, så vel som en svært lik sårområdet (Fig . S2). En annen observasjon er at LNCaP-celler dyrket i PLO eller PLL-behandlede brønner kolonisert i brønnen i en semi-organisert mønster, hvor de langstrakte cellelegemer ble innrettet i parallell (fig. S2). Forbehandling med LAM ikke bedre etterlevelse av LNCaP celler i forhold til kontroll, og WoundMaker generert sår med ujevne kanter og av annet område. LNCaP-celler forskyves så store ark av celler fra COL-behandlede brønner når det omsettes med den WoundMaker (data ikke vist), noe som indikerer at COL var dårligere enn ubelagte brønnene og ikke egnet for denne anvendelse. Analyse av den relative tetthet sår viste at celler dyrket i nærvær av LAM migrerte 62% raskere inn i sårområdet enn kontrollcellene etter 36 h (fig. 7). Til sammenligning, PLL, PLO og FN forårsaket LNCaP-celler til å migrere saktere enn kontrollen, viser en reduksjon av sår-tetthet med 15%, 33% og 20% dyrkes under disse betingelser hhv. Spesielt, LNCaP celler viste en dobling tid rundt 36 h, som observert i RTCA eksperimenter, [20] noe som tyder på at de observerte effektene på såret tetthet ble forårsaket hovedsakelig av cellemigrasjon og ikke spredning.
Relativ såret tetthet ved forskjellige tidspunkter av LNCaP-celler i løpet av en periode på 36 timer. Målingene er fra sår gjort på et monolag av LNCaP-celler dyrket i nærvær av forskjellige belegg behandlinger og kontroll.
PLL sensitizes LNCaP-celler for HMGCR inhibitoren simvastatin
Tidligere studier har vist at pre-belegg med ECM-komponenter kan påvirke følsomheten av celler til forskjellige medikamenter. For eksempel har LAM og FN blitt rapportert å øke motstanden mot ioniserende stråling og cellegiften Ukrain i menneskelig tumor og normale celler
i
vitro
. [25] Videre ble det rapportert at tilslutning til en FN substrat-indusert kolesterolsyntesen ved aktivering av HMGCR og også økt fettsyresyntese i humane fibroblaster og rottelever-tumorceller, mens en PLL substrat eller FN i oppløsning hadde ingen effekt på disse banene [ ,,,0],26].
således effekten av belegget reagensene PLL, PLO og FN på følsomheten av LNCaP-celler til HMGCR inhibitoren simvastatin ble undersøkt ved RTCA, og IC
50 ble beregnet for behandlingsperioder av 24 timer, 48 timer og 72 timer (fig. S3). LAM og COL effektene ble ikke analysert fordi disse belegg reagenser hatt negative effekter på LNCaP celleoverflaten etterlevelse og forårsaket celle aggregering. Mens IC
50 for simvastatin var relativt lik blant de fire beleggs forhold på 24 timer, økte PLL følsomheten av LNCaP-celler til HMGCR inhibitoren ved to gangers etter 48 timers behandling i forhold til kontrollen (fig. S3) . Ved 72 timer, LNCaP-celler dyrket på et substrat PLL vist et tre ganger lavere IC
50. Tilsvarende PLO og FN øket følsomheten av LNCaP-celler til simvastatin ved to ganger i forhold til kontrollen ved 72 timer. Det har imidlertid blitt observert at PLO, PLL og FN redusert cellelevedyktighet med en tredjedel ved 96 timer (fig. 3B). Derfor kan det hende at sensibilisering av LNCaP celler ved PLO og FN til simvastatin være faktisk effekten av disse belegg på celle levedyktighet. I dette tilfellet, bare PLL kan betydelig sensitiv LNCaP celler for HMGCR inhibitor simvastatin i en tidsavhengig måte.
Androgen respons og AR signale var generelt ikke påvirkes av beleggingsbetingelsene
I den friske voksent menneske prostata epitel, AR ekspresjon og celle adhesjon til underlaget skje i separate cellelag, nemlig i luminal og basalceller. Derfor trasé av AR signalering og celle adhesjon er usannsynlig å samhandle direkte. [29] Under utviklingen av prostatakreft, ondartede luminal epitelceller endre seg fra celle-celle adhesjon til celle-substrat adhesjon, og signaler fra celleadhesjon og AR er ko-uttrykt. [27] Den LNCaP-cellelinjen er et viktig modellsystem for å studere androgenreseptoren (AR) -mediert signalering i prostata kreft. Det ble nylig vist at endringer i celle-celle kontakter og ekstracellulære matrise endret responsen av LNCaP cellene til androgener.
