Abstract
Små ikke-proteinkodende RNA, mikroRNA (MIR), som regulerer budbringer-RNA-nivå, har nylig blitt identifisert, og kan spille en viktig rolle i patogenesen av forskjellige sykdommer. Denne studien fokuserer på MIR-31 og undersøkt potensialet sitt engasjement i lunge kreftutvikling. Ekspresjonen av MIR-31 ble endret i lungekreftceller gjennom enten den forsterkning eller tap av verten gen locus. Den sterke uttrykk for MIR-31 i store cellekreft ble tilskrevet genet forsterkning. I mellomtiden, tap av MIR-31 uttrykk ble hyppigere observert i aggressive adenokarsinomer. Således kan MIR-31 spiller en pleiotropisk rolle i utvikling av lungekreft mellom ulike histologiske typer. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som viser potensialet utløsende mekanisme av den endrede uttrykk for MIR-31 og foreslå sin potensielt mangfoldig betydning i de ulike histologiske typer lungekreft
Citation. Okudela K, Tateishi Y, Umeda S, Mitsui H, Suzuki T, Saito Y, et al. (2014) Allelic Ubalanse i MIR-31 Host Gene Locus i Lung Cancer – Den potensielle rolle i Karsinogenese. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10,1371 /journal.pone.0100581
Redaktør: Salvatore Papa, Institutt for Hepatology – Birkbeck, Storbritannia
mottatt: 23 januar 2014; Godkjent: 26 mai 2014; Publisert: 30 juni 2014
Copyright: © 2014 Okudela et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den japanske departementet for utdanning, kultur, sport og vitenskap (Tokyo Japan), og ved en bevilgning fra Yokohama Medical Facility (Yokohama, Japan). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i den industrialiserte verden [1], [2]. Selv om den primære tumor er vellykket resected, er en gjentakelse observeres i en stor prosentandel av pasientene [1], [2]. Selv om noen lungesvulster er følsomme for konvensjonelle kjemoterapi eller visse molekylære målsøkende midler, mange er ikke [3], [4]. Dermed er videre forståelse av den molekylære mekanismen bak lunge kreft viktig for utvikling av nye terapeutiske strategier.
Små ikke-proteinkodende RNA, har mikroRNA, som regulerer budbringer-RNA-nivå, nylig blitt identifisert, og har vist seg å spille en viktig rolle i patogenesen av forskjellige sykdommer. Various mikroRNA (MIR), inkludert la-7, MIR-21, MIR-30d, MIR-31, MIR-155, og MIR-205, har blitt foreslått å være involvert i kreftutvikling av ulike typer maligniteter [5]. Blant dem ble MIR-31 rapportert å være mer sterkt uttrykt i svulstvev enn i ikke-tumor vev, og er foreslått å ha en rolle i onkogent lunge karsinogenese [6] – [12]. Videre er en fersk studie viste den prognostiske verdien av MIR-31, fordi høyere uttrykk av MIR-31 var assosiert med dårligere utfall hos pasienter med lungekreft [13]. I mellomtiden, en forskjell i MIR-31 uttrykk blant histologiske typer lungekreft og potensialet mekanismen av en endret uttrykk for MIR-31, er ikke blitt klarlagt.
Denne studien analyserte uttrykk for MIR-31 og status for sin vert genet locus i de ulike histologiske typer lungekreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
en udødeliggjort human airway epithelial cellelinje (16HBE14o , Simian-virus 40 (SV40)-transformerte humane bronkiale epitelceller) beskrevet av Cozens aL et al. (1994) [14] ble vennlig levert av Grunert DC (California Pacific Medical Center Research Institute). En sub-klon av 16HBE14o celler, beskrevet som NHBE-T i denne studien, ble anvendt. Udødeliggjort luftveier epiteliale cellelinjer (HPL1D og HPL1A, SV40-transform menneskelige liten luftveis epitelceller) ble etablert av Masuda A et al. (1997) [15]. Humane lungekreftcellelinjer (A549, H322M, H358, H522, H820, H2087, H23, EKVX, H226, H827, H1819, H441, H4006, HOP62, H1299, og H460) og humane embryonale nyrecellelinje (HEK293T) var kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den menneskelige lungekreft cellelinje LC2AD, Lu130, Lu135, Lu139, og Lu140, ble kjøpt fra Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan). De menneskelige lungekreftcellelinjer, PC9 og HARA, var fra Immuno-Biological Laboratories Co. (Gunma, Japan). Den menneskelige lunge kreft cellelinjer, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17, og TKB20, ble hentet fra Dr. Hiroshi Kamma via Dr. Takuya Yazawa (Kyorin University School of Medicine) [16]. Primær liten luftveis epitelceller (SAEC) og normale menneskelige bronkiale epitelceller (NHBE) ble kjøpt fra SANKO Kagaku (Tokyo, Japan).
Primær lungekreft
Det er totalt 129 primærlungesvulster (71 adenokarsinomer, 38 plateepitelkarsinom, 18 store cellekreft, 2 små cellekreft) ble fjernet ved radikal kirurgisk reseksjon ved Kanagawa hjerte og luftveier Center Hospital (Yokohama, Japan). Denne studien ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen [17], og ble godkjent av etiske komiteer i Yokohama City University og Kanagawa prefekturs hjerte og luftveier Center Hospital [18]. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersoner materialer.
RNA ekstraksjon
Cellelinjer ble vasket med kald fosfatbuffer saltvann og deretter hurtigfrosset. Formalinfiksert og seksjoner parafininnstøpte vev ble undersøkt mikroskopisk. Tumorous og ikke-tumor deler ble dissekert med et barberblad. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).
Kvantitativ RT-PCR
For å oppdage miRNA, første-tråd cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av speil X miRNA First-Strand Synthesis Kit henhold til protokoller av produsenten (Takara, Kyoto, Japan). CDNA genererte ble brukt som en mal i real-time PCR med SYBR Premiks EXTaq (Takara) og kjøre på en termosykler DICE real-time PCR system (Takara). Termin primer som brukes for påvisning for MIR-31 var 5’AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (modne MIR-31, MIMAT0000089). Det motsatte primer var den universelle mRQ 3 «primer (Takara). Primeren sett brukes til å oppdage U6 snRNA ble kjøpt fra Takara Bio Inc. MiR-31 nivå ble normalisert til U6 snRNA nivåer. For å oppdage mRNA, ble først-cDNA syntetisert fra total RNA ved hjelp av Super III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). CDNA genererte ble brukt som en mal i real-time PCR med TaqMan Gene Expression analyse system (Applied Biosystems, Foster City, California) og kjøre på en termosykler DICE real-time PCR system (Takara). De TaqMan prober og primer sett brukes til å oppdage GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], og RHOA [NM_001664.2], ble tilpasset og kjøpt Applied Biosystems. ITGA5, MMP16, og RHOA nivåene var normalisert til GAPDH-nivåer.
PCR-analyse av den mir-31 locus
Genomisk DNA ble ekstrahert fra kreftcellelinjer ved hjelp av DNeasy kit (Qiagen). Statusen (sletting eller oppbevaring) av Mir-31 hot genet locus ble analysert ved genomisk DNA PCR med primer sett F 5′- TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC og R 5’TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. Statusen for CDKN2A gen locus (D9S974) og en annen fjernt locus av den korte arm av kromosom 9 (D9S304) ble også analysert ved bruk av primer sett av F 5′- GAGCCTGGTCTGGATCATAA og R 5′- AAGCTTACAGAACCAGACAG, og F 5′- GTGCACCTCTACACCCAGAC og R 5’TGTGCCCACACACATCTATC hhv.
In situ
hybridisering for miRNA
In situ
hybridisering ble utført i henhold til en metode som er beskrevet tidligere [ ,,,0],19]. Kort, låst nukleinsyre (LNA) -modifisert deteksjons prober for MIR-31 og U6 snRNA og egge negativ kontroll sonde (Exiqon, Vedbæk, Danmark) ble merket med digoxigenin (DIG) ved hjelp av DIG oligonukleotid Daling kit (Roche, Basel , Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner. Formalinfiksert og parafininnstøpte vevssnitt ble acetylert og hybridisert med DIG-merkede gjenkjenning prober, og ble deretter undersøkt med alkalisk fosfatase-konjugert anti-DIG Fab-fragmenter (Roche). Den hybridisering signalet ble visualisert ved hjelp av en fargefremkallerløsning (Roche).
Fluorescent
in situ
hybridisering (FISH) for genet locus
Formaldehyd fiksert og parafin-embedded vevssnitt ble anvendt for analysen. Snittene ble kokt i citrat-buffer (0,01 M, pH 6,0) for å frigjøre lukkede kromosomale strukturer [20]. Disse delene ble hybridisert med en Cy3-merket probe dekker Mir-31 locus (BAC klone: RP11-354P17) og en FITC-merket probe for cent locus på kromosom 9 (Vysis INC, Downer Groves, IL.). Signalet fra MIR-31-locus og cent 9 ble tellet i mer enn 50 celler i hver tumor, og kopiantallet av den mir-31 locus forhold til den for cent 9 ble beregnet.
Behandling med 5 -azacytidine og trichostatin A
Cellene ble behandlet enten med 10 pM av 5-azacytidin (Sigma, St. Louis, MO) i 72 timer ved utveksling av medium hver dag eller med 300 ng /ml trichostatin A ( Wako, Osaka, Japan) i 24 timer. Celler ble også behandlet med 5-azacytidin i 48 timer og deretter med en kombinasjon av 5-azacytidin og trichostatin A i ytterligere 24 timer.
Metylering-spesifikk PCR-
Genomisk DNA ble underkastet en bisulfate konvertering behandling med MethylEasy DNA bisulfate modifikasjon kit (menneskelige genetiske signaturer, Macquarie Park, Australia). Metylering-spesifikk PCR rettet mot de to CpG områder i promoteren geometriske sted for mir-31 vert genet (LOC554202), som tidligere ble demonstrert [21], ble utført i henhold til den metode som er beskrevet andre steder [21].
bisulfat DNA-sekvensering
A GPC sete i promotoren geometriske sted for miR31 vert-genet (LOC554202), som tidligere ble demonstrert [21], ble PCR-amplifisert ved anvendelse bisulfat-behandlede genomisk DNA som et templat, ifølge Fremgangsmåten beskrevet andre steder [21]. PCR-produktet ble subklonet inn i pT7 blå plasmid vektor (Novagen, Darmstadt, Tyskland), og ble deretter underkastet en syklus farvestoff-terminator reaksjon med den universelle T7-promoter-primer ved bruk av store Dye Terminator Version 3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Statistical Analysis
Forskjeller i hjelp av den relative kopiantallet av den mir-31 locus blant grupper klassifisert i henhold til forskjellige patologiske parametere ble analysert med enveis ANOVAs . Forskjeller i midlene for MIR-31 nivåer i den hemmende forsøket ble analysert med en uparet Student t-test. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (SPSS for Windows versjon 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).
Andre
De eksperimentelle prosedyrer som brukes til å utføre immunhistokjemi for Ki-67 og analysere onkogene mutasjoner i KRAS og EGFR-genene ble beskrevet andre steder [22].
Resultater
MiR-31 og uttrykk for sine kjente mål i lungekreftcellelinjer
speil 31 uttrykk syntes å være sterk i enkelte kreftcellelinjer, men var helt fraværende i andre noen cellelinjer (fig. 1). Ekspresjonen av la-7i ble også undersøkt. La-7i ble uttrykt i alle cellelinjene og dens nivåer skilte seg fra de av MIR-31 (figur S1). Det fungerte som en kontroll for å vurdere kvaliteten på materialene og sørget for at merket forandringer skjedde i uttrykket av MIR-31. Dessuten, et innledende forsøk viste at gjenopprettelsen av MIR-31 markert undertrykkes veksten av en cancercellelinje (LC2AD) som nesten mistet sin evne til å uttrykke MIR-31 (figur S2). Resultatene bedt oss å ytterligere undersøke potensialet betydningen av endrede uttrykk for MIR-31 i lunge kreftutvikling.
MiR-31 nivåer ble normalisert til U6 snRNA nivåer. Tekniske replikater ble utført in triplo. Midler og standardavvik (feilfelt) er vist. AEC, luftveis-epitelceller (ikke-cancerøse celler); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle carcinoma celle; SCC, småcellet karsinom.
Status for MIR-31 genet locus i lungekreftcellelinjer
De statusene MIR-31 genet locus, CDKN2A locus, og den tilstøtende locus (D9S304), ble undersøkt ved hjelp av PCR-analyse. Blant de førti-en cellelinjer undersøkt, seks cellelinjer (14,6%, 6/41 cellelinjer, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, og TKB9) mistet MIR-31 vert genet locus (fig 2, tabell 1. ), mens tolv linjer (29,3%, 12/41 cellelinjer;. TKB14, H4006, A549, LC2AD, TKB4, H460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) mistet CDKN2A locus (fig 2, tabell 1 ). Alle seks linjer som mistet Mir-31 locus også mistet CDKN2A locus (fig. 2, tabell 1). Den tilstøtende locus (D9S304) fungerte som en positiv kontroll for PCR-analyse (fig. 2).
Resultatene fra PCR-analyse vises. AEC, luftveis-epitelceller (ikke-cancerøse celler); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle carcinoma celle; SCC, småcellet karsinom.
epigenetisk modifikasjon av MIR-31 promoter og dens uttrykk
MiR-31 uttrykk var fraværende i alle de seks cellelinjer miste Mir -31 vert genet locus (fig. 2, tabell 1). I mellomtiden, de fem cellelinjer (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17) som beholdt MIR-31 genet locus (fig. 2, tabell 1) også mistet MIR-31 uttrykk eller kraftig redusert sitt nivå (fig. 2, tabell 1), som indikert den potensielle engasjement av epigenetisk modifikasjon i sin nedregulering. Således ble cellelinjer som går tapt MIR-31 ekspresjon, men beholdt sin gen locus undersøkt for å undersøke effektene av inhibitorer for DNA-metyltransferase og histon deacetylase på ekspresjon av MIR-31. Enten og /eller en kombinasjon av begge inhibitorer ikke reproduserbart å gjenopprette MIR-31-ekspresjon i disse cellene (fig. 3A). Metylering-spesifikke PCR-analyse på to steder i promoter-regionen i MIR-31 vert genet avslørte at de to områdene ble metylert i alle cellelinjer undersøkt (Fig. 3B). Bisulfate DNA-sekvensering analyse på CpG stedet av arrangøren regionen også avdekket at det ble tidvis metylert i alle cellelinjer undersøkt (SAEC, NHBE-T, H820, H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17) (fig. 3C). Nivåene av metylering syntes å være ikke signifikant forskjellig mellom celler som holder uttrykk for MIR-31 (SAEC, NHBE-T, og H820) og de miste den (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17) (Fig. 3C) . Metyleringen status for de antatte promotor-områdene av MIR-31 vert-gen var ikke assosiert med gjenvinning av status MIR-31 nivåer etter behandlingene med inhibitorer (Fig. 3A og 3C). Dermed DNA metylering i den antatte regionen undersøkt her kunne ikke tilskrives nedregulering av MIR-31.
Celler behandlet med kjøretøy kontroll (CTL), 5-azacytidin (AZA), trichostatin A (TRC), eller en kombinasjon av AZA og TSA (AZ /TR) ble undersøkt for restaurering av MIR-31 uttrykk ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Den relative nivået av MIR-31 normalisert til de av U6 snRNA ble beregnet. To uavhengige eksperimenter ble utført. Tekniske replikater av PCR-analyse ble utført i tre eksemplarer. Gjennomsnitt og standardavvik (feilfelt) er vist (A). De to steder (S1 og S2) fra den antatte promotor av MIR-31 ble PCR-amplifisert med primere som er spesifikke for enten metylert (M) eller unmethylated (UM) DNA ved bruk av natriumbisulfat-modifisert genom-DNA som et templat, i henhold til metoden beskrevet i en tidligere studie [21]. Representative resultater er presentert (B). Den delen av MIR-31 promotoren inneholdende CpG områder ble PCR-amplifisert ved anvendelse natriumbisulfat-modifisert genom-DNA som et templat, i henhold til den metode som er beskrevet i en tidligere studie [21]. Åtte subkloner av PCR-produktene ble analysert med henblikk på deres metylering status ved hjelp av DNA-sekvensering. Åpne (○) og fylte (•) sirkler angitt unmethylated og metylert cytosin den indikerte CpG områder, henholdsvis (C). AEC, luftveis-epitelceller (ikke-cancerøse celler); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle karsinom; SCC, småcellet karsinom.
Uttrykk av MIR-31 i grunnskolen lungekreft
Kvantitativ RT-PCR-analyse avdekket at enkelte tumor og ikke-tumorvevet uttrykt MIR-31 påvises nivåer (fig. 4A). Disse nivåene varierte, men var betydelig høy i noen av de undersøkte tumorer (Fig. 4A). Disse viste seg å være noe høyere i store cellekreft og noe lavere i adenokarsinomer (fig. 4A). Blant de undersøkte adenokarsinomer, ekspresjonen av MIR-31 var lavere i dårlig differensiert karsinom (fig. 4B og 4C), samt i den faste undertype (fig. 4D). Alvorlig skade på vev fulgt av regenerative reaksjoner ble observert i ikke-tumorøse vev som uttrykker MIR-31 (ikke vist).
MiR-31 nivåer ble evaluert i primærlungesvulster og den tilsvarende lunge ikke-tumorvevet. Kopi antall MIR-31 og U6 snRNA ble målt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Tekniske replikater ble utført in triplo. Midlene og standardavvik (feilfelt) fra Mir-31 nivåer normaliserte til de av U6 snRNA er vist som resultatene oppnådd fra alle svulster (A) og de av ADC (B). Signifikante forskjeller i gjennomsnitts Mir-31 nivåer i adenokarsinomer mellom de ulike histologiske karakterer (9 godt differensiert karsinom (TWA), 3 moderat differensierte karsinomer (MOD), 8 dårlig differensierte karsinomer (POR)) og undergrupper (8 bronchioloalveolar karsinom (BAC) ; 3 acinar karsinom (ACN), 8 fast karsinom (SOL) (en papillær karsinom (= vel skille carcinom) ble ekskludert fra en statistisk analyse) ble analysert med en enveis ANOVA De gjennomsnitt og standardavvik (feilfelt) av. histologiske karakterer (C) og undergrupper (D) er presentert.
in situ
hybridisering analyse for MIR-31 på vevssnitt bekreftet at Mir-31 ble uttrykt i neoplastiske celler og også avdekket at det også variert mellom neoplastiske celler selv i samme tumor (fig. 5). Regenerative epitelceller, interstitiell celler, og betennelsesceller også uttrykt MIR-31 på ulike nivåer (fig. 5).
en sonde bestående av det forvrengte tilfeldig sekvens tjente som en negativ kontroll (bunnplater). Representative fotografier fra tumorous (venstre to paneler) og ikke-tumorous vev (høyre to paneler), som uttrykte MIR-31 (i midten to paneler) eller ikke (side to paneler), blir presentert.
Status for MIR-31 vert genet locus i grunnskolen lungekreft
FISH analyse avdekket at Mir-31 vert genet locus gikk tapt i de neoplastiske cellene i noen svulster, som signalet tellingen fra MIR-31 locus var lavere enn det fra cent av kromosom 9 (fig. 6A). Genet dosering av MIR-31 locus beregnet ved forholdet mellom MIR-31 /sentromerer i adenokarsinomer og squamous cell carcinoma var noe lavere enn i ikke-kreft bronkiale epitel (fig. 6B). Men i enkelte svulster i stor celle karsinom Mir-31 locus ble forsterket (Fig. 6C). Genet doseringen var betydelig høyere i store cellekreft enn i ikke-kreft epitel og andre histologiske typer (Fig. 6C, tabell 2). Alle tumorer med en forsterkning av genet locus, som ble availably undersøkt uttrykte et høyt nivå av den mir-31 transkripsjon. I motsetning til dette, blant adenokarsinomer, genet dosering videre en tendens til å være lavere i mer aggressive tumorer (dårlig differensierte tumorer eller faste tumorer subtype) (tabell 2).
Representative resultater fra tumor og ikke-tumorøse vev er presentert, og grønne og røde signaler som indikerer den MIR-31-locus og cent locus av kromosom 9, henholdsvis (A). Signalet tellingen fra MIR-31 locus normalisert til at fra cent locus av kromosom 9 ble bestemt som FISH poengsum. De FISH score målt presenteres (B). De gjennomsnittlige score i ikke-tumorous bronkial epitel og i de ulike histologiske typer lungekreft presenteres (C). Forskjeller i gjennomsnittsskår ble analysert med en enveis ANOVAs test. P-verdiene er angitt. BEC, bronkiale epitelceller (ikke-kreft-celler); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle karsinom.
Diskusjoner
En innledende studie på brystkreft antydet at Mir-31 kan være en svulst suppressor, som hemmet invasiv og metastatisk spredning av neoplastiske celler [23]. Andre studier har støttet denne innledende funn og avslørte potensielle molekylære mekanismene bak hvordan Mir-31 omgår invasjon og metastasering [24]. MiR-31 ble også vist å bli nedregulert i mage cancer og ble foreslått for å fungere som en tumor suppressor [25]. I kontrast, ble Mir-31 funnet å være oppregulert i kolorektal kreft, og ble foreslått for å fremme invasiv og metastatisk spredning av neoplastiske celler [26], [27]. Således kan potensielle rolle MIR-31 i karsinogenese varierer blant de forskjellige typer kreft. I lungekreft, har ekspresjonen av MIR-31 vanligvis blitt rapportert å være høyere hos svulstvev enn i tilsvarende ikke-tumorvevet [6] – [12]. Våre resultater fra kvantitativ RT-PCR-analyse, hvor flere primære lungesvulster ble vist sterkt uttrykke MIR-31, så ut til å være i samsvar med tidligere funn [6], [7], [9] – [12]. FISH-analyse viste at amplifikasjon i verten gen locus kunne være en av mekanismene som er ansvarlige for den sterke ekspresjon av MIR-31. En fersk studie viste en prognostisk verdi av MIR-31, som det høyeste uttrykk for MIR-31 var assosiert med dårligere utfall i lunge kreft [13], og foreslo også sin onkogen rolle gjennom
in vitro
eksperimenter [ ,,,0],1. 3]. Tatt sammen med disse funnene, ble Mir-31 foreslått å fremme kreftutvikling, særlig av store karsinomer. I motsetning til dette ble MIR-31 ekspresjon betydelig redusert eller helt fraværende i noen lungekreft cellelinjer. Videre nivåene varierte i grunnskolen lungesvulster. Noen svulster uttrykt MIR-31 på lavere nivåer enn det tilsvarende ikke-tumorous vev, mens andre svulster ikke uttrykke det i det hele tatt. Blant de adenokarsinomer undersøkt, genet doseringen var noe lavere i mer aggressive svulster (dårlig differensierte eller faste subtype svulster). Disse resultatene antydet at MIR-31 kan spille en rolle i den undertrykkende karsinogenese adenocarcinomer. Således kan MIR-31 spiller en pleiotropisk rolle i utviklingen av lunge cancer av forskjellig histologiske typer. Uttrykket av noen kjente mål av MIR-31, som ITGA5, MMP16, og RHOA [28], ble preliminært undersøkt i MIR-31-transfekterte celler og lungekreft celler (Figur S3). Men den tvunget uttrykk for MIR-31 ikke redusere mRNA nivåene av disse molekylene. I innfødte lungekreftcellelinjer, ble det observert noen sammenheng mellom nivået av disse molekylene og MIR-31 nivåer mellom ulike histologiske typer (Figur S3). Mål av MIR-31 kan variere i ulike situasjoner, og kompleks crosstalk mellom målene kan ligge skjult i lungekreftceller. Videre studier at omfattende undersøke nedstrøms mål er garantert for å belyse potensialet molekylære mekanismen bak hvordan Mir-31 fremmer kreftutvikling av ulike histologiske typer lungekreft.
Ikke-tumorvevet stiller alvorlige skader og betennelser sterkt uttrykt MIR-31.
In situ
hybridisering analyse bekreftet også sterkt uttrykk av MIR-31 i regenererende ikke-neoplastiske epitelceller og mesenchymale celler. Således kan MIR-31 bli indusert av stimuli som fremmer cellevekst i respons til vevsskade og kan styre regenerative reaksjoner. Den endrede ekspresjon av MIR-31, om det er nedregulert eller oppregulering, kan resultere i et avbrudd i den cellulære homøostase, og kan også delta i neoplastisk transformasjon.
En analyse av status av genet locus vist at homozygot sletting av Mir-31 genet locus var en årsak til tapet av sitt uttrykk i lungekreftcellelinjer. Men noen cellelinjer som beholdt Mir-31 genet locus også alvorlig svekket sitt uttrykk. Tidligere studier har rapportert at hypermethylation av DNA eller histone i arrangøren locus av Mir-31 vert genet var årsaken til den alvorlige nedregulering av MIR-31 i bryst kreft [21] eller voksen T-celle leukemi [29]. Men, våre resultater fra forsøket ved hjelp hemmere for DNA metyltransferase og histondeacetylase ikke støtter involvering av epigenetisk modifikasjon i demping av MIR-31 uttrykk. Metylering spesifikke PCR og bisulfate sekvense analyser også unnlatt å demonstrere en utløsende forhold mellom DNA hypermethylation av promoteren og slike alvorlige demping. En mulig mekanisme annet enn epigenetisk modifikasjon er sannsynlig å bli involvert i nedregulering av MIR-31 uttrykk. Den antatte promoter locus av Mir-31 vert genet inneholder flere CCAAT forsterkerelementer [30]. CCAAT element bindende protein (C /EBP) -β ble funnet å indusere MIR-31-ekspresjon i luftveis epithelia i respons til visse eksterne stimuli [30]. C /EBP-α ble vist å være sterkt nedregulert i lunge kreft [31] – [34], og kan være årsaken til den uordnede uttrykk for MIR-31. En undersøkelse om mulig involvering av C /EBP familie i demping av MIR-31 uttrykk i lungekreft er berettiget. I mellomtiden, ikke-kreft udødeliggjorte airway epithelial cellelinjer transformert med SV40 stort T-antigen (NHBE-T, HPL1D, og HPL1A), hvor p53 og RB-mediert veier er inaktivert, ble funnet å uttrykke MIR-31 markert lavere nivå enn små luftveier epitelceller (SAEC) og bronkiale epitelceller (NHBE). Dette virusantigen kan direkte og indirekte modulere uttrykk for MIR-31.
I sammendraget, resultatene av denne studien tyder på at en endret uttrykk for MIR-31 på grunn av enten forsterkning eller tap av sin vert genet locus kan delta i lunge kreftutvikling. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien å beskrive potensialet utløsende mekanisme underliggende endret uttrykk av MIR-31 i lunge kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Kopi antall la-7i og U6 snRNA ble målt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. La-7i-nivåer ble normalisert til U6 snRNA nivåer. AEC, luftveis-epitelceller (ikke-cancerøse celler); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle carcinoma celle; . SCC, småcellet karsinom
doi: 10,1371 /journal.pone.0100581.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Biologisk effekt av restaureringen av MIR-31 på en lungekreft cellelinje (LC2AD) er presentert. Den pro-retrovirus vektor pLHCX (BD Clontech) bærer DNA-fragmenter inkludert Mir-31 kodende region (MIMAT0000089) flankerer om en 100 basepar margin i begge retninger, ble oppnådd. De retrovirusvektorer (tom vektor (mock), den senstråden av MIR-31 (SS), og antisense-tråden av MIR-31 (AS)) ble infisert som samme metode som tidligere er beskrevet [17]. Etter en kort utvalg med Hygromycin B (BD Clontech), ble de overlevende cellene høstet og tellet, og 2,0 x 10
4 ble gjen sådd ut på en 10 cm plate. Etter 15 dager, ble cellene metanolfiksert og Giemsa-farget (A). Den middelverdi og standardavvik (feilfelt) av kolonitellinger fra triplikate eksperimenter er presentert (B). Celler utvalgte ble dyrket og passert flere ganger. Kumulerte populasjonsdoblinger presenteres (C). Celler høstes umiddelbart etter utvelgelsesprosessen ble kontrollert for ekspresjon av MIR-31 og U6 snRNA ved kvantitativ RT-PCR. Nivået på MIR-31 normalisert til at av U6 snRNA presenteres (D)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0100581.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Kopi antall ITGA5, RHOA, MMP-16, og GAPDH mRNA ble målt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. ITGA5 (A), er RHOA (B) og MMP-16 (C) nivåer normalisert til GAPDH-nivåer vist. AEC, luftveis-epitelceller (ikke-cancerøse celler); TRAS, LC2AD lungekreft-cellelinje – basert transfektanter (tom vektor (MOCK), den senstråden av MIR-31 (SS), og antisense-tråden av MIR-31 (AS)); ADC, adenokarsinom; SQC, plateepitelkarsinom; LCC, stor celle carcinoma celle; SCC, småcellet karsinom
doi:. 10,1371 /journal.pone.0100581.s003 plakater (TIF)
Takk
Vi vil spesielt takke Emi HONDA og Misa Otara (Kanagawa prefekturs kardiovaskulær og respiratorisk Center Hospital, Yokohama, Japan) for deres hjelp.
