Abstract
Bakgrunn
Epigenetikk er definert som arvelige endringer i genuttrykk som ikke er basert på endringer i DNA-sekvensen. Posttranslasjonell modifikasjon av histonproteinene er en viktig mekanisme for regulering epigenetisk. Den kinase PRK1 (proteinkinase C relaterte kinase 1, også kjent som PKN1) fosforylerer histon H3 treonin 11 og er involvert i reguleringen av androgen-reseptor-signalisering. Derfor har det blitt identifisert som en roman narkotika mål, men lite er kjent om PRK1 hemmere og konsekvensene av sin hemming.
Metodikk /Principal Finne
Ved hjelp av en fokusert bibliotek screening tilnærming, vi identifisert klinisk kandidat lestaurtinib (også kjent som CEP-701) som en ny inhibitor av PRK1. Basert på en generert 3D-modell av PRK1 kinase ved hjelp av homolog PKC-theta (proteinkinase c theta) protein som et templat, ble styrings interaksjonen av lestaurtinib med PRK1 analysert ved hjelp av molekylær tilkoblings studier. Videre ble virkningene på histon H3 treonin fosforylering og androgen-avhengige genuttrykk evaluert i prostatakreftceller.
Konklusjon /Betydning
Lestaurtinib hemmer PRK1 svært potent in vitro og in vivo. Anvendt til cellekultur hemmer histon H3 treonin fosforylering og androgen-avhengige genuttrykk, en funksjon som ikke er kjent ennå. Således våre funn har implikasjoner både for forståelse av den kliniske aktivitet av lestaurtinib samt for fremtidig PRK1 inhibitorer
relasjon:. Köhler J, Erlenkamp G, Eberlin A, Rumpf T, Slynko I, Metzger E, et al . (2012) Lestaurtinib hemmer Histone Fosforylering og androgen-avhengige genuttrykk i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (4): e34973. doi: 10,1371 /journal.pone.0034973
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 9 februar 2012; Godkjent: 10 mars 2012; Publisert: 20 april 2012
Copyright: © 2012 Köhler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetikk er definert som arvbare endringer i genregulering som bestemmes ikke av endringer i genomet [1]. Epigenetiske prosesser har klare implikasjoner for patologi av menneskelig sykdom [2], og dermed nye hemmere av disse er svært interessant for medisiner [3]. Blant ulike histonmodifikasjonene [4], er fosforylering av histoner ikke så godt studert, spesielt med hensyn til medisiner. De fleste rapporter er på Aurora-kinaser som er involvert i stedet for i kontroll av mitose [5]. En annen kinase involvert i mitosen som opptrer på histoner er haspin [6], [7]. De kinaser PKC-betaI [8] og PRK1
en (også betegnet PKN1) [9] spiller viktige roller i å aktivere gentranskripsjon [10] i løpet av androgen-reseptor-signalisering og PRK1 regnes for å være et lovende mål for behandling av prostatakreft. I jakten på nye PRK1 hemmere utførte vi en fokusert bibliotek screening for å identifisere nye hits og vurdere henvisning kinase hemmere i sammenligning. Vi identifiserte den kliniske kandidat lestaurtinib (også kjent som CEP-701) som en ny potent hemmer av epigenetisk kinase PRK1.
Resultater
Fokusert Bibliotek Screening
Som et utgangspunkt punkt for leting etter nye PRK1 hemmere, vi brukte Biomol kinase og fosfatase inhibitor bibliotek (n = 84, se figur S4, S5 og S6) for en innledende screening på 100 nM terskel konsentrasjon. Dette screening identifisert bare bisindolyl-maleimide (BIM) Ro318220 og strukturelt beslektet staurosporin som treff (mer enn 40% binding i forhold til staurosporin på 100 nM) (se figur 1 og tabell 1). Ro318220 allerede var kjent for å hemme PRK1 [9]. Vi videre vist en 200 sammensatt internt bibliotek av kommersielt tilgjengelig og generisk kinase hemmere, resp. hemmer kandidater. Disse inkluderte standard kinase hemmere som erlotinib, lapatinib, vatalanib, SB203580 og SB216763 (se figur 1), som er blitt brukt for å profilere ulike kinaser før. Inhibitorene K252a og lestaurtinib og i tillegg SB216763 (interaksjons data ikke vist) ble valgt for forankrings studie basert på deres strukturelle likheter med staurosporin og Ro318220. De staurosporin analoger alle viser en lignende bindingsmodell. K252a hemmer trkA, VEGFR2 og MLK1 i tosifret nM regionen og er kjent for å ha en selektivitet i løpet av PKC om 10-20fold [11]. Lestaurtinib ble rapportert å hemme trkA, B og C, [12], JAK [13] og FLT3. På grunn av hemmingen av FLT3, blir det undersøkt klinisk i myelofibrose og AML [14], [15]. Lestaurtinib og K252a ble begge bundet av PRK1 med høy affinitet (se tabell 1). Lestaurtinib ble valgt for videre biologisk evaluering i vår studie på grunn av sin avanserte utvikling status og viste hemming av androgen genet responsive gentranskripsjon.
Molekylær modellering
En modell av menneskelig protein C relatert kinase 1 (PRK1) ble generert av homologi modellering for å effektivisere våre funn for videre optimalisering studier. Modellen er basert på likheten av PRK1 til proteinkinase C-theta (PKC-theta) og ble brukt for tilkoblings studier. Siden de tilgjengelige krystallstrukturer av PKC-undertyper i kompleks med inhibitorer viser alle de aktive kinase konformasjon, representerer PRK1 modellen også den aktive konformasjon med den klassiske DFG-i motiv (figur 2) [16]. De 84 Forbindelsene ifølge Biomol kinase inhibitor bibliotek, som ble testet i in vitro-analysen, ble forankret i det ATP-bindende lomme av PRK1. Vi brukte tre forskjellige tilkoblingsmetoder (GOLD [17], glir [18] og Paradocks [19]) og fem ulike scorings funksjoner (ChemScore, GoldScore, GlideScore, Paradocks p-Score og ORANSJE GBSA poengsum [20], [21]) . Totalt kan 63 forbindelsene bli vellykket forankret i ATP-bindende lommen. Generelt er de forskjellige tilkoblings metoder ga lignende resultater selv om rangeringen av forbindelsene ble funnet å være forskjellige (Tabell S1). De to aktive hemmere fra Biomol sammensatt samling, staurosporin og Ro318220, var topprangerte av noen av poeng funksjoner. Vanligvis, i docking og virtuelle screeningstudier en bedre diskriminering mellom aktive og lokkeduer er observert ved hjelp av en konsensus poengsum basert på en rekke forskjellige scoring metoder [22], [23]. I denne studien har vi også beregnet en konsensus poengsum ved hjelp av fem normaliserte scoring funksjoner Chemscore, Goldscore, Glidescore, Paradocks p-score og GBSA poengsum. Ved hjelp av konsensus anledninger, en klar diskriminering mellom den meget aktive inhibitorer staurosporin (Resultat 9,23) og Ro318220 (Score 9,51) og inaktive forbindelser (inkludert de inaktive kinaseinhibitorer som er vist på figur 1) kunne oppnås. Den eneste molekyl som ga en tilsvarende høy score ble relatert Bisindolylmaleimide derivatet 31 (Poeng fra 8,84, Tabell S1, figur S5) som ikke viser noen in-vitro-aktivitet under 100 nM (data ikke vist).
den molekylære overflaten av bindingslommen er vist. Foruten de hydrogenbindinger med hengslet regionen, proton aminogruppen av staurosporin donerer hydrogenbindinger (vist som oransje stiplede linjer) til Asp744 og et konservert vannmolekyl (vist i rødt).
docking arrangement av staurosporin i det aktive sete av PRK1 viser at liganden er fullstendig begravet i ATP-bindingslommen (figur 2). Høyst betydelig, lactame og maleimidgrupper av staurosporin og Ro318220 henholdsvis skjema to hydrogenbindinger til Glu696 og Ser698, som er en del av hengsel regionen PRK1 (figur 3A og 3D). Van-der-Waals-interaksjoner observeres med gatekeeperen rest Met695, så vel som med Val629, Phe626, Leu747, og Phe904, respektivt. Dessuten kan hydrogenbindinger mellom den protonerte aminogruppe av staurosporin, så vel som tioureagruppen av Ro318220 og Asp744 holdes. Aminogruppen i staurosporin er også involvert i en hydrogenbinding med en konservert vannmolekyl og ryggraden CO av Asp744.
Vanlige interaksjoner av hemmere er hydrogenbindinger som involverer Glu696 og Ser698 av hengslene regionen, og van- der-Waals interaksjoner med gatekeeper rester Met695, så vel som med Val629, Phe626, Leu747, og Phe904. I tillegg har noen av inhibitorene samhandler med Asp744, Asn745 og en konservert vannmolekyl (rød kule) i nærheten av Mg
2+ bindingssete av kinase. Ryggraden er vist som en lilla sløyfe. Kun relevante aminosyrer er vist. Hydrogenbindinger er vist som stiplede oransje fargede linjer.
Analysen av tilkoblings positurer av K252a og lestaurtinib viste at begge forbindelser samhandle på samme måte med ATP bindende lommer som staurosporin (figur 3B og 3C ). I tillegg til samspillet med hengsel regionen, de polare substituenter på tetrahydrofuran ringsystemet samhandle med en konservert vannmolekyl bundet på Asp744 og Asn745.
Cellular Testing
Vi analyserte deretter effekten av lestaurtinib på androgen responsiv LNCaP prostatakreftceller (se figur 4) [24]. En effekt på androgen-reseptor-mediert signalisering ble målt ved hjelp av kvantifisering av mRNA-ekspresjon av flere kjente androgen-reseptor målgener. Lestaurtinib blokkerer ekspresjon av transmembran-protease, serin 2 (
TMPRSS2) product: [25], insulin-lignende vekstfaktor-1 (
IGF1-K27) product: [25], CXC kjemokinreseptor 4 (
CXCR429) product: [26], Homeobox protein Nkx-3,1 (
NKX3.1) product: [27], mannlig bakterie celle-assosiert kinase
(MAK30) product: [28] , musculoaponeurotic fibrosarkom onkogen homolog (
MAF) product: [
29
], kjernekraft reseptorunderfamilien 4, gruppe A, medlem 1 (
N4A1) product: [29], Gene regulert i brystkreft i
(GREB1) product: [30] og FK506 bindende protein 5 (
FKBP5) product: [31] på 5 mikrometer, men reduserer ikke uttrykk for androgen-uavhengig glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH)
genet [31]. I det samme området med konsentrasjon, lestaurtinib forårsaket en hypofosforylering på histon H3 treonin 11 (figur S7).
Uttrykk av androgen reseptor målgener
TMPRSS2
,
IGF1-R
NKX3.1
,
CXCR4
,
MAK
,
MAF
,
N4A1
,
GREB1
og
FKBP5
målt ved QRT-PCR i androgen (R1881) stimulert LNCaP prostata kreft celler er senket ved behandling med lestaurtinib (endelig konsentrasjon 5 mikrometer). MRNA-ekspresjon av
GAPDH
-genet ble anvendt som en kontroll. Barer representerer gjennomsnittet + SD (n = 5). P-verdi: ns = ikke signifikant; * = 0,05; ** 0,01; ***. 0,001
Diskusjoner
histonmodifikasjonene har blitt et fokus for legemiddel innsats. Hemmere av enzymer som etablerer disse modifikasjonene er også verdifulle verktøy å sondere signalveier. Vi identifiserte klinisk kandidat lestaurtinib som en inhibitor av den kinase PRK1 som påvirker epigenetisk regulering og androgen receptor signalering. Denne nye virknings lestaurtinib har ikke vært kjent hittil, og kan være viktig for å forstå dens aktivitet i kliniske omgivelser. De strukturelle likheter av lestaurtinib i forhold til staurosporin gjøre det mulig at andre kinaser enn PRK1 kan bidra til de observerte genet regulerende effekter i LNCaP-celler. Ikke desto mindre er det av stor betydning at lestaurtinib har en virkning på epigenetiske histonmodifikasjonene og reduserer androgen-avhengig genekspresjon i betydelig grad i prostatakreftceller. Dette faktum bør tas i betraktning for fremtidige vurderinger i kliniske settinger.
I tillegg til de in vivo effekter av lestaurtinib, identifisering av lestaurtinib og K252a som nye PRK1 hemmere og mangel på hemming av etablerte kinase hemmere med stillasene som anilinokinazolinene, anilinophthalazines eller diarylimidazoles gir verdifull informasjon for utformingen av ytterligere og mer selektiv PRK1 hemmere som potensielle legemiddelselskap for androgen-avhengige kreftformer.
Materialer og metoder
Kinase Assay
Kinase-inhibitorer ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Lestaurtinib) og Biomol (Ro318220) og anvendt som oppnådd. Renhet var 93% (vekt /vekt) i alle tilfeller, som angitt av leverandøren. Inhibitor screening ble utført med LanthaScreen ™ Eu kinase Binding Assay Kit (Invitrogen) med endelige analyse konsentrasjoner på 5 nM for PRK1 (Proqinase, Freiburg), 2 nM LanthaScreen Eu-anti-GST antistoff (Invitrogen) og 10 nM Kinase Tracer 236 (Invitrogen). Analysen ble utført i 384-brønners mikrotiterplater (Perkin Elmer, Rodgau). Det endelige analysevolumet var 15 ul. Deteksjon ble utført med seg 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer, Rodgau, Eksitasjon: 340 nm, 1
st Emisjon: 665 nm, to
nd Emisjon: 615 nm, Delay Time 100 ms, Integrasjon Tid 200 ms). Kinase inhibitor bibliotek ble kjøpt fra Biomol (akademisk størrelse, n = 84 – tidligere CAT # 2831A, Figur S4, S5, S6). IC
50 bestemmelser ble utført tre uavhengige ganger, hver i tre paralleller.
beregningsmetoder
Al0l beregninger ble utført på en Pentium IV 2,2 GHz basert Linux-klynge. Siden krystallstrukturen til human PRK1 kinase (Uniprot entry Q16512) ikke er kjent, ble en homologi modell generert. En BLASTP søk [32] ble utført i den humane PRK1 aminosyresekvens. Den høyeste likheten ble funnet for den relaterte kinase PKCtheta. Den generelle sekvensidentitet mellom den humane PRK1-sekvensen og sekvensen avledet fra PKC-theta er 49% med bare små hull eller innsettinger i den innrettede regionen. Sekvensen justering ble gjort med ClustalW [33] (fig S1). Modellen ble generert med programmet Modeller hjelp av koordinatene til PKC-theta X-ray struktur 2jed (Resolution 2.32 Å) i den aktive konformasjon. Superimposition av PRK1 modellen og PKC-theta X-ray struktur ga en RMSD verdi på 0,73 Å for ryggraden atomer som illustrerer den høye strukturelle likheten av begge kinaser. Den stereokjemiske kvaliteten av den resulterende PRK1 modellen ble analysert ved anvendelse av programmet PROCHECK [34]. Hydrogenatomer og Amber delvis kostnader ble tildelt. Modellen var energi minimert ved hjelp av AMBER kraftfelt [35]. Avgrensningen førte til en modell med god stereokvalitet med 90,1% av phi og psi vinkelverdiene i de mest favoriserte regionene, og 8,5% i tillegg tillatt regioner (Figur S2). Ingen rester i modellen ligger i underkjent regionen.
Ligand Docking
Vi brukte tre forskjellige tilkoblingsprogrammer (GOLD 4.1 [17], glir [18] og Paradocks [19]) til forankre alle molekyler inn i PRK1 ATP-bindingssetet. For alle docking kjører standardinnstillingene for programmet ble brukt. Bindingssete for PRK1 ble definert på Glu696 med en radius på 15 Å dekke ATP bindende lommen. En konservert vannmolekyl observert i røntgenstrukturer av PKCbeta og PKCtheta ble ansett for å være en del av proteinet. Goldscore, Chemscore, Glidescore, Paradocks p-Score og ORANSJE GBSA [20], [35] poengsum ble valgt som treningsfunksjoner. For hvert molekyl ble 30 tilkoblings løper utført. De resulterende oppløsninger ble gruppert på grunnlag av de tunge atom RMSD-verdier (1 A). Først testet vi om tilkoblings programmer er i stand til å reprodusere bindingen modus for de bundne ligander NVP-XAA228, Biomol 33 (Ro318220), og staurosporin som observert i X-ray strukturer av PKC-theta og PKC-beta, henholdsvis ( PDB koder 2jed.pdb, 1xjd.pdb [36] og 1i0e.pdb [37]). Høyeste nøyaktighet ble innhentet ved hjelp av GOLD program og Goldscore som fitness-funksjon. De RMSD verdier mellom topprangerte Goldscore dokking oppløsning og krystallstrukturen av inhibitorene er 0,78 Å, 0,71 Å og 0,49 Å (tunge atomer) henholdsvis, og dette demonstrerer brukbarheten av de anvendte docking programmene for gjengivelse av den eksperimentelt bestemte strukturer av kinase inhibitor komplekser.
molekylær dynamikk simuleringer
stabiliteten til avledet PRK1-hemmerkomplekser ble undersøkt ved hjelp av molekylære dynamikk (MD) simuleringer. Den mest aktive inhibitor staurosporin ble anvendt for denne simuleringen. MD simuleringer ble utført ved anvendelse av AMBER 10 og AMBER-kraftfeltet 1999 [38], [39]. De ligand kraftfelt parametre ble tatt fra den generelle Amber kraftfelt (klepp), mens AM1 ESP atom delvis kostnader ble tildelt den hemmer. Kompleksene ble dynket i en eske TIP3P vannmolekyler med en margin på 10 Å. Før de frie MD simuleringer, ble to trinn med avslapning utført; i første trinn, holdt vi proteinet fast med en begrensning på 500 kcal mol
-1Å
1. I det andre trinnet ble de hemmer strukturene avslappet i 0,5 ps, hvorunder proteinatomer ble behersket til røntgen-koordinater med en fjærkonstant på 500 kcal mol
-1Å
-1. I det siste trinnet, ble alle begrensninger fjernet og kompleksene ble avslappet for en ps. Temperaturen av den avslappede systemet ble deretter ekvilibrert ved 300 K til 20 ps av MD å bruke 2 fs tidssteg. En konstant volum periodisk grense ble satt til å ekvilibrere temperaturen til systemet ved de Langevin dynamikk [40] med en kollisjonsfrekvens på 10 ps
-1 og en hastighetsgrense på 5 temperatur enheter. Under temperaturstabilisering rutine, ble komplekset i løsemiddel boksen behersket til de opprinnelige koordinatene med en svak kraft konstant på 10 kcal mol
-1Å
1. De endelige koordinater for temperaturstabilisering rutine (etter 20 ps) ble deretter anvendt til å fullføre en 1 ns molekylær dynamikk rutinemessig ved hjelp 2. fs tidstrinn, hvorunder temperaturen ble holdt ved 300 K ved Langevin dynamikken ved hjelp av en kollisjonsfrekvens av en ps
1 og en hastighetsgrense på 20 temperaturenheter. Trykket i den solvatiserte Systemet ble bragt til likevekt ved 1 bar ved en bestemt tetthet i et konstant trykk periodisk grense ved et isotropt trykk skalering metode som anvender et trykk relaksasjonstid av 2 ps. Tiden trinnet av de frie MD simuleringene var 2 fs med en cutoff av 9 Å for ikke-limt interaksjon, og rist [41] ble ansatt for å holde alle obligasjoner som involverer hydrogenatomer stiv. Elektrostatiske interaksjoner ble beregnet ved hjelp av partikkel Mesh Ewald metoden [42]. MD simulering av PRK1-staurosporin komplekset ble utført totalt for 10 ns. Den RMSD Tomten er vist i Figur S3.
Database
3D-strukturer av BIOMOL forbindelser (Figur S4, S5, S6) ble generert ved hjelp av Omega-programmet (OpenEye Software). Alle mulige isomerer og tautomerer ble samlet, noe som resulterte i 265 3D-strukturer. Alle generert isomerer ble brukt for docking studien.
AMBER GBSA Scoring
kai positurer var energi minimert ved hjelp av AMBER kraftfelt og GBSA kontinuum modellen [21]. For hvert molekyl best score positur ble valgt for sammenligning med de biologiske data. Minimering ble utført ved hjelp av en kombinasjon av bratteste nedstigningen og konjugat gradientalgoritme med et kvadratisk middel av gradient på 0,001 kcal /mol. AM1-BCC kostnader ble tildelt for hemmere, og Amber99 kraftfelt ble søkt om proteinet. Den ikke-bundne cutoff ble satt til 16 Å. Alle tunge atomer av proteinet ble bundet med en fjærkonstant på 100 kcal /mol, mens inhibitor atomer ble avslappet i løpet av energi minimalisering prosessen. Bindingen fri energi Δ
G
beregnes som: hvor Δ
E
MM er forskjellen i energi mellom det komplekse og summen av energiene for gratis ligand og gratis protein , Δ
G
SOLV er forskjellen i GBSA oppløsnings energi av komplekset og summen av samle energier gratis ligand og gratis protein, og Δ
G
SA er forskjellen i overflatearealet energi av komplekset og summen av overflatearealet energiene for fri ligand og fritt protein.
RT-qPCR-analyse
Påvirkning av androgen-reseptor-målgener var bestemmes ved hjelp av sanntids kvantitativ PCR. LNCaP-celler ble vasket en gang med PBS og deretter sultet i 24 timer i fenol-rød-fri RPMI1640 supplementert med 0,5% dobbelt-strippet føtalt kalveserum (dsFCS). Celler ble deretter behandlet eller ikke med lestaurtinib (sluttkonsentrasjon 5 uM) som angitt. Dersom cellene ikke ble behandlet med lestaurtinib, ble DMSO tilsatt som en bærer. 10 minutter etter at lestaurtinib eller kjøretøyet, ble celler behandlet over natten med eller uten R1881 (10
-9 M) som angitt. DNaseI-behandlede RNA, isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen), ble brukt for revers transkripsjon. Kvantitativ PCR ble utført i en LightCycler 480 (Roche). Produktdannelse ble detektert ved inkorporering av SYBR grønn I ved hjelp av ROX som en passiv referanse (ABgene). For QRT-PCR, ble de følgende primere anvendt:
TMPRSS2 product: [25] 5′-TCACACCAGCCATGATCTGT-3 «og 5′-CTGTCACCCTGGCAAGAATC-3»;
IGF1-R product: [25] 5′-CTGTATGCCTCTGTGAACC-3 «og 5′-TAGACCATCCCAAACGAC-3»;
NKX3.1 product: [27] 5′-AGAACGACCAGCTGAGCAC-3 «og 5′-AAGACCCCAAGTGCCTTTCT-3»;
CXCR4 product: [26] 5′-CTGTGAGCAGAGGGTCCAG-3 «og 5′-ATGAATGTCCACCTCGCTTT-3»;
MAK product: [28] 5′-TGGACTTGCAAGAGAATTAAGGT-3 «og 5′-CTTCAGGGGCACGATACC-3»;
MAF product: [29] 5′-AGCGGCTTCCGAGAAAAC-3 «og 5′-GCGAGTGGGCTCAGTTATG-3»;
N4A1 product: [29] 5′-ACAGCTTGCTTGTCGATGTC-3 «og 5′-GGTTCTGCAGCTCCTCCAC-3»;
GREB1 product: [30] 5′-AAGCTGAGCAGCACAGACAA-3 «og 5′-GGCTTCTCTTCTCCGAGGTAG-3»;
FKBP5 product: [31] 5′-TTTTTGAGATTGAGCTCCTTGA-3 «og 5′- TTGTGTTCACCTTTGCCAAC-3»;
GAPDH product: [31] 5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3 «og 5′-GTTCACACCCATGACGAACA-3». Barer representerer gjennomsnittet + SD (n = 5). P-verdi: ns = ikke signifikant; * = 0,05; ** 0,01; *** . 0,001
Western Blot analyse
LNCaP human prostata adenokarsinom-celler ble dyrket i RPMI1640 medium (PAA) som inneholdt bovint føtalt (PAA) 10% (v /v), penicillin (PAA) 1% (v /v), streptomycin (PAA) 1% (v /v), L-glutamin (PAA) 1% (v /v) ved 37 ° C og 5% CO
2. 2.5 * 10
6-celler ble sådd ut i vev kulturskåler (10 cm) og inkubert i RPMI1640 medium (PAA) inneholdende trekull strippet føtalt kalveserum (PAA) 10% (v /v), penicillin (PAA) 1% ( v /v), streptomycin (PAA) 1% (v /v), L-glutamin (PAA) 1% (v /v). 24 timer etter utsåing lestaurtinib eller Ro318220 (sluttkonsentrasjon i hvert tilfelle 4,5 mM) oppløst i vekstmedium (trekull strippet bovint serum 10% (v /v), penicillin 1% (v /v), streptomycin 1% (v /v) , L-glutamin 1% (v /v), DMSO 1% (v /v), dihydrotestesterone 0,1 nM) ble tilsatt og inkubert i 18 timer. LNCaP-celler inkubert med DMSO (1% (v /v)) ble anvendt som en kontroll. Etter inhibitor behandling, ble cellene vasket en gang med iskald PBS, lysert med kjerner isolasjon buffer (Sukrose 250 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, IGEPAL-CA 630 0,1% (v /v), CaCl
2 0,2 mM, MgCl
2 1,5 mM, DTT 1 mM, pepstatin 1fiM, proteasehemmer Cocktail Mix (Sigma), PhosStop® (Roche), pH 8,0). Histoner ble syre hentet (H
2SO
4 0,4 N, DTT 1 mM, pepstatin 1fiM, proteasehemmer Cocktail Mix (Sigma), PhosStop® (Roche)). Over natten
Protein konsentrasjoner av histon ekstraktene ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse (Pierce). 5 ug av proteiner ble separert ved SDS-gelelektroforese (15% polyakrylamid-gel) og overført til en PVDF-membran-Roti® (Roth). Membranen ble deretter blokkert med ikke-fettholdig tørrmelk (Roth, 5% (w /v), TBS, Tween 20 0,1% (v /v)) og probet med anti-H3T11ph (Active Motiv) 1:1000 og anti- H3 (Upstate) 1:5000 som en lasting kontroll. Canon CanoScan LiDE 50 ble brukt til å hente bildet av blot og Adobe Photoshop 5.0 ble brukt til å behandle bildet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Sequence justering mellom PKC-theta (Sbjct) og PRK1 (Query).
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s001 plakater (TIFF)
Figur S2.
PROCHECK analyse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s002 plakater (TIFF)
Figur S3.
RMSD tomt på MD simulering av PRK1-staurosporin kompleks hjelp AMBER10. Den grå linjen representerer RMSD tomten for PRK1 protein Cα-atomer, mens den sorte linjen viser svingningene i inhibitor struktur
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034973.s003 plakater (TIFF)
Figur S4.
Forbindelser fra Biomol bibliotek, Forbindelser 1-30.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s004 plakater (TIFF)
Figur S5.
Forbindelser fra Biomol bibliotek, Forbindelser 31-60.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s005 plakater (TIFF)
Figur S6.
Forbindelser fra Biomol bibliotek, Forbindelser 61-84.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s006 plakater (TIFF)
Figur S7.
Effekter av lestaurtinib og Ro318220 på fosforyleringen av H3T11 i LNCaP-celler etter 18 timer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s007 plakater (TIFF)
Tabell S1.
poengverdier oppnådd for 63 forankret BIOMOL forbindelser og syv mer av de testede kinase inhibitor.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s008 plakater (DOC)
