Abstract
Bakgrunn
Programmert død ligand-en (PD -L1) har blitt identifisert som en faktor assosiert med dårlig prognose i en rekke kreftformer, og ble rapportert å være i hovedsak indusert av PTEN tap i gliomer. Men den kliniske effekten av PD-L1 og regulering av PTEN ennå ikke er bestemt i tykk- og endetarmskreft (CRC). I denne studien, bekreftet vi regulering av PTEN på PD-L1 og videre bestemmes effekten av PTEN på sammenhengen mellom PD-L1 uttrykk og kliniske parametre i CRC.
Metoder /Resultater
RNA interferens tilnærming ble brukt til å ned-regulere PTEN uttrykk i SW480, SW620 og HCT116-celler. Det ble vist at PD-L1 protein, men ikke mRNA, ble betydelig øket i celler transfektert med siRNA PTEN, sammenlignet med den negative kontroll. Videre er kapasiteten til PTEN å regulere PD-L1-ekspresjon ble ikke åpenbart påvirket av IFN γ-, den viktigste induser av PD-L1. Tissue microarray immunhistokjemi ble brukt til å påvise PD-L1 og PTEN i 404 CRC pasientprøver. Overekspresjon av PD-L1 var signifikant korrelert med fjernmetastaser (P 0,001), TNM stadium (P 0,01), metastatisk progresjon (P 0,01) og PTEN uttrykk (P 0,001). Univariat analyse viste at pasienter med høyt PD-L1 uttrykk hadde en dårlig total overlevelse (P 0,001). Imidlertid gjorde multivariat analyse ikke støtte PD-L1 som en selvstendig prognostisk faktor (P = 0,548). Univariate (P 0,001) og multivariat overlevelse (P 0,001) analyse av 310 ligger CRC pasienter viste at høyt nivå av PD-L1 uttrykk var assosiert med økt risiko for metastatisk progresjon. Videre den kliniske effekten av PD-L1 på CRC var ikke statistisk signifikant i en undergruppe av 39 pasienter uten PTEN uttrykk (fjernmetastaser: P = 0,102; TNM stadium: P = 0,634, total overlevelse: P = 0,482).
Konklusjoner
PD-L1 kan brukes til å identifisere CRC pasienter med høy risiko for metastase og dårlig prognose. Denne kliniske manifestasjon kan være delvis forbundet med PTEN uttrykk
Citation. Song M, Chen D, Lu B, Wang C, Zhang J, Huang L, et al. (2013) PTEN Loss Øker PD-L1 Protein Expression og Påvirker Sammenheng mellom PD-L1 Expression og kliniske parametre i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10,1371 /journal.pone.0065821
Redaktør: Jun Sun, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 20 desember 2012; Godkjent: 28 april 2013; Publisert: 13 juni 2013
Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Sun Yat-sen-universitetet «100 Talenter Program»; Guangdong Innovative Research Team Program (2009010058); Science and Information Technology Bureau of Guangzhou, Guangdong (2011J5200009); Guangdong Provincial Department of Science and Technology (2012B050500004); og «985 Project» av Sun Yat-sen-universitetet og Guangdong translasjonell medisin Public Platform (4.202.037). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest største årsaken til kreft dødsfall i vestlige land. Globalt er det den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre vanligste diagnosen kreft hos kvinner [1]. Hva er verre er at dødeligheten av CRC fortsetter å øke i mange land med metastatisk kolorektalcancer (mCRC) er den primære årsaken til død hos de fleste pasientene. Tidlig stadium CRC pasienter hadde en fem-års overlevelse på opp til 90%, men hastigheten kunne slippe til 60% Mengde pasienter med spredning til lymfeknuter, og helt ned til 10% når metastaser er tilstede [2]. Men det er vanskelig å oppdage mCRC på tidlig stadium kun basert på symptomer, noe som fører til komplisert behandling beslutninger, ofte inkludert aggressiv terapi eller behandling helligdager. En biomarkør som kan identifisere pasienter med høy risiko for metastasering og dårlig prognose kunne ha bred kliniske applikasjoner. Studier som søker etter slike biomarkører er rikelig. PD-L1 er en av de store emner av biomarkør forskning.
PD-L1 (også kjent som CD274, B7-H1), en av ligandene for programmert celledød 1 (PD-1), er en immun-hemmende reseptoren hører til CD28 /cytotoksisk T-lymfocytt antigen 4 (CTLA-4) familien. Den kan levere en inhibitorisk signal til PD-1 /B7-1 uttrykkende T-celler, noe som resulterer i immunfunksjon [3], [4]. PD-L1-protein er ofte uttrykt på aktiverte T-celler, B-celler, NK-celler, DCS, makrofager, og benmarg-avledede mastceller [5]. PD-L1 uttrykk er også funnet på et bredt spekter av humane tumorer. I tillegg har studier vedrørende PD-L1 uttrykk for sykdom resultat blitt gjort i de fleste tumorer, og resultatene viser at PD-L1 uttrykk sterkt korrelert med ugunstig prognose i nyre [6], eggstokk [7], blære [8], bryst [9], lever [10], gastrisk [11], og kreft i bukspyttkjertelen [12], men ikke i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [13]. Viktigst av disse studiene viser at høyere ekspresjon av PD-L1 kan lette fremføring av tumorstadium og øke invasjon potensial. Men i CRC, den kliniske effekten av PD-L1 og regulering mekanismen er ennå ikke bestemt.
PD-L1 uttrykk kan være forårsaket av mange inflammatoriske mediatorer og cytokiner, hvorav interferon-γ (IFN γ) er den mest potente. Det har vist seg at både type I og type II IFN oppregulere PD-L1 uttrykk i de fleste kreftcellelinjer. Få studier fokus på regulatoriske rolle PD-L1 i tumorer. Videre disse studiene produserte divergerende resultater. En ny studie viste at tapet av tumor suppressor PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti), kan være en viktig mekanisme som øker PD-L1 ekspresjon i glioma cellelinjer og pasienttumorprøver [14]. PTEN er en viktig tumor-suppressor-gen som først og fremst negativt regulerer celle-overlevelse signale PI3K-proteinkinase B (Akt) pathway [15], [16]. I tillegg akkumulerende studier viste at PTEN kan være en viktig gen som er knyttet til tumor metastase [15], [17], [18]. Både i
vitro Hotell og i
vivo
eksperimenter av CRC viste at PTEN styrer tumorigent og metastatisk potensial. Det er rapportert at injeksjon av PTEN-manglende celler i mus resulterte i mye mer pulmonal og «multi-location» metastaser enn injeksjon av kontrollceller [19]. Videre viser noen kliniske data som tap av påvisning av PTEN ved farging ble forbundet med avansert sykdom, levermetastaser og dårlig pasient overlevelse [20] – [22]. Men noen nyere studier ikke støtter rollen PTEN i reguleringen av PD-L1 uttrykk. Det ble sagt at «PD-L1 uttrykk ble modulert gjennom ulike veier mellom ulike tumorcelletyper» [23].
Det er vel kjent at PD-L1 er et potent negativ regulator av antitumor immunitet, men det er ukjent om dette immun-rømmer effekt er tilstrekkelig til å gjøre PD-L1 en tydelig faktor assosiert med dårlig prognose for alle typer av kreft hos mennesker. Omvendt, PTEN er blitt identifisert som en avgjørende faktor i forskjellige sentrale prosesser for kreftutvikling, og som en viktig gen for kreftdiagnose og prognose. Etter den nylige funn at PD-L1 protein uttrykk korrelert med PTEN tap [14], kom vi til hypotesen om at tumorprogresjon og PD-L1 uttrykk er uavhengig relatert til PTEN tap, og at den kliniske effekten av PD-L1 kan, fall delvis, skyldes korrelasjonen mellom PTEN tap og PD-L1 uttrykk.
i den foreliggende undersøkelse har vi først undersøkt effekten av PTEN tap på PD-L1 ekspresjon i CRC-cellelinjer, og bestemme hvorvidt den observerte effekten opprettholdes i nærvær av IFN-γ. For det andre, vurdert vi foreningen av PD-L1 uttrykk med sykdom utfall og PTEN uttrykk i 404 CRC pasienter med en median oppfølgingstid på 5 år. Til slutt undersøkte vi den kliniske betydningen av PD-L1 i en undergruppe av 39 pasienter med PTEN fullstendig tap for å undersøke om effekten av PD-L1 i CRC er avhengig av PTEN uttrykk.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Prøvetaking og Cell Culture
i denne studien, 404 formalinfikserte, parafininnstøpte prøver av CRC ble hentet fra svulsten bredden av Avdeling for patologi av First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina ). Disse 404 pasienter som hadde blitt diagnostisert med CRC og gjennomgikk første kirurgisk reseksjon for CRC mellom januar 2000 og november 2006 var oppfølging per telefon eller brev fra kirurgi opp til april 2010 for å samle generell informasjon, patologi rapporter og informasjon om pasientenes tilstand etter operasjonen.
Tre CRC cellelinjer, ble SW480, SW620 og HCT116 kjøpt fra Culture Collection of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 1% penicillin -streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2
RNA interferens (RNAi)
Hvis du vil ned-regulere PTEN uttrykk, de spesifikke siRNA tomannsboliger rettet mot menneskelig PTEN (følelse: 5. «-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3′; anti: 3»-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5) ble syntetisert og kjøpt fra RiboBio Co Ltd (Guangzhou, Kina), og siRNA tomannsboliger med ikke-spesifikke sekvenser ble brukt som negativ kontroll (NC). SiRNA transfeksjon ble utført med lipofektamin 2000 (Invitrogen, CA, USA) med en konsentrasjon på 100 nM. Transfeksjon effektivitet ble testet ved QRT-PCR og Western blot. Disse eksperimentene ble utført i nærvær og fravær av rekombinant human-IFN-γ (500 IU /ml, Peprotech, NJ, USA) og gjentatt in triplo.
kvantitativ revers transkripsjon PCR (QRT-PCR)
Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble totalt cellulært RNA ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble utledet fra 500 ng total-RNA ved bruk av cDNA revers transkripsjon kit (Toyobo, Osaka, Japan). Etterpå ble sanntid PCR utført ved hjelp av kvantitativ SYBR Grønn PCR kit (Takara Bio, Dalian, Kina) på ABI 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Primerne som benyttes er angitt i tabell 1, ble PTEN og PD-L1 relativ genekspresjon nivå analysert ved hjelp av sammenlignende C
T-metoden (også referert til som 2
-ΔΔCT metoden). Detaljer om komparative C
T-metoden har blitt beskrevet tidligere [24], [25]. I korthet, ble tre replikate PCR-amplifikasjoner utført for hver prøve. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Den gjennomsnittlige C
T ble beregnet for både målgener og β-aktin. Den A C
T ble bestemt som (gjennomsnittet av triplikate C
T verdier for målgenet) minus (gjennomsnittet av triplikat C
T-verdier for β-aktin). Den ΔΔC
T representerer forskjellen mellom de sammenkoblede cellelinjer, hvor PTEN ΔΔC
T = A C
T fra celler transfektert med siRNA minus A C
T av negativ kontroll og PD-L1 ΔΔC
T = A C
T fra celler behandlet med IFN-γ minus A C
T av de ubehandlede kontrollceller. Den relative uttrykket nivået ble uttrykt som 2
-ΔΔCT.
Western Blot
sytti-to timer etter transfeksjon ble cellene vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS ) og lysert med RIPA buffer (Dingguo, Beijing, Kina) supplert med protease og fosfatase-hemmere (Merck Bioscience, Darmstadt, Tyskland). Etterpå ble PTEN protein nivåer fastsatt ved bruk av to-farge fluorescerende western blotting på Odyssey infrarød bildesystem (LI-COR, Nebraska, USA) som tidligere beskrevet [26]. I korte trekk, ble like mengder av protein separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran (Pall, New York, USA). Membranene ble deretter blokkert med 5% BSA i 1 time og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C [Primært antistoff: Kanin anti-PTEN (fortynnet 1:10000, Epitomics, CA, USA); Kanin anti-Akt (utvannet 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Kanin anti-fosfor-Akt
Ser473 (utvannet 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Mouse β-actin antistoff (fortynnet 1:10000, Proteintech, Chicago, USA)]. Neste dag, etter inkubasjon med arts passende fluorescently konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur ble membranene analysert ved hjelp av Odyssey infrarød imaging system.
flowcytometrisystemer
PD-L1 uttrykk på celleoverflaten, ble bestemt ved bruk av væskestrømsfotometere. Celler ble høstet og inkubert med anti-human PD-L1 PE-Cy7 (eBioscience, CA, USA) eller isotype-matchet kontrollantistoff (eBioscience, CA, USA) i 30 minutter i mørke på is (0,5 ug antistoffer for 10
5-celler i et endelig volum på 100 ul). Etter prøvene ble vasket tre ganger, fargede celler ble resuspendert og analysert på BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, USA) ved hjelp FlowJo programvare (TriStar, CA, USA). Standardiserte fluorescensintensiteter ble beregnet ved å dividere median fluorescensstyrkene spesifikke antistoffer ved median fluorescensstyrkene isotype-matchet kontroll. Alle data ble samlet inn fra tre uavhengige forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt av sammenkoblede prøver
t
test.
Tissue microarray (TMA) og Immunohistochemistry (IHC)
TMA ble bygget ved hjelp av automatiserte vev microarray instrument (ALPHELYS, Plaisir, Frankrike). Etter å identifisere de H E-fargede objektglass for optimal svulstvev ble to sylindriske kjerne biopsier (2 mm diameter) stanset av hverformalinfiksert, parafininnstøpte vevsblokker og kledd i mottaker TMA blokker (2 × 3 cm) som tidligere beskrevet [27], [28]. Hver TMA blokk inneholder 108 vev kjerner fra 54 pasienter. Deretter mottaker blokker ble kuttet i 5-mikrometer seksjoner og levd opp til de silaniserte glass for IHC farging.
IHC ble utført ved hjelp av Elivision ™ super HRP (Mouse /kanin) IHC Kit (Maixin-Bio, Fuzhou, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter deparaffinised i xylen og rehydrert i en serie av graderte alkoholer (100%, 95%, 75%), ble objektglassene hentet antigen i natriumcitratbuffer (pH 6,0) i microware. Da objektglassene ble inkubert med 3% H
2o
2 for å blokkere endogen peroksidase og geiteserum for å blokkere ikke-spesifikk binding. Etterpå lysbilder ble inkubert med PD-L1 antistoff (fortynnet 1:500, Abcam, HK, Kina) eller PTEN antistoff (fortynnet 1:600, Abcam, HK, Kina) over natten ved 4 ° C. Den neste dag ble Glassene ble inkubert med forsterkermiddel (reagens A, Elivision supersett tilførsel) og polymerase (reagens B, Elivision supersett forsyning). Til slutt, ble platene farget med DAB og kontra med hematoksylin (40 sekunder). En negativ kontroll ved hjelp av antistoff fortynning som erstatning for primære antistoffer ble utført for hvert forsøk.
Farging Evaluering
For hvert sted, et digitalt bilde på 2592 x 1944 piksler oppløsning på 100 × forstørrelse ble tatt til fange ved Leica DMI 4000B invertert mikroskop (Leica Micro-systemer, Wetzlar, Tyskland). Immunhistokjemisk farging av bildet ble analysert ved hjelp av Image Pro-Plus (versjon 5.0, Media Cybernetics, Silver Spring, USA) introdusert av Xavier [29]. I korte trekk, ble tumorområdet valgt som det området av interesse (AOI), og det område sum og integrert optisk tetthet (IOD) av AOI ble valgt som måleparametre. PD-L1 og PTEN uttrykk indeksen tangert kvotienten mellom IOD og det samlede arealet av AOI. Til slutt ble det betyr uttrykket indeks for hver kopi som brukes for statistisk analyse.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS v.17.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). X-fliser (versjon 3.6.1, Yale University School of Medicine, New Haven, USA) ble benyttet for å bestemme den optimale enkelt cut-point for overlevelsen kurven. Alle P-verdiene var tosidig og P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Sammenslutning av PD-L1 /PTEN uttrykk med kliniske parametre ble evaluert ved bruk av Wilcoxon rank sum test (for to populasjoner som er relatert) eller Kruskal- Wallis test (for mer enn to populasjoner som er relatert) fordi dataene for PD-L1 /PTEN uttrykk indeksen er ikke forenlig med en normalfordeling (Shapiro-Wilk test: P 0,001). Total overlevelse (OS) og metastasering overlevelse (MFS) ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Å bli diagnostisert som metastaser under oppfølging i ligger CRC (pM0) pasienter ble definert som terminal arrangement for MFS analyse. De sammenslutninger av PD-L1 /PTEN uttrykk med sykdom utfall ble vurdert ved hjelp av Cox regresjonsmodeller. Den optimale enkelt cut-point for PD-L1 /PTEN uttrykk som separate pasienter i en gruppe med PD-L1 /PTEN høyere uttrykk og en gruppe med PD-L1 /PTEN lavere uttrykk ble bygget av X-fliser programvare som tidligere beskrevet [23 ], [24]. Lignende foreninger og overlevelsesanalyse ble utført i undergruppe av 39 pasienter uten PTEN uttrykk, som representerer gruppen hvor forvirrende rolle PTEN styres.
Resultater
Ikke PTEN Loss men IFN -γ induserte PD-L1 mRNA ekspresjon i CRC-cellelinjer
Både mRNA nivå og proteinnivå PTEN redusert i celler transfektert med siRNA PTEN, sammenlignet med den negative kontroll. MRNA nivået av PTEN ble redusert ned til ca. 12,4% i SW480, 14,6% i SW620, 22,6% i HCT116 ved 48 timer etter transfeksjon i celler transfektert med siRNA PTEN, sammenlignet med den negative kontroll (Fig. 1. A). Det var ingen signifikant forskjell i PD-L1 mRNA nivå mellom cellene transfektert med siRNA PTEN og den negative kontroll. I motsetning til dette økte PD-L1 mRNA nivå vesentlig i celler som var utsatt for IFN-γ sammenlignet med matchet-kontrollcellene uten eksponering til IFN-γ (ca 8-folder) (Fig. 1 B).
(A) det relative ekspresjonsnivå av PTEN mRNA (påvist ved QRT-PCR, beregnet ved 2
-ΔΔCT metode) i fire grupper: celler transfektert med siRNA PTEN eller ikke-spesifikke sekvenser i nærvær eller fravær av IFN -γ. (B) Den relative Ekspresjonsnivået av PD-L1 mRNA i fire grupper av celler. Data ble samlet inn fra tre uavhengige forsøk. Feilfelt representerer SD.
Både IFN-γ og PTEN Loss Induced PD-L1 Protein Expression i CRC
Vi har evaluert konsekvensene av PTEN knockdown på Akt aktivering i nærvær /fravær av IFN-γ. Fosfo-Akt
Ser473 øket i celler transfektert med siRNA PTEN, sammenlignet med den negative kontroll, uavhengig av tilstedeværelse av IFN-γ (fig. 2). PD-L1-protein-ekspresjon ble betydelig øket i celler transfektert med siRNA PTEN, sammenlignet med den negative kontroll (P 0,05). I tillegg gjorde tilstedeværelsen av IFN-γ ikke endre dette baseline situasjonen (Fig. 3).
protein uttrykk nivå av PTEN, Akt og fosfor-Akt
Ser473 ble bestemt ved Western blotting. β-aktin ble benyttet for å bekrefte lik belastning. Representative bilder som er valgt fra utført forsøk gjentatt i tre paralleller
PD-L1-protein ekspresjon nivå på overflaten av SW480, SW620 og HCT116 ble bestemt ved flow-cytometer.: Celler transfektert med siRNA PTEN (røde linjer) og celler transfektert med ikke-spesifikke sekvenser (blå linjer) i fravær av IFN-γ; celler transfektert med siRNA PTEN (svarte linjer) og cellene transfektert med ikke-spesifikke sekvenser (oransje linjer) i nærvær av IFN-γ; celler farget med isotype-matchet kontroll antistoff (skravert område). Standard fluorescensintensitet av PD-L1 protein, ble beskrevet av histogrammet i panelet til høyre:-celler behandlet (hvit kolonne) eller ubehandlet (grå søyle) med IFN-γ. Data ble samlet inn fra tre uavhengige forsøk. Feilfelt representerer SD. . (* P 0,05 av sammenkoblede prøver
t
test)
IFN-γ Induced PD-L1 protein med to ulike strukturer i SW480 cellelinje
Den flowcytometri histogrammet viste to topper i SW480 celler behandlet med IFN-γ (500 IE, 72 timer), mens det var bare en markert topp i ubehandlet gruppe. I tillegg ble bare en enkelt distinkt topp observert i SW620-celler og HCT116-celler både i nærvær og fravær av IFN-γ (fig. 3). For å avgjøre hvorvidt disse to toppene var tidsavhengig eller doseavhengig, behandlet vi SW480-celler med forskjellig dose av IFN-γ i 48 timer. PD-L1-protein ble maksimalt øket med 500 IU /ml IFN-γ. Tidsforløpet effekt av IFN-γ på PD-L1-protein ble bestemt etterpå. SW480 ble behandlet med 500 IU /ml IFN-γ for 0, 24, 48 og 72 timer. Resultatene viste at i nærvær av IFN-γ, uten hensyn til doseringen av IFN-γ og av behandlingstiden, PD-L1-protein med to forskjellige strukturer ble gjenkjent på overflaten av SW480-celler (fig. 4).
(A) SW480 ble behandlet med IFN-γ ved angitte konsentrasjon (0 IE /ml, 50 IE /ml, 100 IE /ml, 500 IU /ml, 1000 IE /ml). (B) SW480 ble behandlet med 500 IU /ml IFN-γ for siktet ganger (0 h, 24 h, 48 h og 72 h). Skraverte området representerer SW480 uten behandling av IFN-γ, og tallene ved siden av toppene representerer standard fluorescens intensitet av PD-L1. Representative bildene er valgt fra utført eksperimenter gjentas i tre paralleller
Pasient Oppfølging
Blant de 404 pasientene, 5 pasienter ( 3%). Hadde gått tapt på slutten av oppfølging, 110 pasienter (27,2%) hadde dødd på en median oppfølgingstid på 2,7 år (fra: 0.1-9.1 år), og de resterende 288 pasientene hadde en median oppfølgingstid på 5,8 år (range: 0,1 -10.2 år). Når IHC ble utført, ble vevet av 57 pasienter vasket av objektglass, og de gjenværende 347 pasientene hadde immunhistokjemi data. Det var ingen forskjell i total overlevelse mellom pasienter med og uten immunhistokjemiske data (p = 0,716, log-rank test). Det var heller ingen signifikant forskjell i metastatisk progresjon (diagnostisert som metastaser etter kirurgi) priser mellom pasienter med og uten immunhistokjemiske data (12,4% og 14,0%, p = 0,682).
Korrelasjonen av PD-L1 /PTEN Expression og kliniske parametre
immunhistokjemisk farging av PD-L1 ligger i cellemembranen og endomembransystemet hadde et uttrykk indeks varierte 0 til 15,9 (median: 2,33) (figur 5. en
1-D
1, A
2-D
2). PTEN lå i cytoplasma med et uttrykk indeks varierte 0 til 54,7 (median: 5.57) (Fig. 5. E
1-G
1, E
2-G
2) .Det var 39 pasienter som ikke hadde noen PTEN uttrykk (fig. 5. H
1, H
2).
(A
1, A
2, E
1 E
2) Negativ kontroll; (B
1, B
2, F
1, F
2) Prøver fra samme pasient med metastatisk progresjon; (C
1, C
2, G
1, G
2) Prøver fra en annen pasient uten metastatisk progresjon; (D
1, D
2) En typisk representant som viste at PD-L1 ekspresjon er forhøyet i tumorområdet (T) sammenlignet med de tilstøtende normale slimhinner (N); (H
1, H
2) Prøver fra pasienter uten PTEN uttrykk; (J, K) Statistisk analyse viste at PD-L1 ekspresjon er økt i pasienter med metastatisk progresjon sammenliknet med de uten metastatisk progresjon, mens en slik statistisk analyse av PTEN var ikke signifikant. (To opp paneler, farget med PD-L1-antistoff, to ned paneler, farget med PTEN-antistoff), (a
1-H
1 x 100; A
2-H
2, × 400)
Som vist i tabell 2, pasienter med høyere PD-L1 uttrykket var mer sannsynlig vise fjernmetastaser (pM) (p . 0,01), uønskede patologiske funksjoner (2007 TNM klassifisering) (P 0,01), og metastatisk progresjon (P 0,001) (fig. 5. J), og PD-L1 uttrykk ble korrelert med PTEN uttrykk til en viss grad (P 0,001). Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom kjønnene, alder, tumorlokalisasjon, primær tumor klassifisering (PT), regional spredning til lymfeknuter (PN), eller tilbakefall etter kirurgi. Omvendt, PTEN uttrykk hadde ingen signifikant sammenheng med de viktigste variablene (PT: P = 0,221; PN: P = 0,131, PM: P = 0,525; TNM stadium: P = 0,337; gjentakelse: P = 0,397, metastatisk progresjon: P = 0,710 ). Den total overlevelse og metastasering overlevelse var heller ikke assosiert med PTEN uttrykk (P = 0,366, p = 0,141 henholdsvis) (Fig. 6. C, D).
(A, B) OS og MFS var signifikant lavere i PD-L1-høyere-uttrykk pasienter sammenlignet med PD-L1-lavere-uttrykk pasienter (både P 0,001). (C, D) OS og MFS var ikke signifikant forskjellig mellom de PTEN-høyere-uttrykk pasienter og PTEN-lavere-uttrykk pasienter (OS, P = 0,366, MFS, P = 0,141). (E) I undergruppen av 39 pasienter med komplett PTEN tap, PD-L1 uttrykk ble ikke lenger forbundet med OS (P = 0,482).
Survival Analysis
Analyse av X-flisen programvare viser at 1,49 var det optimale grensepunkt som separeres pasienter i en gruppe med PD-L1 høyere uttrykk og en gruppe med PD-L1 lavere ekspresjon. Kaplan-Meier kurve og log-rank test viste at den totale overlevelsen av pasienter med lavere PD-L1 uttrykk var betydelig høyere enn pasienter med høyere PD-L1 uttrykk (Fig 6A, χ2 = 13,964, P . 0.001). Den 5-årige OS rente var 62,9% for pasienter med høyere PD-L1 uttrykk og 81,1% for pasienter med lavere PD-L1 uttrykk. I multivariat analyse av Cox-modell, PD-L1 var ikke en uavhengig prognostisk faktor for CRC etter justering for de variablene som oppfyller PH antagelse (alder, tumor beliggenhet, differensiering klasse, pt, pn, PM, metastatisk progresjon) (P = 0,548). Men hvis variabler som i betydelig grad i forbindelse med PD-L1 uttrykket (pM, metastatisk progresjon) ble ikke korrigert for i multivariat analyse, ble PD-L1 ekspresjon en signifikant prediktor for CRC (P 0,01). (Tabell 3)
Som vist i våre resultater, PD-L1 tilbøyelig til å assosiere med metastase variabler. Så for å kunne fastslå foreningen av PD-L1 med kreft metastatisk progresjon, studerte vi undergruppe av 310 pasienter med lokaliserte CRC (pM0), hvorav 28 (9,03%) kommet til fjernmetastaser ved en median oppfølging av 5,14 år ( rekkevidde, 0.06-10.14 år). I denne undergruppen, ble PD-L1 uttrykk signifikant assosiert med metastaser overlevelse (MFS) (fig 6B, χ2 = 21,444, P . 0.001). Den 5-årige MFS rente var 99,5% for PD-L1-lavere-uttrykk pasienter og 72,1% for PD-L1-høyere-uttrykk pasienter. I tillegg Cox analyse viste at PD-L1 uttrykk var en signifikant prediktor for metastatisk progresjon. (RR: 1,165; 95% CI: 1,072 til 1,268; P 0,001)
Interessant, i undergruppe av 39 PTEN -no-uttrykk pasienter, der konfunderende effekt av PTEN på PD-L1 er kontrollert, PD-L1 uttrykk ble ikke lenger forbundet med fjernmetastaser (P = 0,102), TNM stadium (P = 0,634), og overlevelsesanalyse viste at det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse mellom PD-L1-høyere-uttrykk gruppe og PD-L1-lavere-uttrykk gruppe (fig. 6E, χ2 = 0,494, p = 0,482).
Diskusjoner
PD-L1 har vært en av de viktigste fagene svulst biomarkør forskning i det siste tiåret. Et stort antall studier har vist en sammenheng mellom svulst aggressivitet og PD-L1-protein ekspresjon. I den foreliggende undersøkelse, også forutsatt at vi sterke bevis på at et høyere nivå av PD-L1-ekspresjon i CRC letter fremføring av tumorstadium og metastatisk progresjon. Den generelle overlevelse av pasienter med lavere ekspresjon av PD-L1 var signifikant høyere enn den til pasienter med høyere ekspresjon av PD-L1. I tillegg ble PD-L1 uttrykk også signifikant assosiert med metastase-overlevelse i 310 CRC pasientene plassert. Men PD-L1 uttrykk var ikke signifikant assosiert med ugunstig prognose etter justering for metastaser og metastatisk progresjon av multivariat overlevelsesanalyse. Dette er i strid med den forrige observasjon at PD-L1 uttrykk forblir forbundet med ugunstig prognose ved multivariat analyse hos nyrecellekreft pasienter [6]. En forklaring på dette avviket kan være de ulike variablene som er justert for i den multivariate modellen. I forrige undersøkelse ble metastatisk progresjon variabel (diagnostisert som metastaser etter operasjonen) ikke justert for i multivariate overlevelsesanalyse. Det er godt kjent at metastase er den primære årsaken til død i CRC pasienter; så når vi justert for dette dødsrelaterte variable, PD-L1 var ikke lenger en uavhengig prognostisk faktor for CRC.
Bevis fra litteratur og vår forskning viste at PD-L1 overekspresjon er nært forbundet med kreft progresjon ( spesielt med spredning progresjon), noe som gjør PD-L1 en lovende biomarkør og terapeutiske mål for svulster. Imidlertid er mekanismen ved hvilken PD-L1 forbedrer kreft progresjon dårlig forstått. Som beskrevet i litteraturen, kan disse assosiasjonene tilskrives den godt anerkjent «molekylære skjold» som tilbys av PD-L1. Det ble rapportert at PD-L1 gir et «skjermende» virkning for å beskytte tumorceller fra lysering av cytotoksiske T-celler. I tillegg ble PD-L1 funnet å ha en anti-apoptotiske effekt på tumorceller [3], [30]. Men en i
vivo
studie viste at transgene uttrykk for PD-L1 i en PD-L1-mangel naive mus ikke endre tumourigenicity [31]. I multisenter fase I studien Brahmer et al erklærte at antistoff-mediert blokade av PD-L1 induserer holdbar tumor regresjon og forlenger stabilisering av sykdom hos pasienter med utvalgte avansert kreft. Dessverre er kolorektal kreft ikke er en av disse utvalgte kreft [32]. Vi lurte på om muligheten for å ødelegge «molekylære skjold» kan gi tilstrekkelig grunnlag for denne kliniske foreningen i CRC. Andrew T Parsa også foreslått at i hvilken grad PD-L1 protein uttrykk påvirker kreft progresjon direkte gjenstår å fastslå [14].
I denne studien å identifisere ytterligere indirekte effekter av PD-L1 uttrykk på kreft progresjon studerte vi signalveier involvert i reguleringen av PD-L1 uttrykk i CRC.
