Abstract
Tidligere studier har vist svulsten-undertrykkende rolle selen-bindende protein 1 (SBP1), men de underliggende mekanismene er uklare. I denne studien fant vi at induksjon av SBP1 viste signifikant hemming av tykktarmskreft cellevekst og metastase hos mus. Vi videre ansatt isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) for å identifisere proteiner som var involvert i SBP1-mediert anti-kreft effekt i tumorvev. Vi identifiserte 132 ulikt uttrykte proteiner, blant dem ble 53 proteiner oppregulert og 79 proteiner ble nedregulert. Viktigere er mange av de differensielt endrede proteiner ble forbundet med lipid /glukosemetabolisme, noe som også ble bundet til Glycolysis, MAPK, Wnt, NF-kB, HAKK og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) signalveier. Disse resultatene har avdekket en ny mekanisme som SBP1-mediert kreft hemming er gjennom å endre lipid /glukose metabolske signalveier
Citation. Ying Q, Ansŏng E, Diamond AM, Lu Z, Yang W, Bie X (2015 ) Kvantitativ proteomikk analyse viser at Anti-Cancer Effekter av selen-Binding Protein en
In Vivo
er assosiert med metabolske veier. PLoS ONE 10 (5): e0126285. doi: 10,1371 /journal.pone.0126285
Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 13 januar 2015; Godkjent: 31 mars 2015; Publisert: 14. mai 2015
Copyright: © 2015 Ying et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (tilskuddet # 91229115 og 81272251), tilskudd til Innovative team of Science and Technology, Henan-provinsen, Kina
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den menneskelige selen-bindende protein 1 (SBP1, SELENBP1) tilhører klassen av selen-inneholdende proteiner i hvilket selen er tett forbundet med peptidet i stedet for innlemmet ko-translasjonelt som en aminosyre selenocystein (sek) i en annen klasse av selenholdig protein-glutationperoksidase 1 (GPx1). Det humane SBP1-genet koder for et 472 aminosyre protein som har en molekylvekt på 56 KDa. Den uttrykkes i en rekke celler og vev (lever, hjerte, lunge, nyre og) og som er plassert i kjernen og /eller cytoplasma, avhengig av celletype, graden av differensiering og miljømessig signale [1-4]. Redusert SBP1 har blitt funnet i de fleste av humane kreftformer, inkludert leverkreft, prostatakreft, brystkreft, lungekreft, tykktarmskreft og [5]. Denne reduksjonen av SBP1 er assosiert med dårlig kliniske resultater. Imidlertid biologiske funksjoner av SBP1 i humane kreftformer uklare.
Det er blitt rapportert at SBP1 er et mål for hypoksi-induserbar faktor-1 α (HIF1α) for å svare på reaktive oksygenarter (ROS) [3] . SBP1 kan også negativt regulere glutationperoksidase 1 (GPx1) aktivitet uten å endre dets protein uttrykk gjennom en fysisk protein interaksjon [6]. von Hippel-Lindau protein (pVHL) – samspill deubiquitinating enzym 1 (VDU1) ble nylig funnet som en annen protein partner av SBP1, som var involvert i ubiquitination- og deubiquitination-mediert protein nedbrytningsveier [7]. Alt dette arbeidet tyder på at SBP1 kan samhandle med andre proteiner gjennom ulike signalveier.
For å få en mer helhetlig forståelse av SBP1 funksjoner på kreft, ansatt vi en proteomikk metode, isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) . iTRAQ er i dag en av de mest robuste teknikker som kvantifiserer proteiner på basis av peptidet merking. I motsetning til gel-basert proteomikk metode, iTRAQ utstillinger mye bedre følsomhet og tillater identifisering og nøyaktig kvantifisering av proteiner fra flere prøver innenfor brede dynamiske områder av protein overflod [8].
For å eliminere mulige bivirkninger av transfeksjon, vi etablert en stabil SBP1 induserbar cellelinje ved hjelp av en Tet-on induserbar genuttrykk system som gjør SBP1 uttrykk svært kontrollerbar og når en svært høy induksjon nivå i cellene. Tumor hemming rolle SBP1 ble observert
in vivo
. De differensielt uttrykte proteiner i SBP1-indusert mus xenografttumorer ble analysert ved iTRAQ og endringer av noen identifiserte proteinene ble validert av immunoblotting. Våre resultater viste en roman anti-kreft mekanisme SBP1
in vivo
, som var knyttet til lipid /glukose metabolisme og assosiert med MAPK /Wnt, NF-kB, lyd og EMT signalveier.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av Xinxiang Medical University Animal Care og bruk komité. Alle operasjoner ble utført under pentobarbital anestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell kultur
HCT116 humane colon carcinoma cellelinjen ble innhentet fra ATCC (American Type Culture Collection, USA) og vedlikeholdes i McCoys 5a medium (Mediatech, Manassas, VA). GP2-293 cellelinje ble kjøpt fra Clontech (Mountain View, California) og vedlikeholdes i DMEM medium (Life Technologies, Carlsbad, California). Alt medium ble supplementert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator (Thermo Fisher Scientific).
Plasmid bygging
For å generere retrovirale uttrykk plasmid pRetroX-Tight-Pur -SBP1, human SBP1 cDNA ble forsterket og subklonet inn i pRetroX-Tight-Pur vektor (Clontech, Mountain View, California) bruker Noti- og EcoRI restriksjonsseter. De følgende primere ble anvendt: forover 5′- ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGAAAT-3 «og 5′-revers ACGAATTCGCTCAAATCCA GATGTCAGAGC-3». To plasmider pRetroX-Tet-On Advanced (Tet på aktivator vektor) og pVSV-G (emballasje vektor) ble kjøpt fra Clontech (Mountain View, California).
Retrovirus emballasje
Emballasje celler GP2-293 ble dyrket i 25cm
2 kolber og transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) med 6 mikrogram pVSV-G og enten 2 mikrogram pRetroX-Tight-Pur-SBP1 eller to mikrogram pRetroX-Tight-On Avansert. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble virusinneholdende supernatanten oppsamlet og frosset ved -20 ° C. Cellelinje HCT116-TetSBP1 ble generert ved å infisere HCT116-celler med virus som inneholder både pRetroX-Tight-Pur-SBP1 og pRetroX-Tight-On Avansert. Enkelt koloni ble plukket ut etter valg med 400 ug /ml G418 (Sigma) og 1 ug /ml puromycin (Sigma). Cellelinje HCT116-loven ble generert ved å infisere HCT116-celler med virus som inneholder pRetroX-Tight-On Avansert. Enkelt koloni ble plukket ut etter valg med 400 ug /ml G418 (Sigma).
Immunoblotting analyse
HCT116-TetSBP1 og HCT116-Act-celler ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin (Sigma) i 72 timer før analyse. Høstet cellene ble lysert i 1x Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, Danvers, MA) som inneholder 1 mM PMSF (Cell Signaling). Ryddet cellelysat fra hver cellelinje ble kokt med NuPAGE LDS prøvebuffer (Life Technologies) og 10x reduksjonsmiddel (Life Technologies) i 5 minutter før de blir lastet på en 4-12% stigning Bis-Tris denaturerende polyakrylamid gel (Life Technologies). Etter prøve-separering ved elektroforese, ble proteinene overført til en Immobilon-FL-membran (Millipore) via elektroblotting. Primære antistoffer og fortynninger inkludert SBP1 ved 1: 1000 (mus, MBL International, Woburn, MA), β-actin på 1: 10000 (mus, Sigma), DKK1 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), ANXA4 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), PPIA på 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), FABP4 på 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), UGDH på 1: 1000 ( kanin, Proteintech, Chicago, IL), ALDH2 på 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), p21 på 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), fosfor-Akt (Ser473) ved 1: 1000 ( kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Akt 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfor-FOXO1 på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfor-JNK 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), JNK på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Pc-Jun 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA ), fosfor-cyclin D1 på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cyclin D1 på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfor-p53 (Ser15) ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), TWIST på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), β-catenin på 1: 500 (geit, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), og GPX1 ved 1: 1000 (mus, MBL International, Woburn, MA) ble inkubert med membranen ved 4 ° C over natten. Den passende sekundært antistoff (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina) ble påført (1: 1000, kanin eller mus) ved romtemperatur i 1 time. Signal ble oppdaget ved hjelp BeyoECL Plus (Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina).
In vivo
hårløse mus tumorigenesis og metastase analysen
For xenograft eksperiment, HCT116-loven og HCT116 -TetSBP1 celler ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin i 72 timer og deretter 2 x 10
6 celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant i 6-8 uker gamle BALB /c-CD-en Nu hunnmus på de forskjellige sidene ( HCT116-loven var på venstre side og HCT116-TetSBP1 var på høyre side). Doksycyklin (200 ug /ml) oppløst i 5% sukrose tilføres som drikkevann ble byttet hver 3. dag. Fire uker etter injeksjon, tumorer ble isolert og vekten (g) og volum (mm
3) av tumorer ble bestemt. Svulster ble lagret ved -80 ° C til de ble anvendt for immunblot og iTRAQ analyse.
å fremstille eksperimentell lungemetastase ble HCT116-loven og HCT116-TetSBP1-celler behandlet med 1 ug /ml doksycyklin i 72 timer og deretter 2 x 10
6-celler i 100 ul PBS ble injisert inn i laterale halevenene på 6-8 uker gamle BALB /c CD-1 nu hunnmus. Doksycyklin (200 ug /ml) oppløst i 5% sukrose tilføres som drikkevann ble byttet hver 3. dag. Seks uker senere ble musene avlivet under bedøvelse. Lungene ble samlet og fiksert i 10% formalin. For vev morfologi evaluering, hematoxylin og eosin (HE) farging ble utført på seksjoner fra embedded prøver.
Protein utvinning, fordøyelse og iTRAQ merking
Totalt proteiner ble hentet fra svulstvev av HCT116-loven injisert (Act) og HCT116-TetSBP1 injisert mus (TetSBP1) med følgende protokoll. Tre biologiske replikater ble utført for hver prøve og blandet sammen for proteinekstraksjon. Tumorvev ble kokt i SDT buffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7,6) i 5 minutter, homogenisert ved hjelp av FastPrep-24 (MP Biomedicals, 6M /S, 30-årene, to sykluser) og deretter sonikert ( 100W, 30 sek på, 30 sek av, 10 sykluser). Homogenatet ble sentrifugert ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt i henhold til Bradford-metoden [9]. En like stor mengde av proteiner ble fremstilt for hver prøve. Fordøyelse av proteiner ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av FASP Wisniewski, Zougman et al. [10] og den resulterende peptid blanding ble merket med 4-Plex iTRAQ reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). Kort sagt ble 200 ug av protein for hver prøve innlemmet i 30 ul STD buffer (4% SDS, 100 mM DTT, 150 mM Tris-HCl pH 8,0). Den vaskemiddel, DTT og andre lav-molekylvekt komponenter ble fjernet ved å bruke UA buffer (8 M urea, 150 mM Tris-HCl pH 8,0) ved gjentatt ultrafiltrering (mikrokon-enheter, 30 kD). Deretter ble 100 ul 0,05 M jodacetamid i UA-buffer ble tilsatt for å blokkere reduserte cysteinrester og prøvene ble inkubert i 20 min i mørket. Filtrene ble vasket med 100 ul UA-buffer tre ganger og deretter 100 ul DS-buffer (50 mM triethylammoniumbicarbonate ved pH 8,5) to ganger. Til slutt ble proteinsuspensjoner spaltet med 2 ug trypsin (Promega) i 40 ul DS-buffer over natten ved 37 ° C, og de resulterende peptider ble oppsamlet som et filtrat. Peptidet Innholdet ble beregnet ved hjelp av UV lys spektral tetthet ved 280 nm ved hjelp av en utryddelse koeffisient på 1,1 til 0,1% (g /l) løsning som ble beregnet på grunnlag av hyppigheten av tryptofan og tyrosin i virveldyr proteiner. For merking, ble hver iTRAQ reagens oppløst i 70 mL etanol og tilsatt til de respektive peptidblandingen. Prøvene ble merket som (TetSBP1) -114, (lov) -115, og var multiplex og vakuumtørket.
væskekromatografi (LC) -electrospray ionisering (ESI) tandem MS (MS /MS) analyse av Q exactive
peptidet blandingen ble avsaltet på C18-kassetter (Sigma), og deretter konsentrert ved vakuumsentrifugering og rekonstituert i 40 ul 0,1% (v /v) trifluoreddiksyre. MS-eksperimenter ble utført på en Q Exactive massespektrometer som ble koblet til Easy nlc (Thermo Fisher Scientific). 10 ul av prøven ble injisert for nanoLC-MS /MS-analyse. Peptidblandingen (5 ug) ble fylt på en C18-reversert fasekolonne (Thermo Scientific enkelt kolonne, 10 cm lang, 75 um innerdiameter, 3 um harpiks) i buffer A (0,1% maursyre) og adskilt med en lineær gradient av buffer B (80% acetonitril og 0,1% maursyre) ved en strømningshastighet på 250 nl /min reguleres ved IntelliFlow teknologi i løpet av 240 min. MS data ble kjøpt via en dataavhengig top10 metode dynamisk velge de mest tallrike forløperionene fra skanningen undersøkelsen (300-1800 m /z) for HCD fragmentering. Fastsettelse av målet verdien er basert på prediktiv Automatic Gain Control (pAGC). Dynamisk utelukkelse varighet var 60 s. Survey skanninger ble kjøpt med en oppløsning på 70 000 ved m /z 200 og oppløsning for HCD spektra ble satt til 17 500 ved m /z 200. Normalisert kollisjonsenergi var 30 eV og underfill ratio, som angir minimum prosentandel av målverdien sannsynlig å bli nådd ved maksimums tid, ble definert som 0,1%. Instrumentet ble kjørt med peptid gjenkjenningsmodus aktivert
iTRAQ protein identifikasjon og kvantifisering
MS /MS spektra ble søkt hjelp MASCOT motor (Matrix Science, London, UK, versjon 2.2). Bygges inn Proteome Discoverer 1,3 (Thermo Electron, San Jose, CA.) mot Uniprot Menneskelig database (136615 sekvenser, lastet ned på 7 mai 2014) og lokkefugl database. For protein identifikasjon, ble følgende alternativer brukes: Peptide masse toleranse = 20 ppm, MS /MS toleranse = 0,1 Da, Enzyme = Trypsin, Tapte cleavage = 2, Fast modifikasjon: Carbamidomethyl (C), iTRAQ 4-Plex (K), iTRAQ 4-plex (N-term), Variable modifikasjon: Oksidasjon (M), FDR≤0.01. Tatt i betraktning at flere MS /MS-spektra samsvar med et peptid, normalisering av signalintensitetene av hver MS /MS-spektra ble utført for å finne den mest sannsynlige uttrykket-forholdet for et peptid. For kvantitative endringer, ble en 1,2-fold cutoff satt til å bestemme up-kort og ned-akkumulert proteiner, med en p-verdi 0.05.
Bioinformatikk analyse
Funksjonell analyse av proteiner identifisert ble utført med Gene ontologi (GO) merknad (https://www.geneontology.org/) og proteiner ble kategorisert i henhold til deres biologiske prosess, molekylær funksjon og cellulær lokalisering [11]. De forskjellig akkumulerte proteiner ble videre tildelt til Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) [12].
Resultater
SBP1 induksjon i nakne mus hemmet tumorvekst av xenografter
SBP1 uttrykk nivåer i HCT116-loven og HCT116-TetSBP1 celler ble bestemt ved immunblotanalyse. Som vist i figur 1A, uttrykt HCT116-cellelinjen TetSBP1 høyt nivå av SBP1 etter doksycyklin induksjon, sammenlignet med de HCT116-celler loven. For å teste om SBP1 overekspresjon hadde svulst undertrykke funksjon
in vivo
som rapportert tidligere [13], utførte vi xenograft eksperimenter i CD1 Nu hårløse mus (n = 10 totalt). HCT116-loven og HCT116-TetSBP1 celler ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin i 72 timer og deretter 2 x 10
6 celler i 100 mL PBS ble injisert subkutant i 6-8 uker gamle BALB /c-CD-en Nu kvinnelig mus på de forskjellige sider, respektivt. HCT116-loven var på venstre side og HCT116-TetSBP1 var på høyre side. For å opprettholde vedvarende induksjon av SBP1, ble doksycyklin (200 ug /ml) oppløst i 5% sukrose tilføres som drikkevann byttet hver 3. dag. Fire uker etter injeksjon, ble tumorer isolert, og tumorvekt (g) og volum (mm
3) ble analysert. Vi fant at kreft størrelser avledet fra HCT116-TetSBP1 celler var mye mindre enn de i kontrollgruppen HCT116-lovens celler (figur 1B og 1C). I tillegg er vekten tumorer avledet fra HCT116-TetSBP1-celler ble signifikant redusert sammenlignet med HCT116-Act (Fig 1 D). Disse resultatene sterkt antydet at
in vivo
induksjon av SBP1 viste svulst hemming i mus.
(A) SBP1 indusert av doksycyklin i HCT116-TetSBP1 celler ble validert av immunoblot analyse. (B) Fotografier illustrere representative svulster i xenografter med SBP1 induksjon (TetSBP1, høyre) sammenlignet med svulster uten SBP1 induksjon (lov, til venstre). 10 mus totalt. (C-D) SBP1 induksjon resulterer i en reduksjon av tumorvolumet og vekt. Resultatene ble analysert ved t-test og er vist som gjennomsnitt ± SD. ** P. 0,01
SBP1 induksjon trykkes metastase
in vivo
For å undersøke SBP1 hemming av tumormetastase, den HCT116-loven og HCT116-TetSBP1 cellene ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin i 72 timer og deretter 2 x 10
6-celler i 100 ul PBS ble injisert inn i laterale halevenene på 6-8 uker gamle BALB /c CD-1 nu hunnmus (n = 5 for hver gruppe). For å opprettholde vedvarende induksjon av SBP1, ble doksycyklin (200 ug /ml) oppløst i 5% sukrose tilføres som drikkevann byttet hver 3. dag. Etter 6 uker mus ble bedøvet og mus lungene ble høstet, fast og dissekert. Vi fant at mus transplantert med HCT116-lovens celler hadde synlige lungemetastatiske knuter, mens ingen mus i HCT116-TetSBP1 gruppen viste synlig lungemetastase (Fig 2A). Etter hematoxylin og eosin (HE) farging, ble antallet lungemetastatiske noduler telles. Resultatene viste at mus med SBP1 induksjon (HCT116-TetSBP1 gruppe) resulterte i en betydelig reduksjon i lungemetastatiske knuter (Fig 2B), som indikerer en metastatisk hemming av SBP1
in vivo
.
( A) Representative bilder av lungene og hematoxylin og eosin (HE) -staining av lungene isolert fra mus som fikk halevenen injeksjon av HCT116-lovens celler (ACT) og HCT116-TetSBP1 celler (TetSBP1). Hver gruppe inneholder 5 mus. Piler illustrerer de synlige knuter og metastatiske knuter i lungene. Scale bar = 200 mikrometer. (B) SBP1 induksjon hemmer tumormetastaser
in vivo
. Antallet lungemetastatiske knuter ble tellet under mikroskop og analysert med t-test. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD. ** P. 0,01
Kvantitativ identifisering og bioinformatikk analyse av svulstvev proteiner analysert ved iTRAQ
For å finne mekanismer for SBP1-mediert hemming av tumorvekst og metastase hos mus, vi hentet total protein fra svulstvev av HCT116-loven injisert (Act) og HCT116-TetSBP1 injisert mus (TetSBP1), og proteinprofiler ble utført ved bruk av iTRAQ. Til syvende og sist ble 9147 unike peptider, 2015 protein grupper og 1975 proteiner identifisert. Fordelingen av lengder og antall peptider, masse og sekvens dekning av proteiner er gitt (S1 tabell).
De endringer i proteinprofil i respons til SBP1 induksjon ble analysert. 132 proteiner viste en signifikant forskjell (p-verdi 0,05) med en FDR på mindre enn 1%, inkludert 53 oppregulert proteiner og 79 nedregulert proteiner. Relevant informasjon er gitt (S2 tabell). Disse forskjellig akkumulert proteiner beriket 1364 kommentarer via GO analyse, og ble klassifisert i tre grupper: biologisk prosess, molekylær funksjon, og mobilnettet komponent (fig 3A). De viktigste kategoriene av biologisk prosess inkludert cellulære prosessen, single-organisme prosess, biologisk regulering, metabolske prosessen og respons på stimuli. Basert på ulike molekylære funksjoner, ble disse proteinene delt inn i grupper av bindings, katalytisk aktivitet, strukturelle molekyl aktivitet, enzymaktivitet regulator, transportøraktivitet og antioksidantaktivitet. Disse proteiner ble også involvert i forskjellige cellulære komponenter, inkludert cellen, organelle, makromolekylære kompleks, membran og membran lukkede hulrom. Disse forskjellig akkumulerte proteiner ble videre klassifisert med KEGG database. De store stier involvert i forskjellig uttrykt proteiner som følge av SBP1 induksjon, inkludert transcriptional misregulation i kreft, tight junction, lysosome, protein behandling i endoplasmatisk retikulum, HIF-1 signalveien, PI3K-Akt signalveien, baner i kreft, proteoglykaner i kreft , microRNAs i kreft, og glykolyse /glukoneogenesen, og andre veier. Nyere studier har vist at lipid /glukose metabolisme er sterkt assosiert med kreftutvikling [14-17]. Derfor vi deretter analysert hovedsakelig endrede proteiner som er knyttet til lipid /glukosemetabolismen fra mus xenografttumorer. Interessant, tretten lipidmetabolismen relaterte proteiner og syv glukosemetabolismen relaterte proteiner ble vesentlig endret ved SBP1 induksjon i mus xenografttumorer. Alle disse lipid /glukose metabolisme relaterte proteiner ble illustrert i figur 3B basert på deres biologiske funksjoner gjennom Gene ontologi (GO) analyse
(A) Alle 132 forskjellig akkumulert proteiner ble klassifisert i tre grupper:. Biologisk prosess, molekylær funksjon, og cellulær komponent gjennom GO analyse. (B) Tallene for lipid /glukose metabolisme relaterte proteiner ble vist gjennom GO analyse.
Endringer av lipid /glukosemetabolismen assosierte proteiner i respons til SBP1 induksjon
Som vist i figur 3B, ble tretten lipidmetabolisme-relaterte proteiner valgt, inkludert fem oppregulert proteiner og åtte downregulated proteiner (tabell 1). Den mest oppregulert proteiner ved SBP1 induksjon følger DKK1 som hemmer WNT pathway [18], DHCR7 som styrer kolesterol og vitamin D-syntese [19], ANXA4 som hemmer NFkB reaksjonsvei og IL-8 [20], og AGPAT5 som hemmer brystcancer celleproliferasjon [21]. Alle disse proteinene har blitt rapportert å vise potensielle anticancer-effekter. Mens, andre proteiner, slik som LPCAT2 som er sterkt uttrykt i inflammatoriske celler [22], BPIFA3 som er sterkt uttrykt i lungekreft [23], PPIA som aktiverer NFkB pathway [24], og FABP4 som har pro-angiogene rolle [25 ], ble nedregulert i SBP1 overekspresjon xenografttumorer. I kontrast, ble sju glukosemetabolismen relaterte proteiner signifikant nedregulert i SBP1 overekspresjon xenografttumorer, inkludert GAA, GAPDH, ALDH2, thioredoxin, ENO3, UGDH og Lumican (tabell 2).
Å validere differensial endringer i lipid /glukosemetabolisme-relaterte proteiner analysert fra iTRAQ proteomikk analyse i mus xenograft tumorer, ble immunoblotting utførte analyser. I samsvar med det som ble observert fra iTRAQ profil, to proteiner (DKK1 og ANX4) ble betydelig økt og fire proteiner (PPIA, FABP4, ALDH2 og UGDH) ble signifikant redusert i SBP1 overekspresjon xenografttumorer (S1 Fig). Den høye konsistens indikerte høy pålitelighet av iTRAQ resultater. MS /MS-data på disse seks proteiner er gitt (S2 figur).
Tumor hemming av SBP1 var assosiert med flere signalveier
in vivo
For å bestemme tilleggsmekanismer av SBP1 induksjon mediert hemming av tumorvekst og metastasering, analyserte vi tumorvekst og metastaseassosierte signalveier som bruker mus xenograft tumor proteinprøver som ble også brukt for iTRAQ proteomikk analyse. Først GPX1 ble nedregulert i TetSBP1 tumorer (figur 4), i samsvar med det som ble observert i menneskelige prostata kreft vev [26], men det var forskjellig fra
in vitro
studier som viste at overekspresjon SBP1 ikke påvirker GPX1 protein nivåer i HCT116 cellene selv om GPX1 aktiviteter ble signifikant nedregulert [6]. Dette med å finne igjen foreslått invers korrelasjon mellom SBP1 og GPX1
in vivo
ikke
in vitro
. For det andre, induksjon av SBP1 førte til aktivering av JNK1 /Wnt vei, i form av økt fosforylering av JNK1 og c-Jun, og redusert ekspresjon av beta-catenin og nedstrøms mål syklin D1, spesielt fosforylert Cyclin D1 ble signifikant nedregulert ( fig 4). I tillegg, beta-catenin inhibitorer p53 (fosforylerte p53, p-p53) og p21, en direkte nedstrøms mål for p53, ble øket i respons til SBP1 induksjon i mus TetSBP1 tumorer (figur 4). Tredje, induksjon av SBP1 ført til en betydelig reduksjon av TWIST (fig 4), en kritisk regulator for EMT og metastasering.
Flere typiske markører for ulike signalveier ble undersøkt ved hjelp av iTRAQ proteomikk analyse proteinprøver. Disse kreftrelatert signalveier reagerer forskjellig på SBP1 induksjon.
Diskusjoner
Redusert uttrykk for SBP1 har blitt observert i flere typer kreft hos mennesker, inkludert tykktarms, lunge, spiserøret, mage, bryst og leverkreft, og reduksjonen av SBP1 er assosiert med dårlig overlevelse [5]. Nedgang på SBP1 økt cellemotilitet, fremmet celleproliferasjon, og undertrykt celledifferensiering
in vitro
, selv musene med SBP1 genetisk defekt (dvs. SBP1 knockout mus) ikke viser åpen fenotyper [3,27,28]. I motsetning til dette øker SBP1 ekspresjon i celler ved transfeksjon av SBP1-uttrykkende plasmid kunne fører til begynnende alderdom, inhibering av kreftcellevekst, migrasjon og tumorvekst hos immunkompromitterte mus [3,13,29,30]. Våre tidligere studier har vist at SBP1 ble redusert i de fleste tykktarmssvulster i forhold til nontumor vev, mens det har variable uttrykk nivåer i ulike kreftcellelinjer [6,13,29]. For eksempel er SBP1 høyt uttrykt i LS174T, Caco-2, HT-29 og MCF-7, men ikke påvises i HCT116. Så menneskelig tykktarmskreft cellelinje HCT116 ble brukt til å overuttrykker SBP1 i vår studie. I denne studien, ved hjelp av et induserbart system og mus xenograft modell, har vi funnet at
in vivo
induksjon av SBP1 viste betydelige anti-kreft effekt, blant annet hemmet tumorvekst og metastase i nakne mus. Fordelene med å bruke denne SBP1 Tet-on induserbar genekspresjon system er oppført som følger: 1) Et induserbart gene expression system gjør SBP1 overekspresjon styrbar, og dermed blir cellene opprettholdes uten SBP1 innblanding og transfeksjon skaden kan minimaliseres ved overekspresjon er nødvendig; 2) I denne studien har SBP1 uttrykk ingen tag modifikasjon og uttrykte protein forblir i naturlig tilstand. Alle disse observasjon antydet at både endogene og ektopisk SBP1 kan tjene som en potensiell tumor suppressor.
For å finne de underliggende molekylære mekanismer, den proteomikk teknikk iTRAQ etiketten analysen ble ansatt. Blant de 1975 identifiserte proteiner, ble 132 proteiner forskjellig uttrykt i SBP1-indusert tumorvevet. Videre analyser snevret ned differensielt uttrykte proteiner i tretten lipidmetabolismen relaterte og syv glukosemetabolismen relaterte proteiner. Blant de tretten lipidmetabolismen relaterte proteiner, fem ble oppregulert (DKK1, hsp60 DHCR7, ANXA4 og AGPAT5) og åtte ble nedregulert (LPCAT2, GPX5, GAPDH, NMe2, ALDH2, BPIFA3, PPIA og FABP4). I de oppregulert proteiner ved SBP1 induksjon, er DKK1 kjent som en inhibitor av Wnt /β-catenin veien [18]. Oppregulering av DKK1 kunne aktiv juni N-terminal kinase (JNK) og indusere apoptose [31,32], og kan ha negativ regulere EMT gjennom TWIST hemming [33]. Faktisk har våre tidligere studier har vist at aktivert JNK1 kan også negativt regulere β-catenin gjennom GSK3-beta [34]. I tillegg kan den økte ekspresjon av DKK1 fører til nedregulering av Cyclin D1, en direkte nedstrøms mål for beta-catenin. Vår tidligere arbeid har også vist en regulerende samspill mellom JNK1 og p21 [35]. Heri har vi funnet at som en reaksjon på den oppregulering av DKK1 og JNK1, p21 og dens oppstrøms mål p53 ble også øket (figur 4). Interessant, i Wnt /p-catenin signalveien, er det en negativ regulatorisk interaksjonen mellom p-catenin /Cyclin D1 og p53 /p21 [36]. Blant de validert lipidmetabolismen relaterte proteiner, ANXA4 var oppregulert og PPIA ble nedregulert. Det har blitt rapportert at ANXA4 kunne undertrykker NF-kB transkripsjonen aktivitet ved å samhandle med NF-kB p50-subenhet [20] og cytokiner (for eksempel IL-8 [37]). I motsetning til dette kunne PPIA aktiv NF-kB veien og inflammatorisk signalering [24]. Tallrike studier har sterkt vist at aktivering av NF-kB og kronisk betennelse spiller avgjørende roller i kreft dannelse og progresjon [38]. En annen downregulated protein var FABP4. Det har blitt rapportert at FABP4 formidler VEGFA-avhengige pro-angiogene effekter, som er knyttet til HAKK signalering under kreftutvikling og metastasering [25].
Alle de syv glukosemetabolismen relaterte proteiner ble nedregulert i SBP1 indusert-svulstvev , inkludert GAA, GAPDH, ALDH2, thioredoxin, ENO3, UGDH og Lumican. UGDH (UDP-glukose-dehydrogenase) katalyserer oksidasjon av UDP-glukose til dannelse av UDP-glukuronsyre, en forløper av hyaluronsyre (HA) og andre glykosaminoglykaner (GAG) i ekstracellulær matriks. En tidligere studie har vist at avtagende UGDH hemmer celle aggregering og migrasjon [39]. Videre ble det rapportert at ALDH2 inaktivering kan øke cytotoksisiteten produsert av lipidperoksidasjon [40]. Disse resultatene antydet at nedregulering av UGDH og ALDH2 kanskje tilskrives kreft effekter av SBP1.
I sammendraget, ved hjelp av et SBP1 induserbar system og
in vivo
musemodell, våre studier har klart vist at tumor hemming roller SBP1 er forbundet med endringer av lipid /glukosemetabolismen relaterte proteiner gjennom involvering av flere signalveier, avslører en ny molekylære mekanismen for tumor hemming av SBP1. Den mulige funksjonelle sammenhengen mellom SBP1 og dens target-proteiner er illustrert i figur 5. Det bør bemerkes at endringer av disse proteiner ved SBP1 induksjon kan være forårsaket av en eller flere av de lipid /glukosemetabolisme-relaterte proteiner, slik som DKK1,
