Abstract
stromale celler som myofibroblasts påvirke tumorprogresjon. De mekanismer er uklare, men kan innebære effekter på både tumorceller og rekruttering av benmarg-avledede mesenchymal stromale celler (MSC) som deretter kolonisere tumorer. Bruke iTRAQ og LC-MS /MS vi identifisert adipokin, chemerin, som overexpressed i spiserøret plateepitelkreft kreft forbundet myofibroblasts (CAM) sammenlignet med tilstøtende vev myofibroblasts (minibanker). Den chemerin reseptoren, ChemR23, uttrykkes ved MSC. Kondisjonert medium (CM) fra CAM-enhetene betydelig øket MSC cellevandring i forhold til ATM-CM; virkningen av CAM-CM ble betydelig redusert ved chemerin-nøytraliserende antistoff, forbehandling av CAM med chemerin siRNA, forbehandling av MSC med ChemR23 siRNA, og etter en ChemR23 reseptor antagonist, CCX832. Stimulering av MSC ved chemerin økt fosforylering av p42 /44, p38 og JNK-II-kinaser og hemmere av disse kinaser og PKC reverseres chemerin stimulert MSC migrasjon. Chemerin stimulering av MSC også indusert ekspresjon og sekresjon av makrofager inhibitorisk faktor (MIF), som hadde en tendens til å begrense trekk respons på lave konsentrasjoner av chemerin, men ikke høyere konsentrasjoner. I en xenograft modell bestående av OE21 esophageal kreftceller og CAM, homing av MSC administrert intravenøst ble hemmet av CCX832. Dermed chemerin utskilt fra spiserørskreft myofibroblasts er en potensiell kjemotiltrekkende for MSC og dens hemming kan forsinke tumorprogresjon
Citation. Kumar JD, Holmberg C, Kandola S, Steele jeg, Hegyi P, Tiszlavicz L, et al . (2014) økt uttrykk av Chemerin i Plateepitel spiserørskreft myofibroblasts og rolle i rekruttering av Mesenchymale stromale celler. PLoS ONE 9 (8): e104877. doi: 10,1371 /journal.pone.0104877
Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 6 mai 2014; Godkjent: 15 juli 2014; Publisert: 15 august 2014
Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Cancer Research UK (AV), NIHR (AV), National Institute of Health /NCI (5U54CA126513, TCW, AV) og ungarske Scientific Research Fund (NF100677, PH), Wellcome Trust (AV, CH, SK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. TC og MP er honoreres ansatte i ChemoCentryx. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne har ingen interessekonflikter.
Innledning
Betydningen av svulsten mikromiljøet ved fastsettelse kreft celle vekst og spredning er nå godt anerkjent [1]. Stromal celletyper som bidrar til mikromiljøet inkluderer inflammatoriske og immunceller, endotelceller, pericytes og fibroblast celle linjene [2]. I tilfelle av den sistnevnte en økende mengde av bevis indikerer at kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), hvorav myofibroblasts er en fremtredende subtype, avviker fra deres motstykker i normalt vev [3], [4], [5]. Det er også en økende forståelse for at benmargs avledet mesenkymale stamceller (stromale) celler (MSC) kan påvirke kreft progresjon ved migrering til tumor steder hvor de kan skille ut en rekke celletyper, inkludert myofibroblasts [6], [7]; De kan også være nyttige som kjøretøyer for å gi målrettet anticancerterapi [8]. Selv om det er bevis for chemokin engasjement i MSC rekruttering mekanismene fortsatt dårlig forstått [9], [10].
Esophageal kreft anses å utgjøre nesten en halv million dødsfall i året på verdensbasis. Adenokarsinom, assosiert med reflux og fedme oppstår på bakgrunn av Barretts øsofagus og øker i forekomst i vestlige samfunn; esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er assosiert med røyking, alkoholinntak og dårlig kosthold, og er av høy forekomst i utviklingsland [11]. Det er en økende forståelse av rollen til kafeer /myofibroblasts i ESCC særlig i å fremme kreft invasjon og angiogenese men generelt disse forbli dårlig forstått [12], [13].
Chemerin (tazarotene indusert gen 2, TIG2 ; retinsyrereseptor responder 2, RARRES2) er et 18 kDa kjemokin-lignende protein som virker ved ChemR23 (kjemokin-like receptor 1, CMKLR1) [14], [15]. Det utskilles som en inaktiv forløper som blir aktivert av en rekke ekstracellulære proteaser som fjerner et C-terminalt heksapeptid for å frigjøre et 157 aminosyre aktive form; det er uttrykt i adipocytter, lever og placenta og har roller i adipogenesen og leukocytter chemotaxis inkludert rekruttering av dendrittiske og naturlig killer (NK) celler til områder av betennelse eller kreft [16], [17], [18], [19] . I denne studien identifiserte vi økt uttrykk av chemerin i ESCC kreft-assosiert myofibrobroblasts (CAM) sammenlignet med tilstøtende vev myofibroblasts (minibanker), og fant uttrykk for kognatreseptoren ChemR23 av MSC. Vi hypotese derfor at chemerin fungerer som en MSC kjemotiltrekkende og vi presenterer her bevis for å støtte hypotesen.
Materialer og metoder
Cells
myofibroblasts ble samlet inn svulster og tilstøtende vev av pasienter med ESCC bruker tidligere beskrevne metoder (Tabell S1 i File S1) [20], [21], og ble brukt mellom passasjer 3 og 10. Dette arbeidet ble godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Szeged, Ungarn og alle fag ga informert samtykke. ESCC celler (OE21) og humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Menneskelig benmarg avledet stamceller ble brukt på passasjer 3-12 i sin udifferensiert tilstand; opp til passering 12 de utstilt adipocyte, osteocyte og chondrocyttransplantasjon differensiering i fettceller, osteocyte og chondrocyttransplantasjon differensiering media (Lonza, Cambridge, UK); cellene var CD105, CD166, CD29, CD44, α-SMA og vimentin positive og var CD14, CD34, CD45, cytokeratin og desmin negative.
Cell Culture
myofibroblasts ble dyrket som tidligere beskrevet [20]. MSC ble opprettholdt i en udifferensiert tilstand i MSCGM (Lonza) inneholder basal medium og MSC veksttilskudd. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% volum /volum CO
2; HUVECs ble opprettholdt i EGM medium og ble brukt på passasjer 5 til 9; OE21 celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% volum /volum FBS, 1% volum /volum penicillin-streptomycin, 2% volum /volum L-glutamin.
kondisjonerte medier
myofibroblasts (1,5 x 10
6 celler) ble sådd ut i T-75 Falcon-kolber og holdt ved 37 ° C i 5% volum /volum CO
2 i 24 timer i fullstendig media (FM). Kulturene ble deretter vasket 3 ganger med sterilt PBS og inkubert i 15 ml serumfritt (SF) medier i 24 timer. Kondisjonert medium (CM) ble samlet, sentrifugert (7 minutter, 800 x g, 4 ° C) og aliquoter ble lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Immunocytochemistry
Celler ble paraformaldehyd (PFA) -Fast (4% vekt /volum), permeabilised med 0,2% Triton X-100 i PBS (PBS-T) i 30 minutter og behandlet for immunocytokjemi som tidligere beskrevet [22] ved hjelp av primære antistoffer mot CD105, CD34, CD29 (Ancell Corporation, Bayport, MN), α-SMA, vimentin, desmin, pancytokeratin (Fitzgerald, New Jersey), ChemR23 (Millipore, MA,) eller GPR1 (Abcam, Cambridge, UK), etterfulgt av inkubering med det passende fluorescein eller Texas Red merkede sekundære antistoffer dannet i esel (Jackson Immunoresearch, Soham, UK), og montert med Vectashield
® inneholder DAPI (Vector Laboratories, Peterborough, UK). Lysbilder ble sett ved hjelp av en Zeiss Axioplan-2 mikroskop (Zeiss Vision, Welwyn Garden City, UK). Bilder ble tatt med et JVC-3 CCD kamera på 40 x forstørrelse med KS300 programvare (Imaging Associates, Bicester, Oxfordshire, UK).
proteomikk analyse
secretome av esophageal myofibroblasts ble undersøkt etter iTRAQ merking av proteiner i mediet, etterfulgt av LC-MS /MS som tidligere beskrevet (se Methods S1) [3]. Putative chemerin mål i MSC ble det søkt etter SILAC merking av celler fulgt av eksponering til chemerin (R .. D Systems) ble påført myofibroblast media i henhold til produsentens instruksjoner
Cell migrasjon analyser
Transwell migrasjon analysene ble utført ved hjelp av BD innsatser (BD Bioscience, California) som tidligere beskrevet [25] ansette chemerin (R Köln, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver transfeksjon anvendte 2 mikrogram av DNA (5 x 10
5-celler) og 100 ul av fullstendig Nucleofector løsning. Transfeksjon ble oppnådd ved å bruke programmet U-23 (for høy transfeksjonseffektivitet) ved å tilsette 500 ul av den forvarmes kulturmedium til kyvetten og overføring av prøver til T-75 kolber med 20 ml nylaget medium.
MSC homing å xenografter
Alle dyreforsøk ble gjennomført etter godkjennelse fra University of Liverpool Animal Welfare Committee og var i samsvar med de britiske Dyr (Scientific Procedures) Act 1986 (PPL 40/3137) .For studie MSC rekruttering til xenotransplantater ble 6-8 uker gamle immunsupprimerte BALB /c nu /nu mus (Charles River, Wilmington, MA) injiseres sc med OE21 celler (10
6) alene eller sammen med CAM (5 × 10
5). Mus med tumorer av sammenlignbar størrelse (1,0-1,2 cm diameter) mottok deretter CCX832 (2 mg /ml, 125 ul, iv), eller bærer, etterfulgt etter 24 timer ved en andre dose og MSC merket med PKH67 (7,5 x 10
5). Etter 24 timer ble tumorene dissekert, fiksert i 4% PFA og behandlet for lokalisering av fluorescerende celler.
statistikker og
De endelige resultatene ble beregnet som middelverdi ± standardavvik av middel (SEM). Student t-test og ANOVA ble utført på data som er hensiktsmessig med betydning på p≤0.05 hjelp Systat Software Inc. (London, UK) med mindre annet er oppgitt.
Resultater
Økt chemerin uttrykk i plateepitel esophageal CAMS
myofibroblasts identifisert av α-SMA uttrykk ble funnet i større antall og utstilt forstyrret morfologi og arkitektur i ESCC sammenlignet med tilstøtende vev (fig S1 i File S2). Helstøpt myofibroblasts fra disse svulstene og tilstøtende vev uttrykt α-SMA og vimentin, men ikke desmin eller cytokeratin; CM fra CAM stimulert vekst og migrasjon av OE21 celler sammenlignet med ATM-CM (figur S2, S3 i File S2). Bruke iTRAQ merking fulgt av LC-MS /MS for å identifisere potensielle cellesignalmolekyler skilles ut av CAM, fant vi økt chemerin overflod i CAM media sammenlignet med ATM fra alle fire par ESCC prøver (fig S4 i File S2, Tabell S3 i File S1). Western blotting bekreftet økt chemerin i CAM sammenlignet med ATM media (fig 1A), og ELISA medier antydet 2,1 ± 0,4 ganger høyere chemerin sekresjon av CAM
vs
minibanker. I celleekstrakter, Western blot viste beskjeden, men signifikant forhøyet chemerin i CAM sammenlignet med sine sammenkoblede minibanker (Fig S5 i File S2). En antatt chemerin reseptoren, ChemR23, ble uttrykt ved MSC (se nedenfor), og chemerin stimulert konsentrasjonsavhengig migrering av MSC i to forskjellige analyser (figur 1B). Videre CAM-CM stimulert MSC migrasjon og responsen var betydelig større enn til ATM-CM (figur 1C, venstre). Direkte bevis for en rolle chemerin som en aktiv komponent i CAM-CM ble gitt av den observasjon at immunoneutralisation av chemerin inhiberte virkningen av CAM-CM (figur 1C, center); i tillegg, siRNA knockdown av chemerin uttrykk redusert aktivitet av CM senere brukt til MSC i migrasjonsanalyser (figur 1C, høyre, figur S6 i File S2)
A
.. Representant Western analyse av chemerin i media fra ESCC CAM og minibanker (til venstre). Kvantitativ analyse ved densitometri av chemerin overflod i media fra ESCC CAM og minibanker (n = 4 forskjellige par myofibroblasts) (til høyre).
B
. Konsentrasjonsavhengig stimulering av MSC migrasjon av chemerin i bunnen av såret migrasjonsanalyser (til venstre) og Boyden kammeret migrasjon analyser (høyre) (n = 3).
C
. Økt migrasjon av MSC i Boyden kamre i respons til betinget media (CM) fra CAM og deres respektive minibanker (venstre) (n = 4 forskjellige par av myofibroblasts). Stimulering av MSC migrasjon av CAM-CM ble hemmet av chemerin nøytraliserende antistoffer (Chem.Ab, 10 mikrogram /ml) (i midten). MSC migrering ble redusert som svar på CM fra CAM1 og CAM4 celler transfektert med chemerin siRNA # 3 (til høyre). Horisontale piler, p. 0,05, t-test (n = 3)
ChemR23 uttrykkes av MSC formidler trekkende responser på chemerin
Uttrykket i MSC av den antatte chemerin reseptoren, ChemR23, er blitt identifisert av genet matrisen [28], og vi bekreftet ekspresjon av dette og en andre antatte reseptor, GPR1 [29], ved immunocytokjemi. Knockdown av siRNA av ChemR23 (figur 2A, venstre; fig S7 i File S2) vesentlig hemmet vandrende svar på både chemerin (Fig 2A, midten) og CAM-CM (figur 2A, høyre), mens knockdown av GPR1 hatt liten effekt. En ChemR23 antagonist, CCX832, doseavhengig hemmet MSC migrasjon som svar på chemerin (figur 2B, venstre og senter) og CAM-CM (figur 2B, høyre) mens en inaktiv analog, CCX826 hadde ingen effekt; hemming av CAM-CM av CCX832 var lik den som oppnås ved immunoneutralisation (figur 2B, høyre).
En
, Representasjons bilder fra MSC farget for vimentin (positiv kontroll) og chemR23 avslørende knock-down (KD) etter ChemR23 siRNA behandling (til venstre). Knockdown av ChemR23, men ikke GPR1, hemmet MSC migrasjon som svar på chemerin (100 ng /ml) (i midten) og CAM-CM (til høyre).
B
, konsentrasjonsavhengig inhibering av migrering MSC i respons til chemerin ved ChemR23 antagonisten CCX832 (til venstre), men ikke kontrollforbindelsen CCX826 (1 uM) (i midten). MSC migrering som reaksjon på CAM-CM ble inhibert på lignende måte ved chemerin nøytraliserende antistoff, og CCX832, men ikke CCX826 (1 uM) (til høyre).
C
, Representasjons Western blot viser økt fosforylering av p42 /44, p38 og JNK-II kinaser i MSC behandlet med chemerin (100 ng /ml) (til venstre). I Boyden kammer analyser, ble chemerin-stimulert MSC migrering inhibert av JNK-II-inhibitor, SP600125 (50 uM), p42 /44 inhibitor, UO126 (10 uM), p38 inhibitor SB202190 (3 uM), og den PKC-inhibitoren Ro320432 (2 uM), men ikke ved PIK3 inhibitor LY294002 (50 pM) (til høyre). Horisontale piler, p 0,05, ANOVA (n = 3 i hvert tilfelle)
Chemerin stimulering av protein kinase pathways formidler mellom MSC trekkende responser
Chemerin omgå økt fosforylering av flere protein kinaser. inkludert p42 /44, p38 og JnkII kinaser i MSC (figur 2C, venstre). Inhibitorer av alle tre kinaser betydelig redusert vandrings responsen av MSC til chemerin men hemming av PI-3-kinase ved hjelp av LY294002 hadde ingen effekt. PKC-inhibitoren Ro320432 også hemmet migrasjon, og kombinasjonen av Ro320432, U0126, SP600125 og SB202190 fullstendig hemmet trekkende responser (figur 2C, til høyre). Bevis for at PKC-aktivering var oppstrøms MAP kinase stimulering er anordnet ved den observasjon at PMA stimulert MSC migrasjon og dette ble inhibert ved U0126, SP600125 og SB202190; Videre PMA stimulert fosforylering av p42 /44, p38 og JnkII kinaser (fig S8 i File S2). Det var en markert reduksjon i fosforylering av p42 /44, p38 og JnkII kinaser etter ChemR23 knockdown ved hjelp av siRNA forenlig med ideen om at disse kinaser er nedstrøms ChemR23 (Fig S8 i File S2).
Chemerin øker MIF uttrykk i MSC som begrenser migreringen
for ytterligere å definere antatte målene for chemerin vi anvendt SILAC og LC-MS /MS til identifisering av proteiner i celleekstrakter og medier fra MSC behandlet med chemerin i 24 timer. Uventet, MIF ble økt i chemerin-stimulerte celler (tabell S4 i File S1, Fig S9 i File S2). Western blot bekreftet at chemerin, samt IGF-II anvendt som en positiv kontroll, økt MIF i celleekstrakter og medier (figur 3A, til venstre), og ved hjelp av ELISA var der ca. 10 ganger høyere MIF-konsentrasjoner i mediet etter chemerin behandling. Etter ChemR23 knockdown MIF svar på chemerin var dypt hemmet (figur 3A, senter). I nærvær av MIF ble MSC vandrings respons på chemerin inhibert med omtrent 50% (figur 3A, til høyre). For å bestemme den funksjonelle betydningen av MIF i MSC migrasjon vi ansatt MIF antagonist ISO-1; Dette undertrykt effekten av MIF i begrenser chemerin stimulert MSC migrasjon, og betydelig økt vandrende responsen av MSC til chemerin (Fig 3B). Tilsvarende MIF knockdown (fig S10 i File S2) økte MSC migrasjon som respons på lave konsentrasjoner av chemerin (4 ng /ml), men interessant responsen på chemerin ved høyere konsentrasjoner (20 ng /ml) ble ikke påvirket av MIF knockdown ( fig 3C)
En
, Representative vestlige blotter viser MIF i MSC media (øverst til venstre) og celleekstrakter (nederst til venstre) som ble behandlet med chemerin (Ch;. 100 ng /ml) eller IGF -II (100 ng /ml) i 15 min. ChemR23 knock-down redusert MIF meldingen som svar på chemerin (i midten). Chemerin-stimulert MSC migrering ble inhibert med MIF (200 ng /ml) (til høyre).
B
, bekjempelse av MIF signalering med ISO-I (50 mm) ytterligere økt chemerin stimulert migrasjon.
C
, MIF knock-down i MSC økt migrasjon som reaksjon på 4 ng /ml, men ikke 20 ng /ml chemerin. Horisontale piler, p 0,05, t- test (n = 3)
Chemerin stimulerer MSC migrasjon over endotelceller og krever MMP-2
Dataene implisere chemerin i rekrutteringen. av MSC til cAM-holdige kreft microenvironments.
In vivo
dette krever transendothelial migrasjon og så vi undersøkt om chemerin var i stand til å stimulere MSC migrasjon gjennom et monolag av endotelceller tidligere lå på Boyden kamre. MSC merket med PKH67 (figur 4A, til venstre) ble identifisert som migrerer som reaksjon på chemerin (figur 4A, i midten) og CAM-CM (figur 4A, til høyre), og den vandrende responsen ble inhibert med CCX832 men ikke CCX826. Utskilte proteaser som kan legge til rette for transendothelial migrasjon ble deretter søkt i protein listene hentet fra SILAC-merket MSC behandlet med chemerin. Rikelig MMP-2 ble identifisert i chemerin stimulert prøver (Tabell S5 i File S1) og vestlige blotter (fig 4B, venstre) og MMP-2 enzymet aktivitetsanalyser (fig 4B, høyre) bekreftet økt overflod i media i chemerin. I migrasjon studier, tilsetting av MMP-2 stimulert MSC migrasjon, og dette ble betydelig redusert ved en MMP-2-hemmer (fig 4C venstre). Det samme hemmer også betydelig redusert MSC transendothelial migrasjon som svar på chemerin (fig 4C, høyre).
En
, Representasjons felt fra MSC transendothelial migrasjons eksperimenter viser migrasjon av PKH67-merket MSC (venstre ). CCX832 (1 mm) hemmet chemerin- (i midten) og CAM-CM stimulert MSC transendothelial migrasjon men CCX826 (1 mm) hadde ingen effekt (til høyre).
B
, Chemerin, og IGF-II brukes som en positiv kontroll, raskt (30 min) stimulert proMMP2 overflod i media som oppdaget av Western blot, men hadde ingen effekt på celle proMMP2 overflod (til venstre); chemerin økte signifikant MMP-2-enzymaktivitet i MSC media detekteres av den selektive substratet MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH
2 (til høyre).
C
, Human rekombinant MMP-2 (80 ng /ml) stimulerte transendothelial migrasjon, og det var doseavhengig hemming av en MMP-2 selektiv hemmer (MMP-2 inhibitor I) (til venstre). MMP-2-hemmer (60 mm) betydelig hemmet chemerin stimulert MSC transendothelial migrasjon (i midten). Horisontale piler, p 0,05, t- test (n = 3)
I en xenograft modell, MSC homing er stimulert av CAM og hemmes av CCX832
På grunnlag av. de data som er beskrevet ovenfor, vi hypoteser om at
in vivo
chemerin medierer MSC homing til svulster består av kreftceller og CAM. I en xenograft modell av OE21 celler i hårløse mus, matchet svulster av samme størrelse (1,0-1,2 cm diameter) generert med og uten samtidig bruk av CAM ble studert etter påfølgende i.v. injeksjon av PKH67-merket MSC. Merkede celler i xenotransplantater ble øket i svulster i OE21 og CAM sammenlignet med OE21 celler alene (figur 5A). Forbehandling av mus med ChemR23 antagonist CCX832 før injisering MSC betydelig redusert antall merkede celler i xenografter og dermed viser en rolle for chemerin i MSC rekruttering
in vivo plakater (figur 5B).
En
, Visualisering av PKH67-merket MSC i representative felt fra xenografter etablert med OE21 kreftceller alene eller co-injisert med CAM etterfulgt av behandling med bilen (øverst) eller CCX832 (nederst) og iv injeksjon av PKH67- merket MSC.
B
, In xenografter med OE21 kreftceller og CAM Det var økt MSC homing uttrykt i merkede celler per arealenhet av xenograft sammenlignet med xenografter av OE21 kreftcelle alene; behandling med CCX832 hemmet homing (OE21 /kjøretøy, n = 3; OE21 /CCX832, n = 4, OE21 og CAM /kjøretøy, n = 6; OE21 og CAM /CCX832, n = 6). Horisontale piler, p 0,05, ANOVA
Diskusjoner
Det er økende bevis for at MSC migrere til svulster hvor de bidrar til tumorvekst [6], [30].. Mekanismene for homing og migrasjon forbli ufullstendig forstått. I denne studien gir vi bevis på at ekspresjon av kjemokin-lignende peptid, chemerin, økes i CAM fra ESCC og fungerer som en kjemoattraktant for MSC via aktivering av G-proteinkoblet reseptor ChemR23. Et lite molekyl antagonist av ChemR23, CCX832, hemmet virkningen av chemerin både
in vitro Hotell og i en xenograft modell
in vivo
. Funnene identifisere chemerin som en roman CAM-avledet determinant av MSC rekruttering til svulster.
Tidligere studier har rapportert en rekke ulike roller for kafeer, CAM og relaterte celler i progresjon og effekten av behandlingen av en rekke cancere så som prostata, bryst, mage, lunge og tykktarm [2], [31], [32], [33], [34], [35]. Kammene anvendt for de foreliggende studier var avledet fra svulster i hvilken myofibroblast nummer, arkitektur og morfologi ble forstyrret; dessuten CM fra disse CAM vakte en mer aggressiv fenotype i kreftceller (spredning, migrasjon) sammenlignet med CM fra minibanker. Mer generelt er handlingene til myofibroblasts rapportert å være både positiv og negativ på kreftcelle proliferasjon og migrering, og det er også effekter på angiogenese, og modulering av immunmekanismer [3], [12]. Men mens MSC homing til kreftformer er anerkjent, har den spesifikke rollen myofibroblasts i denne prosessen vært uklar. De foreliggende data tyder ikke akkurat på at CAM er aktive deltakere i MSC rekruttering, men også at en bestemt megler, chemerin er forskjellig uttrykt i CAM og minibanker.
Chemerin fremkommet gjennom en proteomikk studie av myofibroblast secretomes. Det er økende interesse for bruk av proteomikk studier for å definere secretomes av stromale celler, men selv så disse forblir mindre godt studert enn kreft celle secretomes. Tidligere secretome studier på begge fibrinoblast avstamning celler og MSC har identifisert noen av de molekylene som finnes i denne studien særlig ECM proteiner, MMP, IGFBP; signalmolekyler som er identifisert i disse studiene inkluderer SDF-1, HGF, EGF og andre kjemokiner [36], [37]. Vår første identifisering av chemerin ble gjort i alle fire par celler undersøkt og ble validert av Western blot og ELISA av media som sammen indikerer at chemerin bør betraktes som en roman formidler av myofibroblast cellesignalisering.
Chemerin normalt uttrykt av adipocytter, lever, lunge og andre celler. I en rekke kreftformer, inkludert skvamøse hudkreft, melanom, prostata, lunge, bryst og hepatocellulært karsinom, gått ned chemerin ekspresjon er assosiert med uheldige utfall. Det er imidlertid verdt å merke seg at tidligere arbeid har ikke, for det meste, tatt hensyn til ulike mønstre for ekspresjon av chemerin i tumor epitelceller i forhold til stromale celler [18], [38]. Siden chemerin er en kjemoattraktant for NK-celler og dendrittiske celler [14], [16], [19] er det foreslått at tap av chemerin tillater tumorer for å unngå immunforsvarsmekanismer som inhiberer tumorigenesis [18], [38], [ ,,,0],39]. Imidlertid kan esophageal celler gi en tolerogene miljø [40] som begrenser den beskyttende effekten av chemerin. Videre, i magekreft det er økt plasma chemerin og chemerin stimulerer kreftcelle invasjon
in vitro product: [41]. Dermed kan chemerin utøve både positive og negative effekter på tumorprogresjon.
Det er flere mulige roller for chemerin utgitt av CAM inkludert modulering av kreft og immuncellefunksjon og angiogenese. Vi fant at den kognatreseptoren ChemR23 ble uttrykt av MSC og det chemerin var en kjemoattraktant for disse cellene. Siden reseptor knockdown, immunoneutralisation og en ChemR23 reseptorantagonist bare delvis hemmes effektene av CAM-CM, er det også sannsynlig å være andre CAM kjemoattraktanter. Vi foreslår chemerin er en god kandidat for videre studier ikke minst på grunn av tilgjengeligheten av reseptorantagonister. Mekanismene for kjemotaksi inkludere aktivering av PKC og av flere nedstrøms-kinase-reaksjonsveier inkludert p42 /44, p38 og JNK-II-kinaser, som alle synes å spille en rolle. I det minste delvis disse intracellulære signalmekanismer kan ligne dem som er beskrevet i andre celler som utviser chemerin-stimulert kjemotakse inkludert dendrittiske celler [14].
Tidligere studier har vist at en rekke vekstfaktorer og kjemokiner stimulere MSC migrering inkludert HGF, TNFa, SDF-1, CXCL12, CXCL13, CHCL16 og CCL22 [42], [43]. MSC transmigrere tvers endothelia av chemokin-medierte mekanismer som også involverer matriksmetalloproteinaser særlig MMP-2 [43], [44], [45], [46], [47]. Vi fant hurtig (30 min) stimulering av proMMP-2 sekresjon av MSC i respons på chemerin og en rolle for MMP-2 i å tilrettelegge chemerin-stimulert transendothelial migrasjon, antagelig etter aktivering av andre ekstracellulære proteaser slik som MMP-14 [45].
Det er kjent at MIF inhiberer MSC migrasjon [48], [49]. De foreliggende data tyder på at konsentrasjonsavhengig induksjon av MIF i MSC ved chemerin handlinger for å begrense migrasjon. Imidlertid er den hemmende virkning svekkes ved høye konsentrasjoner av chemerin. En implikasjon er at kontroll myofibroblasts, hvor chemerin uttrykk er beskjeden, ikke effektivt fremme MSC rekruttering på grunn av autoinhibitory handlingen av MIF; men i CAM der det er økt chemerin, er kapasiteten for MSC rekruttering forbedret siden autoinhibitory effekten av MIF er overvunnet.
ChemR23 antagonist CCX832 har tidligere blitt brukt til å definere nye interaksjoner mellom perivaskulær adipocytter og vasokonstriksjonseffekter svar [ ,,,0],26]. Vi viser nå både
in vitro Hotell og
in vivo
i en xenograft modell som CCX832 hemmer MSC migrasjon som svar på CAM. Enten chemerin påvirker MSC differensiering etter rekrutteringen til kreft gjenstår å fastslå. Det ville ikke være overraskende hvis det gjorde det, siden det er kjent for å stimulere mesenchymale stamceller adipogenesen [17], [50]. Samlet sett dagens data indikerer chemerin er en roman potensiell regulator av kreft progresjon ved å målrette MSC rekruttering og foreslå muligheten for å bruke ChemR23 reseptorantagonister å regulere denne prosessen.
Hjelpemiddel Informasjon
Metoder S1.
supplerende metoder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s001 product: (PDF)
Fil S1.
Utfyllende tabeller. Tabell S1 til tabell S5
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s002 product: (PDF)
Fil S2.
Utfyllende tall. Figur S1 til figur S10
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s003 product: (PDF)
Takk
Vi er takknemlige til Professor Rod Dimaline for nyttige diskusjoner, Biomedical Tjenesten Unit, University of Liverpool for å få hjelp med xenografter og kirurger fra kirurgisk avdeling, Universitetet i Szeged for å gi kirurgiske prøver.
