Abstract
Bakgrunn
Østrogen (E2) og progesteron (P4) er sentrale aktører i modningen av den menneskelige endometrium. De tilsvarende steroid hormon modulatorer, tamoxifen (TAM) og mifepriston (RU486) er mye brukt i brystkreft terapi og for prevensjon formål, henholdsvis.
metodikk /hovedfunnene
Gene uttrykk profilering av human endometrial cancer Ishikawa-cellelinjen ble behandlet med E2 og P4 i 3 timer og 12 timer, og TAM og RU486 i 12 timer, ble utført ved anvendelse av RNA-sekvensering. Høye nivåer av mRNA ble oppdaget for gener, inkludert
PSAP, ATP5G2, ATP5H
, og
GNB2L1
følgende E2 eller P4 behandling. I alt 82 biomarkører for livmor biologi ble identifisert blant E2 indusert gener, og 93 blant P4 responsive gener. Identifiserte biomarkører inkludert:
EZH2, MDK, MUC1, SLIT2, etter og
IL6ST
, som er gener som tidligere i forbindelse med livmor mottakelighet. Videre 98,8% og 98,6% av E2 og P4 responsive gener i Ishikawa celler henholdsvis ble også påvist i to menneskelige mid-sekretorisk endometriebiopsi prøver. TAM behandling oppviste både antagonistisk og agonistiske effekter av E2, og også reguleres en undergruppe av gener uavhengig av hverandre. Cellesyklus regulator cyclin D1 (
CCND1
) viste signifikant oppregulering etter behandling med TAM. RU486 så ikke ut til å fungere som en ren antagonist av P4 og en funksjonsanalyse av RU486 respons identifisert gener relatert til heft og apoptose, inkludert nedregulert gener assosiert med celle-celle kontakter og heft som
CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1, etter og
COL2A1.
Konklusjoner
Vesentlige endringer i genuttrykk ved Ishikawa cellelinje ble oppdaget etter behandlinger med E2, P4, TAM, og RU486 . Disse transkriptom dataene gir verdifull innsikt i potensielle biomarkører knyttet til livmor mottakelighet, og også legge til rette for en forståelse av de molekylære endringer som finner sted i endometriet i de tidlige stadier av brystkreft behandling og prevensjon bruk
Citation. Tamm -Rosenstein K, Simm J, Suhorutshenko M, Salumets A, Metsis M (2013) endringer i transkriptomet av human Livmor Ishikawa Cancer Cell linje indusert av østrogen, progesteron, Tamoxifen, og Mifepristone (RU486) som oppdaget av RNA-sekvensering. PLoS ONE 8 (7): e68907. doi: 10,1371 /journal.pone.0068907
Redaktør: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 3 mai 2013; Godkjent: 07.06.2013; Publisert: 16.07.2013
Copyright: © 2013 Tamm-Rosenstein et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av Tallinn University of Technology (. Målrettet prosjekt nr B611), estisk departementet for utdanning og forskning (målrettet prosjekt nr SF0180044s09.) og Enterprise Estonia (Grant ingen EU30020.)
Konkurrerende interesser:. den forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
eggstokkene steroidhormoner, østrogen (E2) og progesteron (P4), spille viktige roller i å regulere normale funksjoner i menneske endometrium. For eksempel, i løpet av en normal menstruasjonssyklus, proliferasjon, differensiering og degenerasjon av endometrium oppstå i respons til varierende E2 og P4 nivåer. I den proliferative fase, stimulerer E2 spredning av epitel-celler og stromale komponenter av endometrium. I den sekretoriske fase, modulerer P4 kjertel differensiering og en inhibering av østrogen-mediert proliferasjon [1]. Det er i løpet av midten av sekretorisk fase som endometrium oppnår en fenotype forenlig med vellykket embryoimplantasjonen.
En bedre forståelse av biologi og funksjon av menneske endometrium er viktig å øke vår kunnskap om kvinnelig ufruktbarhet, og for utformingen av behandlinger for disse tilstandene. Tilsvarende et søk etter markører for livmor mottakelighet og nye tilnærminger for å forbedre implantasjon priser under ufruktbarhet behandlinger har blitt gjennomført. I de senere år har tallrike studier som involverer mikroarray ekspresjon analyse identifiserte et bredt spekter av gener opp- eller ned-reguleres i den menneskelige endometrium i løpet av tiden embryoimplantasjonen [2] – [10]. Hver studie identifisert mange kandidatgener som antas å være kritisk til embryoet implantasjon prosessen. Men få gener ble konsekvent rapportert.
De genomiske aktiviteter E2 og P4 er i hovedsak mediert av kjernereseptorer. Når E2 eller P4 er bundet til deres reseptorer, kan de binde responselementer i DNA med høy affinitet og regulere transkripsjon av mål-gener. Hos mennesker er det to typer av østrogenreseptorer, ERα og ERβ, og disse er kodet for av separate gener [11], [12]. ERα og ERβ er uttrykt i alle endometriale celletyper gjennom hele menstruasjonssyklusen, og gjennomgår forandringer i ekspresjon og aktivitet. For eksempel er ERα og ERβ uttrykt på et høyere nivå i løpet av proliferativ fase, men utviser lavere aktivitet i den sekretoriske fasen når de er underlagt de undertrykkende effektene av P4. Det er etter den proliferative fase som medierer P4 E2-basert fylling av endometrium mot en tilstand av mottagelighet.
I kontrast med ERα og ERβ, progesteronreseptorene (PRS), PRA og PRB, blir kodet av samme genet (
PGR
), men er transkribert fra forskjellige arrangører. Som et resultat, PRB inkluderer ytterligere 164 aminosyrer ved den N-terminale ende [13], [14]. Begge isoformene er uttrykt i stroma og epitelet av endometrium under den proliferative fase. Men uttrykket av begge reseptorer reduseres kraftig i epitelet i løpet av tidlig til midten av sekretorisk fase [15]. Endometrial mottagelighet synes å være tett forbundet med nedregulering av epiteliale PGRs, mens den opprettholder stroma eneste ekspresjon av PRA under den sekretoriske fase [16]. Ekspresjon av PR-gener i det endometriske kjertel epitel styres av E2 og P4, med E2 induserende PR syntese og P4 å nedregulere ekspresjon av sin egen reseptor [1].
Selektive ER-modulatorer (SERM) har evnen å samvirke med grunnleggende krav som agonister eller antagonister, avhengig av målvevet, og å modulere signaloverføringsveier av E2-responsive gener [17]. For eksempel tamoxifen (TAM) binder seg med høy affinitet til ende kravene, for derved å blokkere virkningen av naturlig E2. På grunn av sin antagonistiske aktivitet av E2 har TAM vært mye brukt i brystcancerterapi. Imidlertid synes en av de mest plagsomme bivirkninger av brystkreft behandlinger med TAM å være dens proliferativ virkning på endometrium [18], [19]. For eksempel, endometrial sykdommer forbundet med TAM behandlinger inkluderer hyperplasi, polypper, karsinomer og sarkomer [20]. I likhet med SERM har selektive progesteron reseptor modulatorer (SPRMs) er utviklet for å motvirke prosessene aktiveres av P4. Mifepriston (RU486) er et P4 antagonist som konkurrerer med endogen P4 for reseptorbinding [21], og blir brukt til å avslutte en tidlig graviditet. RU486 viser også en to-til-ti ganger høyere affinitet mot PRS i forhold til P4 [22].
Den nøyaktige grunnlag for differensial, er vev-spesifikke signaler E2 og P4 fortsatt ikke fullt ut forstått, og en bedre forståelse av E2 og P4 tiltak er nødvendig for å evaluere deres roller i regulering av endometrisk genekspresjon. I denne studien var det humane uterin-avledede epitelial kreft cellelinje, Ishikawa, ble anvendt. Det er en av de mest karakteriserte humane endometriale cellelinjer som er tilgjengelige. Ishikawa-celler ble avledet fra en godt differensiert adenokarsinom av det humane endometrial epitel som uttrykte funksjonelle steroidreseptorer for E2 og P4 [23] – [25]. Som et resultat av denne cellelinjer som representerer en ideell modell for å studere responsen av endometrial epitel for E2 og P4. I denne studien ble high-throughput RNA-sekvensering (RNA-Seq) brukes til studier av E2- og P4-avhengige transcriptomes i en endometrial sammenheng. De steroid hormon reseptor modulatorer, TAM og RU486, ble også brukt til å studere reseptor-avhengig signaloverføring, og for å evaluere agonistisk eller antagonistisk aktivitet i Ishikawa cellelinje. Til slutt ble den betydelige E2- og P4 avhengige gener som er identifisert i Ishikawa-cellelinje analysert i endometriale biopsiprøver tatt ved den mottakelig mid-sekretorisk fase.
Materialer og metoder
Cell Culture
Ishikawa cellelinje ble gitt av Prof. Anneli Stavreus-Evers (Uppsala universitet, Sverige). Celler ble dyrket i DMEM-medium (PAA, Pasching, Østerrike), supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS; PAA) og 1% penicillin /streptomycin (PAA), ved 37 ° C og 5% CO
2. For hormonbehandlinger, ble E2 (β-østradiol) eller P4 (4-pregnen-3,20-dion) tilsatt til kulturmediet til en endelig konsentrasjon på 10
-8 M. steroidhormon modulatorer, tamoxifen (TAM , 4-hydroxytamoxifen) og mifepriston (RU486), ble tilsatt til kulturmedium til en endelig konsentrasjon på 1 pM. Alle Hormoner og midler ble bestilt fra Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Tyskland), med E2 og P4 oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) og TAM og RU486 i etanol (EtOH). Kontrollprøver ble behandlet med bærer bare. For kulturer med hormontilskudd, dekstran-belagt, trekull-behandlet FBS og media uten fenol rødt ble brukt 48 timer før eksperimenter for å unngå mulige hormonlignende aktivitet fenol rødt.
RNA Utvinning
Total RNA ble ekstrahert fra ubehandlede celler og celler etter 3 timer og 12 timer av hormonet behandling ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, USA). Endometriebiopsier ble samlet inn fra to pasienter (alder, 34 og 38 år) med uforklarlig infertilitet behandlet på Nova Vita Clinic. Biopsier ble oppsamlet på dag LH + 7 til LH + 9 i henhold til urineggløsningstester. Vevsprøver ble homogenisert med Tissue lyzer (Qiagen), og total RNA ble ekstrahert fra tidligere formalinfiksert (3,7%) endometriale biopsier ved hjelp av en RNeasy FFPE-kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Studien ble utført på samsvar med lokale etiske standarder og ble godkjent av etikk Review Committee on Human Forskning ved Universitetet i Tartu, med skriftlig samtykke innhentes fra begge deltagerne.
RNA Bibliotek Forberedelse
RNA bibliotek for cellelinje og endometrial prøver ble fremstilt ved hjelp av en Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit (FC-122-1001, Illumina, San Diego, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For cellelinje prøvene, ble mRNA renset ved hjelp av polyA utvalg, og ble senere fragmentert kjemisk. For vevsprøver, ble total RNA oppsamlet uten polyA utvalg og fragmenteringstrinnet ble forkortet basert på den tidligere formalinbehandling av prøvene. I alle prøvene, ble RNA omdannet til enkelt-trådet cDNA ved bruk av tilfeldig heksamer priming. Multiplexing med forskjellige adapter indekser ble utført og kvaliteten på den resulterende bibliotek ble kontrollert ved hjelp av en Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Tyskland).
RNA-Seq og dataanalyse
Single-end (SE ) sekvensering av 75 bp ble utført ved hjelp av en Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, USA). Bowtie programmering ble brukt til å gi en første justering av sekvenser til menneskelige genom 19 (Hg19), med standardinnstillinger som brukes til å finne bare perfekt treff. Sekvensert fragmenter ble justert til
H. Sapiens
referanse genom (Hg19) levert av University of California Santa Cruz (UCSC) Genome leseren ved hjelp av en TopHat v1.2.0 algoritme med standardinnstillingene [26]. Den justert leser ble senere behandlet i transkripsjoner bruker mansjettknapper v1.1.0 [27], med abundances estimerte og analysert for å undersøke ulike uttrykk mønstre mellom cellelinje prøver. Mansjettknapper konstruert et minimum sett av vitnemål til best beskriver leser i datasettet. The Benjamin-Hochberg korreksjon for multippel testing ble påført på P-verdier på vesentlige gener med en falsk oppdagelse hastighet (FDR) verdi på 0,05. Normaliserte RNA-Seq fragment teller indikerer de relative Forekomsten av transkripsjoner ble brukt. Forekomsten ble rapportert i enheter på FPKM (f.eks Fragments Per kilobase av transkripsjon per Millioner av fragmenter kartlagt). Utdatafilene av mansjettknapper ble analysert med Cuffcompare sammen med referanse fra UCSC Tabell Browser (Homo sapiens GRCh37 /Hg19) [28]. Cuffcompare klassifiserer hver utskriften som kjent eller roman. Cuffdiff re-estimater overflod av vitnemål oppført etter Cuffcompare og tester for differensial uttrykk mellom de valgte eksperimenter. Ved et av forsøkene (enten kontroll eller behandling) hadde 0 FPKM, ble log forandring uendelig. Vi uttrykte log endringen i disse tilfellene som 14 for oppregulering og -14 for nedregulering.
Funksjonsanalyse
For den funksjonelle klassifisering av gener som viste betydelige differensial uttrykk profiler i respons på ulike steroid hormon og deres analoge behandlinger, Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) 9.0 programvare (Oppfinnsomhet Systems) ble brukt. IPA transkripsjonsfaktor modulen ble brukt til å forutsi genuttrykk endringer funnet om til potensielle bindinger av ERs og PRS. I tillegg IPA biomarkør analyse filtre identifisert potensielle biomarkører i utvalgte vev.
Data Visualisering
R statistikk (versjon 2.14.0) (https://www.R-project.org/) ble anvendt for å behandle og visualisere resultatene fra mansjettknapper analyser. Beregning av generelle statistikker, inkludert vanlige og unike tilfeller av betydelig påvirket genene, ble utført i R ved hjelp av et egendefinert skript. For heatmap visualiseringer, ble de R pakken gplots (versjon 2.10.1) (https://CRAN.R-project.org/package=gplots) brukes. I tillegg ble forskjeller i FPKM verdiene av de behandlede prøvene versus de ikke-behandlede prøver kalkulert i varmekart. Den største absolutte FPKM forskjellen for hvert gen ble identifisert, og ble brukt til å normalisere FPKM data for hvert gen. Således, de resulterende verdiene ligge mellom -1 og 1, og en verdi på 0 tilsvarer et fravær av endring i forhold til den ikke-behandlede prøve. Basert på disse normaliserte uttrykk verdiene, ble gener plassert i heatmap av hierarkisk clustering.
Resultater
transkriptom av Ishikawa cellelinje før og etter behandling med E2, P4, og Respektive modulatorer
PolyA-utvalgt RNA fra den humane cellelinje endometrial, Ishikawa, ble underkastet SE-sekvensering med 75 basepar lang leser. Referanse målinger for hver prøve ble deretter gjort basert på 8-11 x 10
6 lesninger som ble oppnådd. Målet med dette forsøk var sekvensering for å gi en samlet genekspresjon profil av Ishikawa cellelinje for å identifisere endringer i genekspresjon som forekommer i løpet av den tidlige responsen av denne cellelinje for steroidhormoner og deres modulatorer. Til sammen ble syv prøvene analysert, og disse er inkludert ikke-behandlede celler, celler behandlet med E2 eller P4 til 3 og 12 timer, og celler behandlet med TAM eller RU486 modulatorer i 12 timer. Flertallet av leser fra hver prøve (for eksempel ved 70%) ble med hell justert til det humane genomet versjon 19 (Hg19). Statistiske verdier for disse justeringer og antall gener identifisert, inkludert både kjente og ukjente gener, er angitt i tabell 1. De relative Forekomsten av fragmentene ble beregnet ved hjelp av Cufflinks, og ble rapportert i enheter av FPKMs for å beskrive uttrykte gener (f.eks fragmenter) observert fra RNA-Seq eksperimenter. I tabell 1 er antall gener med forskjellige FPKM abundances, så vel som antallet gener som viste betydelige endringer i ekspresjon følgende hormon /modulator behandling ble sammenlignet med ikke-behandlede celler. I tillegg ble de mest responsive gener identifisert fra Ishikawa cellelinje sammenlignet med menneskelige endometrium biopsiprøver (n = 2) samlet i den tiden av embryo implantasjon. En fullstendig liste over de uttrykte gener identifisert og deres FPKM verdier finnes i tabell S1.
En av fordelene med en RNA-Seq analyse er evnen til å oppdage relativt høye uttrykk nivåer av gener. En undergruppe av genene fra Ishikawa-cellelinjen hadde FPKM verdier som var større enn 1000 etter hormon /modulator behandlingene (tabell 2). Disse inkluderte gener som koder prosaposin (
PSAP
), ATP synthases,
ATP5G2 Hotell og
ATP5H
, og guanin nukleotid bindende protein (
GNB2L1
). Disse genene ble meget høyt uttrykt i respons til E2 eller P4 behandling. Uttrykk for
ATP5G2
,
ATP5H Hotell og
GNB2L1
ikke har vist seg å være relatert til endometriet før. Alternativt gener som koder for S100 kalsiumbindende proteiner A2 (
S100A2
) og A6 (
S100A6
), heat shock protein 90 kDa alfa (
HSP90AA1
), og HSPA8, samt pyruvat kinase i muskel (
PKM2
), viste høye nivåer av uttrykk 12 timer etter behandling med TAM. Blant disse genene bare uttrykk for
S100A2
har vært knyttet til TAM behandling av brystkreft vev, men ikke i endometrium [29]. I tillegg ble genet for ferritin lys polypeptid (
FTL
), også ikke detektert i endometrium i tidligere studier, ble funnet å være sterkt uttrykt i 12 timer etter behandling med E2, P4, og TS (tabell 2).
Vesentlige genuttrykk endringer i Ishikawa cellelinje Etter E2 og P4 behandlinger
Relative mRNA uttrykk nivåer (i enheter av FPKM) for E2- og P4-behandlede celler ble sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp Cuffdiff programvare (versjon 1.1.0) og en 5% FDR. Antallet av gener som viste betydelige endringer i ekspresjon etter de respektive behandlinger er angitt i tabell 1. I tillegg ble det eneste kjente gener som inngår i etterfølgende analyser av genuttrykk av data.
I alt 1691 kjente gener (tabell S2 ) ble funnet å være vesentlig påvirket i Ishikawa-celler etter behandling med E2 i 3 timer (n = 1084) og 12 timer (n = 1121) sammenlignet med ikke-behandlede celler. Av disse genene, 614 var signifikant oppregulert, og 470 var signifikant nedregulert etter 3 h E2 behandling. Når behandling med E2 ble utvidet til 12 timer, induksjon av 715 gener, og undertrykkelse av 406 gener, ble detektert.
I flertallet av gener 12 h TAM behandling viste antagonistiske aktivitet av E2. Tolv timer etter behandling med TAM resulterte i lave eller ikke-påvisbare nivåer av mRNA for 654 (91,5%) gener av de 715 gener som viste høyere mRNA-nivåer etter behandling med E2 i 12 timer. Ytterligere 406 gener ble funnet å bli nedregulert etter behandling med E2 i 12 timer, og 75,1% (n = 305) av disse genene viste bare mindre endringer i genaktivitet, eller var forbundet med et fravær av regulering, 12 timer etter behandling med TAM.
Basert på data innhentet, TAM ikke opptre som en ren antagonist av E2 i Ishikawa cellelinje. For eksempel, av 715 genene oppregulert etter behandling med E2 i 12 timer, 61 (8,5%) var også signifikant oppregulert etter behandling med TAM. I tillegg er blant de 406 genene som ble funnet å bli nedregulert etter behandling med E2 i 12 timer, 101 (24,9%) var tilsvarende nedregulert etter behandling med TAM. I kombinasjon Disse data viser at både TAM er antagonistiske og agonistisk for E2 i Ishikawa-cellelinjen (figur S1).
Etter behandling med P4, totalt 1692 kjente gener viste signifikante forskjeller i ekspresjonen (tabell S3 ). Av disse genene, 1082 viste forandringer etter 3 timers behandling, og 1097 ble detektert etter 12 timers behandling, både sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa-celler. Av disse genene, 592 (54,7%) var signifikant oppregulert, og 490 (45,3%) ble nedregulert tre timer etter behandling med P4, mens 631 (57,5%) var oppregulert og 466 (42,5%) var ned -regulated 12 timer etter behandling med P4.
Når Ishikawa-celler ble behandlet med RU486 i 12 timer, lave eller ikke-påvisbare nivåer av mRNA ble påvist for 84.0% (n = 530) av gener som var signifikant oppregulert etter behandling med P4 i 12 timer (n = 631). Ytterligere 466 gener ble funnet å bli nedregulert etter behandling med P4 i 12 timer, og av disse ble 88,2% (n = 411) oppviste mindre nedreguleringen, eller viste ingen regulering, etter behandling med RU486 i 12 timer.
av de 631 gener som ble opp-regulert som respons på 12 timer P4 behandling, 101 (16,0%) av disse genene var også signifikant oppregulert etter behandling med RU486. Alternativt, av de 466 genene ned-reguleres i respons til behandling med P4 i 12 timer, 55 (11,8%) fremviste en lignende nedregulering etter behandling med RU486. Videre ligner på TAM, RU486 utstilt både agonistisk og antagonistisk aktivitet av P4 i Ishikawa celler (figur S2).
Av de 1691 gener signifikant responsive til E2, og 1692 gener signifikant responsive til P4, 1051 var vanlig til begge gruppene, noe som tyder på at de er regulert av begge hormoner. Relativ parten av genene identifisert med betydelige endringer etter E2 og P4 behandling, ikke har blitt nevnt i livmor sammenheng før.
Potensielle ER og PR Mål Blant E2 og P4 Betydelige Genes Identifiserte
En IPA analyse av gener funnet å være lydhør for E2 avdekket 20 potensielle målgener for E2 reseptoren, ERα (
ESR1
), basert på en database med eksperimentelt observerte reseptor interaksjoner. For eksempel
ABCA3, CELSR2, CYP1A1, DDX17, EFEMP1, ENO1, FOSL2, GREB1, KCNK6, MAPK12, MYC, PDCD4, PGR, SHANK3, TGFa, etter og
TPM1
var betydelig opp -regulated etter behandling med E2 i 12 timer. Omvendt,
CCNG2, KCTD6, LDLR, etter og
Prlr
ble nedregulert. Av disse genprodukter, PGR og MAPK12 delta i glukokortikoid reseptor signalisering, mens MYC og CYP1A1 er involvert i aryl hydrokarbon reseptor (AHR) signalering (Figur S3).
Etter 12 timers behandling med P4, uttrykk for
CDKN1C, F3, FKBP5, GAS6, IL1R1, NQO2, PFKP, TSC22D3 Hotell og
PGR
ble funnet å være oppregulert, mens
Esr
,
ACSL1, AKAP13, CCNB2, GLUL, MYCN, PPIF, etter og
SNTB2
ble funnet å være nedregulert. Av disse CDKN1C, FKBP5, og PGR bidra til glukokortikoid reseptor signalisering, mens ACSL1 og PFKP har roller i glukoneogenesen (figur S4).
Biomarker Analyse av E2 og P4 Vesentlige gener fra Ishikawa cellelinje
Deretter potensielle biomarkører blant E2 (n = 1691) og P4 (n = 1692) responsive gener ble undersøkt. Bare molekyler tidligere påvist i den menneskelige endometriet ble ansett for IPA biomarkør analyse utført, og molekylene ble ytterligere filtrert for å inkludere de som er knyttet til reproduktive system sykdommer eller lidelser endokrine systemet.
IPA biomarkør analyse identifisert 82 potensielle biomarkører blant E2 betydelige gener og 93 potensielle biomarkører blant P4 betydelige gener. Det var 62 potensielle biomarkører molekyler som er felles for begge gruppene. En komplett liste over biomarkører uttrykt i menneske livmoren sammenlignes med biomarkører er identifisert i Ishikawa celler 3 timer og 12 timer etter E2, P4, og respektive modulator behandlinger (tabell S4). Valg av unike E2 og P4 avhengige biomarkører som har vært knyttet til livmor mottakelighet og embryo implantasjon er oppført i Tabell 3. Når det gjelder førstnevnte, disse inkluderte følgende gener relatert til endometriet og embryoimplantasjonen:
MUC1, EZH2, HMGCR, MDK, PRDM2, PXN, etter og
SLIT2 product: (Tabell 3). For genene felles for både E2 og P4 responsive gener, ble potensielle biomarkører identifisert som var knyttet til livmor mottakelighet eller endometriose, og disse følger:
ARG2, ANXA1, AR, BMPR2, CDKN1C, CXCL16, EGFR, FGFR1, HMGA1, IGFR2 , IL1R1, JAG1, la-7, MCAM, NCOA3, NOTCH1, PDCD4, PGR, RACGAP1, TMSB10, etter og
TNC plakater (tabell S4).
På samme måte blant P4 responsive gener, ble identifisert potensielle biomarkører som var knyttet til utvikling av endometriet eller tidlig i svangerskapet:
CTNNA1, ErbB3, FGFR2, IGFBP5, IKBKB, IL6ST, KCNMA1, NOTCH3, S100A4, STAT3, TCF7L2, TGFB1,
og
TGFBR3 product: (Tabell 3).
en sammenligning av de Betydelig E2 og P4 Responsive gener identifisert i Ishikawa cellelinje med et menneskelig Livmor transkriptomet
for å forutsi om E2 og P4-responsive gener som er identifisert i Ishikawa-celler ble også uttrykt i en human endometrium, og /eller ha roller i implantasjon fremgangsmåte for embryoer, ble ekspresjon av disse genene analysert i to humane endometriale vev prøver samlet fra midten av sekretorisk endometrium. I henhold til RNA-Seq data, 1671 (98,8%) av E2 responsive gener, og 1668 (98,6%) av P4 responsive gener identifisert i Ishikawa cellelinje ble også funnet å bli uttrykt i humane endometrium prøver tatt fra to pasienter som gjennomgikk endometrial biopsi. Disse menneskelige endometrium prøvene ble bare brukt for sammenligningsformål. I tabell 1 er de uttrykkshopetall (f.eks FPKMs) av E2 og P4 biomarkører oppdaget i menneske endometriebiopsi prøver sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa celler. Blant de IPA-identifiserte E2 og P4 biomarkører stede i Ishikawa celler,
EZH2, MDK, MUC1, SLIT2, etter og
IL6ST
ble også funnet å være til stede i menneskelige endometrial transcriptomes (figur 1) .
Røde gener oppregulert i E2 og P4 behandlet Ishikawa celler sammenlignet med ikke-behandlede celler; grønne gener nedregulert. Gener som ligger på venstre side av den diagonale linjen viser høyere relative overflod (FPKM) i menneskelig endometriebiopsi prøven sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa celler. Gener som ligger på høyre side av den diagonale linjen viser lavere relativ overflod (FPKM) i menneskelig endometriebiopsi prøven sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa celler.
TAM Responsive gener i Ishikawa cellelinje som er relatert til kjønnsorganer Sykdommer
etter behandlingen av Ishikawa celler med TAM for 12 timer, ble uttrykket av 1013 gener funnet å være vesentlig endret sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa celler. Av disse genene, 432 var oppregulert og 581 ble nedregulert (tabell S5). Disse resultater viser at TAM har både antagonistisk og agonistisk aktivitet mot E2 i Ishikawa-celler. Videre, i tillegg til å påvirke E2-regulerte gener, TAM signifikant endret ekspresjon av gener som 789 uavhengig av E2 (figur 2A).
En unik og vanlige gener etter 12 timer E2 og TAM behandling. B Unik og felles gener etter 12 timer P4 og RU486 behandling. Tallene som angis innenfor hver av sirklene representerer antall vesentlig endrede gener som er unike for behandling, og piler viser den måte som de reguleres (opp- eller nedregulering sammenlignet med ikke-behandlede Ishikawa-celler). Overlapp angir antall vanlige endret gener.
Ved hjelp av en IPA kjerneanalyse, den antatte funksjon av TAM responsive gener ble oppnådd. Totalt 168 gener ble funnet å være relatert til forskjellige forplantningsorganene sykdommer, inklusive livmor, eggstokk, og livmorhalskreft, så vel som genital tumorer, amenoré, metrorrhagia og polycystisk eggstokksyndrom (tabell 4).
En av de viktigste signalveier identifisert fra TAM responsive gener assosiert med regulering av DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon, samt cellecyklusprogresjonen, og mobilnettet montering og organisasjon. Videre TAM responsive gener kodet molekyler som direkte eller indirekte, ble assosiert med cellesyklusen regulator, cyclin D1 (
CCND1
). Tilsvarende
CCND1
ble funnet å være signifikant oppregulert 12 timer etter behandling med TAM (figur 3).
Røde molekyler representerer oppregulert og grønne nedregulert gener blant TAM 12 timer betydelige gener i Ishikawa celler. Nettverkene ble generert gjennom bruk av IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
RU486 Vesentlige Gener i Ishikawa cellelinje er knyttet til kjønnsorganer Sykdommer
behandling av Ishikawa celler med den P4-antagonisten, RU486, i 12 timer resulterte i vesentlige endringer i ekspresjonen av gener 546 sammenlignet med ubehandlede celler, med 255 gener oppregulert og 291 genene nedregulert (tabell S6). I likhet med TAM, RU486 utstillinger både agonistiske og antagonistiske aktiviteter for P4 i Ishikawa celler. For eksempel, gjorde 377 gener som reagerer på RU486 etter 12 timer ikke viser signifikante endringer i uttrykk etter behandling med P4 i 12 timer. Derfor er disse genene reguleres uavhengig av RU486 og i fravær av P4 i Ishikawa-celler (figur 2B).
Av de 546 gener ble funnet å være responsiv for behandling med RU486, 86 kodede molekyler relatert til sykdommer i reproduktive system. For eksempel ble molekyler knyttet til adenomyosis, gonadale svulster, Livmorblødning, og livmor leiomyoma identifisert (tabell 4). Basert på genene som var mottakelig for behandling med RU486, en signalveien relatert til genekspresjon, celle-til-celle signalisering og interaksjoner, og utvikling av vev ble identifisert. De sentrale molekyler i dette nettverket, inkludert cadherin 2 (CDH2) og et kompleks mellom AR og NFkB, megle direkte og indirekte veksel med RU486 responsive gener (figur 4). For eksempel, den transkripsjonelle co-repressor-genet,
NCOR2
, var oppregulert som var androgenreseptoren (
AR
) genet. Imidlertid transkripsjonsfaktor, FOXA1, ble nedregulert. Gener assosiert med celle til celle kontakt og adhesjon var også nedregulert, og som følger med:
CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1, etter og
COL2A1
Alternativt
PDK1
og
ADAM15
ble oppregulert, og har roller i induksjon av vev sammenbrudd. De fleste av molekylene i dette nettverket ble også relatert til celledød og apoptose.
De sentrale molekylene i nettet ble cadherin 2 (CDH2), AR og NFkB kompleks. Nettverkene ble generert gjennom bruk av IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å definere transkripsjons responsen av en endometrial modell til behandling med E2, P4, TAM, og RU486. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om anvendelsen av RNA-Seq til studiet av tidlig genom-wide effekter i et menneske endometrial cellelinje. Videre til flertallet av gener som ble funnet å være signifikant lydhør overfor E2 og P4 i Ishikawa cellelinje ble også påvist i humane Endometriebiopsier samlet på embryo implantasjon.
I løpet av det siste tiåret, microarrays har vært den mest
