Abstract
Durable tumorcelle utrydding av kjemoterapi utfordres av utviklingen av multiresistens (MDR) og unnlatelse av å indusere immunogene celledød. Målet med dette arbeidet var å undersøke om MDR og immunogen celledød deler et felles biokjemisk pathway slutt mottagelig for terapeutisk intervensjon. Vi fant at mevalonat pathway aktivitet, Ras og RhoA protein isoprenylation, Ras- og RhoA-nedstrøms signalveien aktiviteter, hypoksi induserbar faktor-1alfa-aktivering var signifikant høyere i MDR + sammenlignet med MDR-humane kreftceller, noe som fører til økt P-glykoprotein uttrykk, og beskyttelse mot doxorubicin-indusert cytotoksisitet og immunogene celledød. Zoledronsyre, en potent aminobisphosphonate rettet mot mevalonat vei, avbrutt Ras- og RhoA-avhengige nedstrøms signalveier, avskaffet Hypoksi induserbar faktor-1alpha drevet P-glykoprotein uttrykk, og restaurert doxorubicin-indusert cytotoksisitet og immunogen celledød i MDR + celler. Immunogent celledød restitusjon ble dokumentert ved evnen til dendrittiske celler til phagocytise MDR + celler behandlet med zoledronsyre pluss doxorubicin, og å rekruttere anti-tumor cytotoksiske CD8 + T-lymfocytter. Disse dataene indikerer at MDR + celler har en hyper-aktiv mevalonate sti som er målrettes med zoledronsyre å motvirke deres evne til å tåle kjemoterapi-indusert cytotoksisitet og rømme immunogen celledød
Citation. Riganti C, Ella B, Kopecka J, Campia jeg, Coscia M, Pescarmona G, et al. (2013) zoledronsyre Gjenoppretter Doxorubicin kjemosensitivitet og immunogen celledød i multiresistent humane kreftceller. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10,1371 /journal.pone.0060975
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA
mottatt: 24 januar 2013; Godkjent: 01.03.2013; Publisert: 12. april 2013
Copyright: © 2013 Riganti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Italienske foreningen for Cancer Research (AIRC, www.airc.it; MFAG 11475 til Chiara Riganti, IG 13119 til Massimo Massaia); Italian Ministry of University og forskning (www.miur.it; PRIN 2010-2011 til Massimo Massaia, FIRB 2012 til Chiara Riganti); Fondazione Internazionale RICERCHE Medicina Sperimentale (www.cerms.it, til Amalia Bosia, Massimo Massaia); Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 til Chiara Riganti, Amalia Bosia, Progetto Immonc til Massimo Massaia). Joanna Kopecka er mottaker av en «Mario og Valeria Rindi» fellesskap fra italiensk Foundation for Cancer Research (FIRC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mevalonat (Mev) veien er et sterkt konservert metabolsk kaskade som produserer steroler, så som kolesterol, og isoprenoider, slik som farnesylpyrofosfat (FPP) og geranylgeranyl pyrofosfat (GGPP). Sistnevnte er nødvendig for isoprenylation og aktiviteten av små G-proteiner, slik som Rho Ras og som kontrollerer cellevekst, cytoskjelettet ombygging og angiogenese [1].
Over-ekspresjon av Mev spredningsveier enzymer er blitt korrelert med en dårlig klinisk utfall i flere kreft hos mennesker [2], [3]. Intracellulære kolesterolnivåer kan modulere resistens mot en rekke kreftmedisiner, innenfor en funksjonell fenotype betegnet multiresistens (MDR), som kan være konstitutiv eller indusert etter eksponering for gjentatte baner av ikke-utrydd kjemoterapi [4]. Plasmamembraner MDR + tumorceller er spesielt rike på kolesterol som letter aktiviteten av P-glykoprotein (Pgp) [5], en integral membrantransportøren ekstrudering av cytostatika så som antracykliner, taksaner, Vinca alkaloider, epipodofyllotoksiner, topotekan, og mitomycin C [4]. Et annet kjennetegn på MDR + tumorceller er den økte isoprenylation og aktivitet av G-proteiner som også er avhengige av hastigheten av de Mev veien aktivitet [6], [7].
Samle bevis tyder på at vellykket og holdbar tumor celle utrydding er avhengig av evnen av kjemoterapi stoffer for å drepe tumorceller på en måte som kan detekteres av immunsystemet. Betegnelsen immunogene celledød (ICD) er blitt skapt for å beskrive evnen av visse stoffer, som for eksempel doxorubicin (Dox), for å drepe tumorceller og samtidig indusere antitumorimmunresponser utløst av døende tumorceller [8]. Molekylære viktige hendelser i Dox-indusert ICD er den ekstracellulære utgivelsen av høy mobilitet gruppe 1 boks (HMGB1) protein og celleoverflaten translokasjon av calreticulin (CRT) fra det endoplasmatiske retikulum, der det utøver kalsium-sensor og anstand funksjoner. Disse hendelsene utløse tumorcelle fagocytose av dendrittiske celler (DC) og den påfølgende DC-mediert rekruttering av andre immun subpopulasjoner med antitumoraktivitet [9], [10]. Interessant, MDR + celler er ofte ildfast til ICD [11] indikerer at kreftceller har råd til flere strategier for å overleve og formere seg i kjemoterapi-behandlede vert.
Zoledronsyre (A) er en aminobisphosphonate mye brukt i klinikker for å forebygge benresorpsjon og behandling av bensykdom i faste tumorer, inkludert brystkreft, prostatakreft, lungekreft og multippelt myelom. ZA er en spesifikk hemmer av FPP-syntase i Mev reaksjonsveien og utøver pleiotrope effekter i tumor- og ikke-tumorceller, slik som osteoklaster, makrofager, endotel-celler og immunceller [12], [13]. Disse effektene er på grunn av den intracellulære deprivasjon av isoprenylated proteiner og /eller akkumulering av isopentenylpyrofosfat som utnyttes for å aktivere Vγ9Vδ2 T-celler, en unik undergruppe av ukonvensjonelle T-celler med regulerende og effektorfunksjoner mot mikrober, stresset celler og tumorceller [14 ] – [16]
Tidligere data har vist at ZA forbedrer anti-proliferativ effekt av Dox i narkotika-sensitive kreftceller [17], [18] og kliniske studier er igangsatt i brystkreftpasienter til. dra nytte av denne synergien [19]. Det er imidlertid for tiden ukjent om ZA har noen innvirkning på MDR og /eller ICD i tumorceller. Hensikten med denne studien var todelt: 1) å undersøke aktiviteten i Mev sti og Ras /RhoA-nedstrøms signalveier i MDR og MDR + tumorceller; 2) for å evaluere forholdet, om noen, mellom ZA-indusert Mev veien inhibering, Dox-indusert cytotoksisitet og ICD følsomhet. Vi fant ut at en hyper-aktiv Mev veien er ansvarlig for både kjemo- og immun-motstand; takket være hemming av Mev-pathway avhengige signaler, ZA restaurert Dox-indusert cytotoksisitet og ICD i MDR + celler.
Materialer og metoder
Kjemi
Fetal bovin serum (FBS ) og dyrkingsmedium var fra Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, California). Servise av plast for cellekulturer var fra Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ZA var en gave fra Novartis (Basel, Sveits). De spesifikke inhibitorer av farnesyltransferase FTI-277, geranylgeranyl-transferase GGTI-286 og av RhoA kinase Y27632 ble anskaffet fra Calbiochem (San Diego, CA). Elektroforese reagenser ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Proteininnholdet av cellemonolagene og lysatene ble bestemt med BCA-kit fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Med mindre annet er angitt, ble alle de andre reagenser fra Sigma Chemical Co.
Cellelinjer
Mennesketykktarmskreft HT29, lungekreft A549, og brystkreft MCF7- er Dox-sensitive, MDR-tumor -cellelinjer (ATCC, Rockville, MD). Dox-resistente motstykker (HT29-DX, A549-DX og MCF7-DX) ble dannet ved dyrkning av parentale celler i nærvær av økende konsentrasjoner av DOX i opp til 20 passasjer [11], [20], [21]. For det foreliggende arbeid ble det HT29-DX-celler dyrket i medium som inneholdt 250 nmol /L Dox, A549-DX-celler i medium som inneholdt 100 nmol /L Dox, MCF7-DX-celler i medium inneholdende 0,5 nmol /L, og representerte modeller av ervervet MDR. Den humane hepatoma HepG2-cellelinje (ATCC) og HP06 og HMM kreftceller ble anvendt som prototypic modeller av celler med en konstitutiv MDR-fenotype og ble tidligere beskrevet ([7], [11], [21], og i alle disse arbeider HMM celler ble kalt MM98 celler). Primær HP06 celler (gave Prof. Anna Sapino, Institutt for Biomedical Sciences og onkologi, Universitetet i Torino, Italia) ble avledet fra peritoneal metastasering av en kvinnelig pasient med en invasiv brystkreft, mens primær HMM celler (Ondartet Mesothelioma Biologic Bank, Azienda Ospedaliera Nazionale, Alessandria, Italia) ble avledet fra pleuravæske av en pasient med histologisk bekreftet ondartet mesothelioma, etter skriftlig informert samtykke fra pasientene. Bruken av HP06 celler ble godkjent av bioetikkomité ( «Comitato av Bioetica d’Ateneo») ved Universitetet i Torino, Italia; bruk av HMM celler ble godkjent av bioetikkomité ( «Comitato Etico Interaziendale») av «Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo «av Alessandria, Italia. Primære celler ble anvendt ved passasjene 2-4. Alle kulturene ble supplementert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% L-glutamin, og holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO
2.
Intracellulær akkumulering Dox
Intracellulær Dox innhold ble detektert med en fluorimetrisk-baserte analysen som rapportert [20], og uttrykt som nmol /mg Dox celleproteiner i henhold til en på forhånd fremstilt kalibreringskurve.
Sanntids polymerase chain reaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert og revers-transkribert ved hjelp av QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). RT-PCR ble utført med IQ ™ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad). Det samme cDNA-preparat ble anvendt for kvantifisering av
MDR1
-genet, som koder for human Pgp, og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), valgt som en husholdningsgenet. Sekvensene til
MDR1
primere var: 5′-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 «, 5′-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3». Sekvensene til GAPDH-primere var: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 «, 5′-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3». Den relative kvantifisering av hver prøve ble utført ved å sammenligne
MDR1
PCR produkt med GAPDH PCR produkt med Bio-Rad programvare Gene Expression Kvantitering.
De novo
syntese av kolesterol og isoprenoider
Celler ble merket med 1 uCi /mL
3H-acetat (3600 mCi /mmol; Amersham Bioscience, Piscataway, NJ), og syntesen av radiomerket kolesterol, ble FPP og GGPP målt som beskrevet [22]. Resultatene ble uttrykt som pmol /mg celleprotein, i henhold til de relative kalibreringskurvene.
Ras og RhoA isoprenylation og aktivitet
For å oppdage isoprenylated membranassosierte Ras eller RhoA proteiner og ikke- isoprenylated cytosoliske former, ble cellene lysert i MLB-buffer (125 mmol /l Tris-HCl, 750 mmol /l NaCl, 1% volum /volum NP40, 10% volum /volum glyserol, 50 mmol /l MgCl
2, 5 mmol /l EDTA, 25 mmol /l NaF, 1 mmol /l NAVO
4, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml pepstatin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid; pH 7,5) og sentrifugert ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. En alikvot av supernatanten ble tatt ut for Western blot av total Ras og RhoA, mens den resterende del ble sentrifugert ved 100 000 x g i 1 time ved 4 ° C; både den overliggende væske (cytosoliske ekstrakter) og pelleten (membranfraksjoner) ble oppløst i Laemli buffer (125 mmol /l Tris, 4% vekt /volum SDS, 20% volum /volum glycerol, 1% vekt /volum β-merkaptoetanol) og kastet Western blotting, ved å bruke et anti-Ras (Millipore, Billerica, Massachusetts) og en anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) antistoff. For å evaluere Ras og RhoA aktivitet, GTP-bundet fraksjon, tatt som en indeks av aktive G-proteiner [23] ble målt, ved anvendelse av en rullegardin analysen (med Raf-1-GST-fusjonsprotein, agarose-perler-konjugater Millipore) og en ELISA-analyse (med G-LISA ™ RhoA Activation analysen Biochem Kit, Cytoskjelett Inc, Denver, CO), henholdsvis, som beskrevet tidligere [22].
RhoA kinase aktivitet
RhoA kinase aktivitet ble evaluert med CycLex Rho kinase Assay Kit (CycLex Co, Nagano, Japan) følgende produsentens instruksjoner [22].
Western blot analyse
Celler ble lysert i MLB buffer, ultralydbehandlet og sentrifugert ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. 10 mikrogram cellelysater ble utsatt for Western blotting og undersøkt med følgende antistoffer: anti fosfo (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore); anti-ERK 1/2 (Millipore); anti-Hypoksi induserbar faktor-1α (HIF-1α, BD Bioscience, San Jose, CA); anti-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.); anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), etterfulgt av de sekundære peroksidase-konjugert antistoff (Bio-Rad). Proteiner ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (PerkinElmer, Waltham, MA).
For å vurdere HIF-1α fosforylering, hele cellelysat ble immunopresipitert med et polyklonalt anti-HIF-1α antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc.), deretter probet i 1 time med en biotin-konjugert anti-fosfoserin antistoff (Sigma Chemical Co.), etterfulgt av polymere streptavidin-pepperrot peroksidase-konjugater (Sigma Chemical Co.).
HIF-1α transkripsjonen aktivitet
Nuclear proteiner ble hentet med Nuclear Extract Kit (Active Motif, Rixensart, Belgia). Aktiviteten av HIF-1 på 10 mikrogram atom ekstrakter ble undersøkt med Transam ™ HIF-1 transkripsjonsfaktor Assay Kit (Active Motif). For hvert sett av eksperimenter, blank (med dobbeltdestillert vann), negativ kontroll (med mutert oligonukleotid) og konkurranseanalyse (ved bruk av 20 pmol av villtype oligonukleotid med nukleære ekstrakter av HMM-celler dyrket ved 3% O
2 etter 24 h) ble inkludert. I hypoksiske forhold, HIF-1 aktivitet var 257,53 ± 3,77 mU /mg prot; i konkurranseanalyse, ble det tilsvarende HIF-1 aktivitet redusert til 33,14 ± 1,39 mU /mg prot (n = 5). Dataene ble uttrykt som mU absorbans /mg celleproteiner.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) eksperimenter for å måle bindingen av HIF-1α på «Hypoksi Responsive Element» av
MDR1
arrangøren var utført som rapportert andre steder [24].
Cytotoksisitet assay
laktat-dehydrogenase (LDH) aktivitet ble målt i det ekstracellulære medium og i cellelysatet som beskrevet [20]. For å måle den ekstracellulære frigivelse av HMGB1, ble 20 ul av cellene kulturmediet kokt, løst ved hjelp av SDS-PAGE og sonde med et anti-HMGB1 antistoff (Sigma Chemical Co.). Blottene ble pre-farget med røde Ponceau å sjekke lik belastning av proteiner. ATP frigjøring ble målt på 100 pl av cellekulturmediet med ATP Bioluminescent Assay Kit (FL-AA, Sigma Aldrich Co.), ved anvendelse av en Synergy HT multi Detection Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT). Resultatene ble uttrykt som nmol ATP /ml, i henhold til den tidligere angitte titreringskurven.
Analyse av celleoverflate CRT
Celler ble inkubert i 45 minutter (4 ° C) med et anti- CRT-antistoff (Interesse BioReagents, Rockford, IL), som rapportert i [11] og analysert ved bruk av en FACS-Calibur system (BD Biosciences). For hver analyse 100.000 hendelser ble samlet. Prosentandelen av CRT-fluorescerende levedyktige celler (propidiumjodid-negative) ble beregnet med Cell quest software (BD Biosciences). Kontrollforsøk inkludert inkubering av celler med ikke-immune isotypiske antistoffer etterfulgt av det passende sekundære antistoff. Flowcytometri resultater ble bekreftet ved biotinylering assays [25], ved hjelp av Cell Surface Protein isolasjonskit fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Oppføringen av biotin i celler ble ekskludert ved å sjekke fraværet av cytosoliske proteiner (GAPDH, aktin) i biotinylerte ekstrakter (ikke vist).
Dendritic celle (DC) generasjon og
in vitro
fagocytose analysen
DC ble samlet inn via perifere blodprøver hentet fra friske donorer vennlig levert av den lokale blodbanken (Fondazione Strumia, Torino, Italia), som tidligere rapportert [11]. Cellene ble høstet på dag 6 og bekreftet som umodne DC etter morfologi og immunfenotypen.
MDR-HT29 og MDR + HT29-DX og HMM cellene ble grønn-farget med PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), vasket to ganger og inkubert med i et forhold på 01:01 i 18 timer ved 37 ° C. Ko-kulturer ble deretter farget i 20 minutter ved 4 ° C med APC-konjugert HLA-DR-antistoff (Miltenyi Biotec, Tetrow, Tyskland) for å markere DC. To-farge flowcytometri ble utført med en FACScan celle sorter og Cellquest programvare (Becton Dickinson). Minst 10.000 hendelser ble samlet spesifikt backgating på DC morfologi (region 1: FSC versus SSC). Tumorcelle fagocytose ble bestemt som prosentandelen av dobbelt-farget (FITC pluss APC) celler. Tumorceller uttrykker ikke betydelige mengder av HLA-DR, og de er utelukket fra region ett av deres morfologi. I hvert sett av eksperimenter ble en fagocytose-målingen ble utført ved ko-inkubering DC og tumorceller ved 4 ° C i stedet for 37 ° C, og prosentandelen av dobbelt-fargede celler ble oppnådd etter en inkubering ved 4 ° C ble subtrahert fra verdiene observert ved 37 ° C. Fagocytose hastigheten ble uttrykt som en fagocytisk indeks, beregnet som tidligere rapportert [9].
i fluorescens mikroskopi-baserte analyser, ble PKH2-FITC grønn-farget tumorceller inkubert i 6 timer eller 24 timer ved 37 ° C med 1 × 10
5 DCs på en 1:01 ratio. Ko-kulturer ble cytospun ved 1500 x g i 5 minutter på glass slips, fiksert med 4% vekt /volum paraformaldehyd, vasket og farget med et muse-polyklonalt anti-MHCII antistoff (Thermo Fisher Scientific Inc.). Etter vasking, ble prøver inkubert med et Alexa fluor 350-conjuganted geit-anti-mus-IgG-antistoff (Invitrogen) i 1 time ved romtemperatur, vasket, montert med Gel Mount Vandig Montering og undersøkt under et fluorescens-mikroskop, som beskrevet ovenfor.
DC-mediert CD8 + T-cellestimulering
etter tumorcelle fagocytose, DC ble vasket og ko-dyrket med autologe T-celler isolert fra CD14-celler ved immunomagnetisk sortering med Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec). DC og T-celler ble ko-dyrket i 10 dager i et forhold på 01:05 i fullstendig medium supplementert med IL-2 (10 U /ml). På dag 10, ble CD107 uttrykk på CD8 + -T-celler bestemt ved strømningscytometri for å bestemme den aktivering av tumorspesifikke cytotoksiske T-celler [26]. Minst 100.000 hendelser i lymfocytt gate ble kjøpt og analysert av to-farge flowcytometri. Tumor celledød indusert av CD8 + T-celler ble også kvantifisert ved CFSE-merking, måling av prosentandelen av HT29-DX-celler dobbel-positive for CFSE og propidiumjodid som tidligere rapportert [14], [15].
Statistisk analyse
Alle data i tekst og tall er gitt som gjennomsnitt ± SD. Resultatene ble analysert ved hjelp av en en-veis analyse av varians (ANOVA) med
P
0,05 som betydningen cut-off. R koeffisienten ble beregnet med Fig.P programvare (Fig.P Software Inc., Hamilton, Canada).
Resultater
Sammenheng mellom
MDR1
uttrykk og Mev pathway aktivitet
Intracellulær Dox oppbevaring,
MDR1
mRNA nivåer, og kolesterol syntese ble målt som markører for Pgp aktivitet, Pgp uttrykk, og Mev pathway aktivitet i HT29, A549, MCF7 celler (MDR-celler) , HT29-dx, A549-dx, MCF7–DX-celler (ervervet MDR + celler), og HepG2 celler, HP06, HMM celler (konstituerende MDR + celler), henholdsvis. Begge kjøpte og konstituerende MDR + celler beholdt betydelig mindre Dox (figur 1A) og viste høyere
MDR1
mRNA nivåer (Figur 1b) enn MDR-celler. Kolesterolsyntesen var også signifikant høyere hos MDR + enn i MDR-celler (figur 1C). Forskjellene mellom ervervet og konstitutive MDR + -celler var ikke statistisk signifikant, selv om den sistnevnte tendens til å holde på mindre Dox, for å uttrykke mer
MDR1
mRNA-nivåer, og for å generere mer kolesterol enn den førstnevnte. En meget signifikant korrelasjon ble observert mellom frekvensen av kolesterol syntese og
MDR1
mRNA nivåer (figur 1D).
A. Intracellulær doksorubicin (Dox) konsentrasjoner i MDR-celler (HT29, A549 og MCF7), i de tilsvarende ervervet MDR + kolleger (HT29-DX celler, A549-DX celler, MCF7–DX), og konstituerende MDR + celler (HepG2, HP06, HMM ). Betydelig lavere konsentrasjoner ble funnet i celler med ervervet MDR
vs
MDR-celler (HT29-dx
vs
HT29: * p 0,002; A549-dx
vs
A549: * p 0,001; MCF7–dx
vs
MCF7-: * p 0,001), og i celler med konstituerende MDR
vs
MDR-celler (gjennomsnittlig verdi av intracellulær doxorubicin i HepG2 /HP06 /HMM
vs
middelverdi i HT29 /A549 /MCF7-: ° p 0,001). B.
MDR1
mRNA uttrykk. Betydelige høyere
MDR1
nivåer ble observert i celler med ervervet MDR
vs
MDR-celler (HT29-dx
vs
HT29: * p 0,002; A549-dx
vs
A549: * p 0,002; MCF7–dx
vs
MCF7-: * p 0,001), og i celler med konstituerende MDR
vs
MDR-celler (middelverdi av
MDR1
nivåer i HepG2 /HP06 /HMM
vs
middelverdi i HT29 /A549 /MCF7-: ° p 0,001). C. Valuta kolesterol syntese. Betydelig høyere aktivitet ble målt i celler med ervervet MDR
vs
MDR-celler (HT29-dx
vs
HT29: * p 0,002; A549-dx
vs
A549: * p 0,002; MCF7–dx
vs
MCF7-: * p 0,002), og i celler med konstituerende MDR
vs
MDR-celler (middelverdi av kolesterol syntese i HepG2 /HP06 /HMM vs middelverdi i HepG2 /HP06 /HMM: ° p 0,001). D. direkte sammenheng mellom frekvensen av kolesterol syntese og uttrykket nivåer av
MDR1
i enkelte cellelinjer (r
2 = 0,95). For paneler A, B og C stolpene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.
ZA hemmer Mev-avhengige signalveier i MDR + celler
ZA ble brukt til å undersøke effekten av Mev pathway hemming i HT29, HT29-DX og HMM celler som ble valgt som prototypic modeller av MDR kjøpte MDR + og konstituerende MDR + kreftceller hhv.
ZA induserte en dose-(figur 2A, venstre panel ) og tidsavhengig (figur 2A, til høyre panel) reduksjon av kolesterolsyntese med en signifikant inhibering ved 1 pmol /L som var mer tydelig i MDR + HT29-dx og HMM celler enn MDR-HT29-celler (figur 2A). En mikromol /L er også lik serumkonsentrasjonen observert hos pasienter som får ZA ved klinisk godkjente doser [27], [28] og derfor denne konsentrasjonen ble brukt gjennom hele studien.
MDR-HT29, og MDR + HT29 -dx og HMM celler ble dyrket uten (CTRL) eller med zoledronsyre (ZA). For paneler B-E, ZA (1 umol /l) ble benyttet i 48 timer, FTI-277 (10 umol /L, FTI), GGTI-286 (10 umol /L, GGTI), Y27632 (10 umol /L, Y276) i 24 timer. A.
Venstre panel
: dose-avhengig inhibering av kolesterolsyntese i celler behandlet med 0,01 til 10 umol /L ZA i 24 timer. Hemming var statistisk signifikant i HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,01) d HMM celler (
◊p 0,005)
vs
utgangsverdien (0).
Høyre panel
: tidsavhengig inhibering av kolesterolsyntese i celler behandlet med 1 pmol /l ZA etter 24-72 timer. Hemming var statistisk signifikant i HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,0001) og HMM celler (
◊p 0,001)
vs
utgangsverdien (0). For begge paneler: HT29-dx /HMM
vs
HT29: * p 0,001. B. MDR + celler syntetiserte høyere mengder av FPP (
venstre panel
) og GGPP (
høyre panel
) enn MDR-celler (* p 0,005). ZA betydelig senket FPP syntese
vs
ubehandlede (Ctrl) celler (HT29: * p 0,001; HT29-dx: ° p 0,002; HMM:
◊p 0,001) og GGPP syntese
vs
ubehandlede (CTRL) celler (HT29: * p 0,02; HT29-dx: ° p 0,001; HMM:
◊p 0,005). C. MDR + celler vises en ubalansert fordeling mellom isoprenylated membranbundet (
M
) og ikke isoprenylated cytosolic (
C
) Ras (
venstre panel
) og RhoA (
høyre panel
) sammenlignet med MDR-celler. ZA behandling økte mengden av cytosolisk Ras og RhoA.
T
: mengden av Ras og RhoA i helcellelysater. D. ZA redusert Ras aktivitet, målt som Ras-GTP beløp, og fosfo (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 beløpet. GAPDH data er vist å bekrefte tilsvarende protein lasting. E. MDR + -celler hadde signifikant høyere mengder av RhoA-GTP (
åpne barer
) og RhoA kinase (
skraverte søyler
) enn MDR-celler (* p 0,005); ZA redusert både RhoA-GTP og RhoA kinase
vs
ubehandlede (Ctrl) celler (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:
◊p 0,02). Resultatene vist i panelene C og D er representative for 3 forsøk. I panelene A, B og E resultatene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 eksperimenter.
Ifølge hyper-aktiv Mev vei, MDR + HT29-dx og HMM celler viste høyere FPP (figur 2B , venstre panel) og GGPP (figur 2B, panel høyre) syntese enn MDR-HT29 celler. Både MDR og MDR + -celler hadde påvisbare mengder isoprenylated, membranbundet Ras og ikke-isoprenylated, cytosolisk Ras, selv om det tidligere var stort sett dominerende i MDR + -celler som følge av den økte FPP tilførsel favorisere Ras isoprenylation (figur 2C, venstre panel ). Membranbundet og cytosoliske RhoA viste også et lignende mønster i MDR + HT29-dx og HMM
vs
MDR-HT29-celler som en konsekvens av den økende produksjon og GGPP RhoA isoprenylation (figur 2C, høyre panel).
Overskuddet av membranbundet Ras og RhoA resulterte i økt aktivitet av de tilsvarende nedstrøms signalveier: intracellulære nivåer av GTP-bundet Ras (figur 2D), en markør for Ras-aktivering, og ERK1 /2 fosforylering (figur 2D ), så vel som mengder av GTP-bundet RhoA (figur 2E) og aktiviteten av RhoA kinase (figur 2E) var høyere i MDR + HT29-dx og HMM-celler enn MDR-HT29-celler.
ZA behandlings avskaffet forskjellene mellom MDR og MDR + celler. Ved inhibering av FPP og GGPP-syntese (figur 2B), redusert ZA mengdene av membranbundet Ras og RhoA (figur 2C), intracellulær Ras-GTP og RhoA-GTP innholdet, og aktiviteten av deres nedstrøms signalveier (figur 2D-E ). Disse effektene var mer tydelig i MDR + HT29-DX og HMM celler enn MDR-HT29 celler i henhold til deres Mev pathway aktivitet.
ZA avtar Pgp uttrykk ved å redusere HIF-1α aktivering via Ras /ERK1 /2- og RhoA /Rho-A kinase downregulation
HIF-1α, en mester regulator av flere gener inkludert
MDR1 product: [29], kan bli konstitutivt aktivert selv under normoksisk betingelser ved serin fosforylering av RhoA kinase [30 ] og MAP-kinaser [31]. Fosforylerte (pHIF-1α) og ikke-fosforylerte HIF-1α var upåviselig ved Western blot i MDR-HT29-celler, mens både pHIF-1α og HIF-1α ble uttrykt i MDR + HT29-dx og HMM-celler (Figur 3A). HIF-1α var transkripsjonelt aktive i MDR + celler, som vist med vesentlig høyere mengder av kjernefysisk HIF-1 bundet til dets spesifikke DNA-targetsekvens (figur 3B). ZA hadde ingen effekt på MDR-celler, mens den reduserte mengden av pHIF-1α og senket totale HIF-1α nivåer og aktivitet i MDR + celler (figur 3A-B).
A. Påvisning av fosforylert (pHIF-1α) og total HIF-1α i MDR-HT29, og MDR + HT29-DX og HMM celler etter 48 timers inkubasjon uten (CTRL) eller med en mikromol /L ZA (ZA). B. HIF-1 aktivitet var høyere (* p 0,001) i MDR + HT29-DX og HMM celler enn HT29 celler. Etter ZA behandling (som rapportert i A), en betydelig reduksjon av HIF-1 aktivitet ble observert i HT29-dx (° p 0,001) og HMM celler (
◊p 0,001). C. Chromatin immunoprecipitation av HIF-1α på
MDR1
promoter i MDR og MDR + celler, behandlet som rapportert i en.
pro MDR1
: PCR produkt fra immunoutfelt prøver.
Input
: PCR produkt fra ikke immunoutfelt prøver (genomisk DNA).
ingen Ab
: Prøvene inkuberes i fravær av anti-HIF-1α antistoff. «-«: Blank. D. Western blotting påvisning av Pgp i celler behandlet som beskrevet i AE Intracellulær doksorubicin ble målt spektrofluorimetrisk: betydelig lavere konsentrasjoner ble påvist i HT29-dx og HMM
vs
HT29 celler (* p 0,002), betydelig høyere konsentrasjoner i ZA-behandlede celler
vs
ubehandlede (CTRL) kolleger (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:
◊p 0,02). Resultatene vist i panel A, C og D er representative for 3 forsøk. For paneler B og E stolpene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.
HIF-1α ble konstitutivt bundet til Hypoksi Response Element av
MDR1
promoter i MDR + celler HT29-dx og HMM-celler, men ikke i MDR-HT29 celler (figur 3C). Dette forklarer hvorfor det uttrykk for Pgp protein var bare påvises i MDR + celler (Figur 3D) og hvorfor disse cellene viste signifikant lavere Dox oppbevaring enn MDR-celler (Figur 3E).
ZA behandling effektivt avskaffet HIF-1α -binding til
MDR1
promoter (figur 3C) og Pgp uttrykk (figur 3D), og betydelig økte intracellulære Dox nivåer i MDR + HT29-DX og HMM celler som ble sammenlignes med de som ble observert i MDR-HT29 celler ( Figur 3E). Intracellulær Dox oppbevaring i MDR + celler var signifikant økt når ZA ble administrert før Dox, men verken
vice versa
, og heller ikke når de to legemidlene ble brukt sammen (figur S1).
For å gi ytterligere bevis at ZA-induserte Pgp ned-regulering i MDR + -celler var avhengig av pHIF-1α undertrykkelse via ERK1 /2 og RhoA kinase inhibering, side-ved-side-eksperimenter ble utført i nærvær av spesifikke inhibitorer av ERK1 /2-kinaser (PD98059) , RhoA kinase (Y27632) og HIF-1 (YC-1). I MDR + HMM celler viste disse hemmere de samme effektene av ZA i form av pHIF-1α nivåer (Figur 4A), HIF-1 transkripsjonen aktivitet (figur 4B), Pgp uttrykk (figur 4C), og Dox oppbevaring (figur 4D).
A. Fosfo (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) og total HIF-1α ekspresjon i HMM-celler forblir ubehandlet (CTRL) eller behandlet i 24 timer ved 10 umol /L med den ERK1 /2 kinase inhibitor PD98059 (PD), RhoA kinase inhibitor Y27632 (Y27), HIF-1α inhibitor YC-1 (YC), og 1 pmol /l ZA i 48 timer. GAPDH data er vist å bekrefte ekvivalenter per kjørefelt protein lasting. B. HIF-1 aktivitet i HMM celler forblir ubehandlet (CTRL) eller behandlet som rapportert i panel A. Alle forskjeller mellom behandlede
vs
ubehandlede celler er statistisk signifikant (* p 0,01).
