Abstract
mikroRNA-30c (MIR-30c) er rapportert å være en tumor suppressor i livmorkreft (EF). Vi viser at Mir-30c er nedregulert i EC vev og er sterkt uttrykt i østrogenreseptor (ER) -negative HEC-1-B-celler. MiR-30c hemmer direkte MTA-en uttrykk og fungerer som en tumor suppressor via Mir-30c-MTA-en signalveien. Videre er MIR-30c ble redusert ved E
2 behandling i både ER-positiv Ishikawa og ER-negativ HEC-1-B-celler. Til sammen våre resultater tyder på at MIR-30c er en viktig deregulert miRNA i EF og kan tjene som en potensiell biomarkør og romanen terapeutisk mål for EC
Citation. Kong X, Xu X, Yan Y, Guo F Li J, Hu Y, et al. (2014) Østrogen Regulerer Tumor lyddemper miRNA-30c og målet Gene, MTA-en, i livmorkreft. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10,1371 /journal.pone.0090810
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 27 august 2013; Godkjent: 04.02.2014; Publisert: 03.03.2014
Copyright: © 2014 Kong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Six talent Summit Prosjekt i Jiangsu-provinsen Personell byrå (VSV-021). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EF) er den hyppigste ondartet svulst i kvinnelige kjønnsorgan over hele verden. Livmorkreft består av to forskjellige patogenetiske subtyper. Type I svulster er lav grad av østrogen-relaterte endometrioid kreft (EØF) som vanligvis utvikler fra komplekse og atypiske endometrial hyperplasia i peri-menopausal kvinner. I motsetning til type II svulster er aggressive non-endometrioid kreft (NEEC) som ikke er relatert til østrogen stimulering og som utvikler seg fra atrofisk endometrium av eldre kvinner. Forskjellene mellom de to EF-undertyper fører til ulik behandling og prognoser [1].
Viktigheten av microRNAs (mirnas), en type av det ikke-kodende RNA, er demonstrert i kreft. Gener som koder for pattedyr mirnas blir først transkribert som primære mirnas (pri-mirnas), som behandles av de enzymatiske komplekser drosha og dicer å bli forløperen mirnas (pre-mirnas) og modne mirnas [2]. De modne mirnas er omtrent 22-nukleotid lange, enkelt-trådede RNA-molekyler som regulerer ekspresjonen av deres målgener ved unøyaktig komplementering til de 3′-utranslaterte regioner (UTR), 5′-UTR, og selv om sekvenser av mRNA å undertrykke oversettelse i dyr [2] – [5]. Østrogen (E
2) og østrogenreseptoren (ER) er blitt vist å modulere mirnas som MIR-125a [6] og MIR-429 [7] i mus livmor, miRNA-20a og miRNA-21 i normal endometriet kjertel epitelceller [8], La-7 familie, MIR-27a, miR320 og MIR-424 [9] i EC-celler, MIR-104 [10], MIR-7 [11], Mir-21 [12], Mir 30C og MIR-103 [13] i brystkreftceller, MIR-135b i kolorektal celler [14] og MIR-203 i vaskulære glatte muskelceller [15]. Til sammen tyder disse resultatene på at E
2 og ER spille viktige roller i miRNA regulering.
Nylig har dereguleringen av MIR-30c blitt rapportert ikke bare å være relevant for tumorigenesis og progresjon av mange kreftformer, som EC [16], [17], eggstokk-kreft [18], [19], brystkreft [20] – [23], lungecancer [24], klar nyrecellekarsinom [25], magekreft [26], blærekreft [27] og neuroblastom [28], men også til å oppvise potensielle diagnostiske og prognostiske implikasjoner, så vel som å representere et potensielt terapeutisk mål for kjemo- og radiotherapies for kreft [18], [29], [ ,,,0],30]. Foreløpig metastaseassosierte gen-en (MTA-en) [17], KRAS [20], DLL4 [31], TWF1, vimentin [21], BCL9 [19], REDD1 [32], PAI-1 [33] og CTGF [34] har blitt identifisert som mål for MIR-30c, og SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] er potensielle mål som gjenstår å få den godkjent. Fordi MIR-30c viser en relativ nedgang i uttrykk fra normal endometrium til atypisk hyperplasi til kreft, og fordi rollen av MIR-30c i EU er fortsatt ukjent, gjennomførte vi en undersøkelse av rollen MIR-30c i EF. Våre tidligere undersøkelser har funnet at MIR-30c mål MTA-en, som er sterkt uttrykt i EU [37] og fungerer som tumor-suppressor i EC-cellelinjer [17]. Men de nøyaktige rollene MIR-30c og MTA-en i EF er uklare. Derfor gjennomførte vi denne utvidede studien.
I denne studien har vi evaluert uttrykk for MIR-30c i EF vev og ulike EU-cellelinjer, nærmere undersøkt forholdet mellom MIR-30c og MTA-en, validert tumor suppressor funksjon av MIR-30c og utforsket regulering av MIR-30c i EF-cellelinjer. Derfor søkte vi å finne svulsten undertrykkelse funksjon av MIR-30c, som ville definere sin potensielle verdi som en roman terapeutisk mål for behandling av EF.
Materialer og Metoder
Pasienter og vev prøvene
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Trommetårnet i Nanjing Hospital Affiliated til Nanjing University. Forsøkspersonene ble rekruttert fra pasienter ved avdelingen for obstetrikk og gynekologi, Trommetårnet Hospital, Nanjing University Medical School i Nanjing, Kina. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle deltakerne i studien. Alle prøver ble samlet inn med pasientens informerte samtykke og bekreftet av patologisk undersøkelse. Alle pasientene led type I EF og ingen av dem mottok preoperative behandling, slik som strålebehandling eller kjemoterapi. 21 primær EF kreft vevsprøver ble hentet fra EF-pasienter, og 14 normale endometrial vevsprøver ble oppnådd fra kvinner som gjennomgikk hysterektomier (laparoskopisk eller mage) for behandling av andre sykdommer som myom eller livmor prolaps.
EC cellelinjer og behandlinger
Menneske EC Ishikawa celler ble vennlig levert av professor LHWei (Peking University Folkets sykehus, Kina), og HEC-1-B ble kjøpt fra Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kina). De Ishikawa-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco, USA), og de HEC-1-B-celler ble dyrket i McCoys 5A medium (Gibco, USA), som begge ble supplert med 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco). Cellene ble holdt i en 5% CO
2 fuktet atmosfære ved 37 ° C. For å bestemme reguleringen av E
2, ble cellene behandlet med 17β-østradiol (E
2, 10
-8 M og 10
-10 M, Sigma, USA) for 6, 12, 24 og 48 timer i 6-brønns plater. Ishikawa og HEC-1-B-celler ble ko-behandlet med ER-antagonist Fulvestrant (ICI 182 780, 10
-8 M, Sigma, USA) og 10
-8 M eller 10
-10 ME
2 for 24 og 48 timer, henholdsvis.
Cell transfeksjon
De etterligner (miR10000244) og inhibitor (miR20000244) av MIR-30c, liten interfering RNA av MTA-en (Si- MTA-en, si-h-MTA1_001) og deres respektive krafse oligonukleotider, etterligner-sc (miR01101), inhibitor-sc (miR02101), SIR-sc (siN05815122147), ble utformet og syntetisert av Guangzhou RiboBio (Guangzhou, Kina). Alle oligonukleotider ble transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine
TM 2000 (Invitrogen, USA) i antibiotika-fritt Opti-MEM-medium (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM. For de cotransfections, ble 25 nM av hver oligonukleotid brukt. Total RNA og proteiner ble ekstrahert ved 48 timer etter transfeksjon for videre analyse. Ikke-transfekterte Ishikawa-celler i kulturmediet ble også fremstilt for å tjene som simulerte kontroller.
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA fra vev og celler ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, USA). Stammen-sløyfe RT primer av MIR-30c, primere ifølge MIR-30c, U6 og MTA-en for QRT-PCR er beskrevet i vårt tidligere studium [17]. GAPDH, pri-MIR-30c, og pre-MIR-30c primere ble utformet som følger: GAPDH frem primer: TGAACGGGAAGCTCACTGG, GAPDH reverse primer: TCCACCACCCTGTTGCTGTA; pri-MIR-30c frem primer: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, pre-MIR-30c frem primer: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, og pri-MIR-30c /pre-MIR-30c reverse primer: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. cDNA ble syntetisert fra total RNA ved revers transkripsjon bruke PrimeScript ™ RT reagent Kit (Takara, Dalian, Kina). Deretter ble QRT-PCR utføres ved hjelp av SYBR PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens protokoll. De relative uttrykk nivåer av MIR-30c og MTA-en ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCt analysemetode; nivåene av GAPDH og U6 ble brukt som intern kontroll for MTA-en og MIR-30c, pri-MIR-30c, pre-MIR-30c.
Western Blot
Celler ble høstet og lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lyseringsbuffer (Sigma, USA) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Proteinkonsentrasjonene av de totale cellelysatene ble målt ved hjelp av Micro-BCA proteinanalysesett (Pierce Bioteknologi Inc, Rockford, USA). En like stor mengde (50 ug) til hver celle lysat ble løst ved elektroforese i 10% SDS-polyakrylamid-geler (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA), som ble blokkert i TBST med 10% ikke-fett, tørrmelk. Membranene ble probet med et primært antistoff mot MTA-en (1:500, Abcam, Cambridge, UK) og en sekundær pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert antistoff (1:5000, BioWorld Technology, USA). Proteinene av interesse ble deretter påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens (ECL) blotting deteksjonssystem (Millipore, Billerica, Massachusetts). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Den relative intensitet av de mål båndene ble analysert ved anvendelse av Mengde One.
celleproliferasjonsanalyse
Celleformering ble analysert ved anvendelse av en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler ble sådd ut i 96-brønns plater (5 x 10
3 celler /brønn) direkte eller ved 24 timer etter transfeksjon og inkubert i 24, 48, 72 og 96 timer henholdsvis. Etter inkubasjon med 25 ul av MTT (5 mg /ml, Sigma, USA) ved 37 ° C i 4 timer, ble supernatantene fjernet, og 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma, USA) ble tilsatt til hver brønn. Absorbansverdien (OD) av hver brønn ble målt ved 490 nm. For hver eksperimentell tilstand, ble 6 brønner anvendt, og eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.
Cell migrering og invasjon assay
Cellemigrering ble målt ved anvendelse av et sårhelende analysen. De transfekterte celler ble sådd inn i 6-brønners plater og dyrket til konfluens. Sår ble gjort ved hjelp av en p10 pipettespissen, og cellene ble vasket med PBS for å fjerne rusk og frigjorte celler. Cellene ble deretter inkubert i serum-fritt medium i ytterligere 24 eller 48 timer. De enkelte hull ble observert og fotografert ved å bruke et invertert mikroskop på 0, 24 og 48 timer ved den samme posisjon av såret.
Cell invasjons analyser ble utført i 24-brønners, Matrigel-belagte invasjons kamre. Ved 48 timer etter transfeksjon, 2 x 10
4-celler i 0,2 ml serum-fritt DMEM ble tilsatt til de øvre kamre (8-um, Millipore), som ble belagt med 30 ul matrigel (BD Bioscience, San Jose , CA), og 0,6 ml 10% FBS-DMEM ble tilsatt som den kjemotiltrekkende til det nedre kammer. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer, hvoretter, ble de ikke-invaderende celler som fjernes med bomullspinner. De invaderer celler ble farget med 0,1% krystallfiolett. Cellene ble telt i 5 tilfeldige høyeffekts feltene × 200 forstørrelse per brønn. Forsøket ble utført i tre eksemplarer.
Statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 19,0 programvare (SPSS, Chicago, USA). Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD. T-test ble anvendt for å sammenligne verdiene av test- og kontrollprøver. Forskjeller mellom behandlingsgruppene ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av enveis ANOVA. Den statistiske signifikansnivå ble utpekt som P . 0,05
Resultater
Uttrykk av MiR-30c og MTA-en i EF prøver og cellelinjer
MiR-30c ble rapportert å oppvise forholdsvis redusert ekspresjon fra normal til endometrial hyperplasi atypisk til kreft [16], og til å fungere som en tumor suppressor i EC-cellelinjer [17]. Imidlertid har ingen andre studier vist at Mir-30c spiller en rolle i EF. Derfor må vi først undersøkte den relative uttrykk for MIR-30c blant vevsprøver i denne studien. Vår QRT-PCR-analyser viste at Mir-30c er betydelig redusert i EF-prøvene (figur 1A.), Noe som tyder på at MIR-30c spiller en rolle i forekomsten av EF.
(A). MiR-30c ble redusert i 21 EF-prøvene sammenlignet med 14 NE prøver, som angitt ved QRT-PCR-analyse. Hver prøve ble evaluert i tre eksemplarer. (B). MiR-30c ble sterkt uttrykt i HEC-1-B-celler sammenlignet med Ishikawa-celler, som angitt ved QRT-PCR-analyse. (C) og (D). Ekspresjonen av MTA-en ble redusert i HEC-1-B-celler, sammenlignet med Ishikawa-celler på mRNA (C) og protein (D) nivåer. Hver søyle representerer middelverdier ± SD fra tre uavhengige forsøk. (* P 0,05, ** P 0,01).
Vi har evaluert neste uttrykket av MIR-30c i ulike cellelinjer. ER-positive Ishikawa-celler og ER-negativ HEC-1-B-celler representerer modeller av type I og type II EC, respektivt. Våre QRT-PCR-analyse viste at MIR-30c er sterkt uttrykt i HEC-1-B-celler sammenlignet med Ishikawa-celler, ved 1,79 ganger (figur 1B.), Noe som tyder på at ekspresjon av MIR-30c korrelerer med ER eller E
2. Neste, vi vurdert nivåene av MTA-en uttrykk i ulike cellelinjer og funnet ut at det er sterkt uttrykt i Ishikawa celler både mRNA og proteinnivåer (fig 1c og 1d). Til sammen våre resultater indikerer en negativ korrelasjon mellom MIR-30c og MTA-en, i tråd med vår tidligere konklusjon at Mir-30c rettet MTA-en.
Variasjon av MIR-30c uttrykk modulerer uttrykk for sitt mål gen, MTA-en, i EC-celler
Vi har tidligere demonstrert at MIR-30c er rettet mot MTA-1 mRNA-transkripter i Ishikawa og HEC-1-B-cellelinjer ved hjelp av et luciferase reporter-analyse. Å grundig belyse forholdet mellom MIR-30c og MTA-en, brukte vi MIR-30c-ligner og MIR-30c-inhibitor å gjenreise og redusere uttrykket av MIR-30c, henholdsvis. I tillegg brukte vi SIR-MTA-en til knockdown MTA-en i Ishikawa celler.
uttrykk for MIR-30c i Ishikawa celler var oppregulert ved 23.14-fold og nedregulert ved 0.043 ganger ved transfeksjon med Mir-30c-ligner og MIR-30c-hemmer, henholdsvis (figur 2A). Ved tilstrekkelig transfeksjon effektivitet, fant vi at MTA-en ekspresjon ble betydelig redusert når MIR-30c ble restaurert og at reduksjon av MIR-30c oppregulert MTA-en uttrykk (Fig 2B).
(A) . Transfeksjonseffektiviteten av Ishikawa celler ble evaluert ved QRT-PCR etter 48 timer etter transfeksjon av MIR-30c-ligner og MIR-30c-inhibitor, er vist som brette endringer i forhold til deres egge kontroller. (B). MTA-en protein uttrykk ble undersøkt ved western blot analyse etter 48 timer etter transfeksjon med Mir-30c-etterligner, MIR-30c-inhibitor og deres egge kontroller. (C). Kotransfeksjon med MIR-30c inhibitor, Sir-MTA-en og deres egge kontrollene ble utført, og MTA-en protein uttrykk ble undersøkt ved western blot analyse. (D og E). SiR-MTA-en reduserer MTA-1-ekspresjon på mRNA-(D) og protein (E) nivåer ved 48 timer etter transfeksjon. (F). QRT-PCR analyse viser en økning i MIR-30c uttrykk etter MTA-en uttrykk ble hemmet. Hver søyle representerer middelverdier ± SD fra tre uavhengige forsøk. (* P 0,05, ** P 0,01).
I kotransfeksjon eksperimenter, fant vi at Mir-30c inhibitor og Sir-MTA-en spilt en antagonistisk måte i MTA-en regulering (Fig 2C). Sammen med den observasjon at Sir-MTA-en suppresseed uttrykk for MTA-en på både mRNA og proteinnivåer (Fig 2D og 2E), tror vi at Mir-30c gjør faktisk negativt regulert MTA-en. Interessant, undertrykkelse av MTA-en uttrykk av Sir-MTA-en førte til økt uttrykk av MIR-30c (fig 2 F).
Til sammen fikk vi bekreftet at Mir-30c direkte undertrykt MTA-en uttrykket og at en feedback-loop er tilstede mellom dem. Selv om flere studier er nødvendig for å utforske den konkrete mekanismen bak sine tilbakemeldinger-loop regulering, disse resultatene støttet tanken om at Mir-30c kan fungere ved å hemme MTA-en i EF.
MiR-30c regulerer celleproliferasjon, migrasjon og invasjonen i EF
Som vår tidligere studie har vist, ektopisk uttrykk for MIR-30c kan hemme EC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon [17]. Her har vi gitt ytterligere bevis for å bekrefte disse effektene i Ishikawa celler. Ektopisk uttrykk for MIR-30c hemmet celleproliferasjon i en MTT analyse. Levedyktigheten av transfekterte ble undertrykt (figur 3A) og relativ celleformering ble redusert ved 72 og 96 timer etter transfeksjon (figur 3B). I forhold til migrasjon og invasjon, utførte vi en sårtilheling og en transwell analysen. Transfeksjon av MIR-30c-etterligner redusert migrering og invasjon, sammenlignet med den etterligner-sc, som vist i figur 3C og 3D. På den annen side ble evnene til celle-proliferasjon, migrering og invasjon forbedret etter cellene ble transfektert med MIR-30c-inhibitor (figur 3A -3D).
(A). En MTT-analysen viser at Mir-30c ligner trykkes celleviabilitet (øvre), mens MIR-30c inhibitor fremmet celleviabilitet (lavere). (B). MiR-30c-ligner reduserer relativ celleproliferasjon (øvre), mens MIR-30c-inhibitor øker relativ celleproliferasjon (lavere), henholdsvis 72 og 96 timer etter transfeksjon. (C). Representative fotografier av det sårhelende analyse som viser den vandrende evnen til de transfekterte celler på 0, 24 og 48 timer etter at såret. (D). Representative fotografier av celle invasjon i en transwell analysen. Det gjennomsnittlige antallet celler ble tellet fra 5 tilfeldige mikroskopiske felt (x 200). Verdiene som vises er gjennomsnittsverdiene ± SD av relativ celle invasjon. (* P 0,05, ** P 0,01).
Dermed variable uttrykk for MIR-30c fremkalte forskjellige virkninger på de ondartede egenskapene til Ishikawa celler. Vi tror at Mir-30c fungerer som en tumor suppressor ved å påvirke spredning, migrasjon og invasjon av EC-celler.
MiR-30c fungerer som en tumor suppressor via Mir-30c-MTA-en signalveien
Vi har tidligere bestemt at MIR-30c mål MTA-en, som blir overuttrykt i EC [37], og som virker som et onkogen i mange humane tumorer [38], [39]. Imidlertid er funksjonen av MTA-1 i EC forble udefinert. Derfor har vi undersøkt om MIR-30c funksjoner via MIR-30c-MTA-en signalveien. Undertrykkelse av MTA-en av SIR-MTA-1 inhiberte proliferasjon av Ishikawa-celler, som vist ved våre MTT-resultatene (figur 4A). Videre tap av MTA-en også redusert cellemigrering og invasjon, som antydet med vår sårheling og resultater Transwell assay (fig 4B og 4C). Disse funnene viste at MTA-en spiller en pro-tumorigen rolle i EC-celler ved å regulere spredning, migrasjon og invasjon av Ishikawa celler. Fordi MIR-30c kan direkte undertrykke uttrykket av MTA-en, og fordi MTA-en er et onkogen i EU, tror vi at Mir-30c fungerer som en tumor suppressor ved å målrette MTA-en.
(A ). En MTT analysen viser celleviabilitet (til venstre) og relativ celleproliferasjon (til høyre) ble undertrykt av transfeksjon av Sir-MTA-en på 72 og 96 timer. (B). Representative fotografier av det sårhelende analysen viser den vandrende evnen til de transfekterte celler på 0, 24 og 48 timer etter såret. (C). Representative fotografier av celle invasjon i en transwell analysen. Det gjennomsnittlige antallet celler ble tellet fra 5 tilfeldige mikroskopiske felt (x 200). Verdiene som vises er gjennomsnittsverdiene ± SD av relativ celle invasjon. (D) og (E). Kotransfeksjon av MIR-30c-hemmer og Sir-MTA-en; kotransfeksjon av MIR-30c-hemmer og Sir-sc fungerte som kontroll. (D). Sammenlignet med kontrollgruppen transfeksjon, celle-levedyktighet (øvre) og relativ celleformering (lavere) ble undertrykt ved 96 timer. (E). Representative fotografier av celle invasjon i en transwell analysen. Det gjennomsnittlige antallet celler ble tellet fra 5 tilfeldige mikroskopiske felt (x 200). Verdiene som vises er gjennomsnittsverdiene ± SD av relativ celle invasjon. Forskjellene i relativ celleformering mellom gruppene først etter 96 timer etter transfeksjon. (* P 0,05, ** P 0,01).
For å utvide vår studie, kotransfektert vi MIR-30c-hemmer og Sir-MTA-en inn i Ishikawa celler og funnet at reduksjonen av MTA -1 svekket celleproliferasjon og invasjon mediert av MIR-30c-inhibitor sammenlignet med kontroll-transfekterte gruppe (fig 4D og 4E). Våre resultater tyder på at Mir-30c funksjonen avhenger av MTA-en og validert eksistensen av MIR-30c-MTA-en signalveien.
Østrogen nedregulerer uttrykk for MIR-30c i EC-celler
Etter å ha demonstrert svulsten undertrykkende evne MIR-30c, vi neste undersøkt regulering av MIR-30c. Forskjellen i MIR-30c uttrykk mellom ER-positive Ishikawa celler og ER-negative HEC-1-B-celler antyder at E
2 og ER kan spille en viktig rolle i reguleringen av MIR-30c. Dermed har vi undersøkt om MIR-30c uttrykk endringer på E
2 behandling.
Sammenlignet med blank kontroll, uttrykket av MIR-30c var markert nedregulert i et tids- og doseavhengig måte på 6, 12, 24 og 48 h ved 10
-8 M og 10
-10 ME
2 behandling av ER-positiv Ishikawa-celler (figur 5A). Endringene i MIR-30c uttrykk indusert av E
2 behandling ble delvis reversert av cotreatment med ICI182780 i Ishikawa celler (figur 5B). I tillegg til E
2 behandling-indusert undertrykkelse av MIR-30c, pri-MIR-30c og pre-MIR-30c ble også nedregulert (Fig 5C), noe som tyder på at E
2-ER kan hemme transkripsjon av MIR-30c i Ishikawa cellene.
(A). MiR-30c ble redusert ved behandling med 10
-8 M og 10
-10 M E
2 ved 6, 12, 24 og 48 timer etter behandling ved QRT-PCR-analyse i Ishikawa-celler. Behandlingen med 10
-8 M E
2 utøves en mer signifikant inhibering unntatt på 48 timer. (B). 10
-8 M ICI182780 delvis reversert reduksjon av MIR-30c nivåer indusert av behandling med 10
-8 M og 10
-10 M E
2 på 24 timer etter cotreatment i Ishikawa celler. (C). Pre-MIR-30c ble redusert med E
2 behandling både i Ishikawa og HEC-1-B-celler (øvre). Pri-MIR-30c ble redusert med E
2 behandling i Ishikawa, men ikke i HEC-1-B-celler (lavere). (D). MiR-30c-nivåene ble redusert ved 10
-8 M og 10
-10 ME
2 behandling ved 6, 12, 24 og 48 timer etter behandling ved QRT-PCR-analyse i HEC-1-B-celler . Virkningen av de to konsentrasjoner skilte seg etter 12 timer etter behandling. (E). 10
-8 M ICI182780 ikke reversere reduksjon av MIR-30c nivåer indusert av behandling med 10
-8 M og 10
-10 ME
2 på 48 timer etter cotreatment i HEC-en -B-celler. (F). Behandling med 10
-8 ME
2 oppregulert mRNA uttrykk for MTA-en i både Ishikawa celler og HEC-1 celler på henholdsvis 24 og 48 timer, en effekt som ble reversert av cotreatment med 10
-8 M ICI182780 i Ishikawa-celler (øvre), men ikke de HEC-1-B-celler ((lavere) (* P. 0,05, ** P. 0,01)
men fant vi at E
2 også redusert MIR-30c uttrykk nivåer i ER-negativ HEC-1-B-celler (figur 5D). det var expectable at hemming av MIR-30c uttrykk ved E
2 behandling var ikke er blokkert av ICI182780 i HEC-1-B-celler (figur 5E). Forskjellig fra Ishikawa celler, E
2 bare redusert uttrykk for pre-MIR-30c, men ikke pri-MIR-30c i HEC-1-B-celler (fig 5C), noe som tyder på at E
2 bør hemme modningen av MIR-30c i en ER-uavhengig måte.
i tillegg E
2 oppregulert uttrykk for MTA-en mRNA i både Ishikawa og HEC-1-B-celler, en effekt som ble reversert av ICI182780 i Ishikawa celler bare på utvalgte konsentrasjon og tid (figur 5F). Dette kan tilskrives enten reduksjon av MIR-30c indusert ved behandling med E
2 eller en annen som foreløpig uidentifisert signalveien.
Til sammen våre funn tyder på at E
2 representerer en regulerende faktor for ekspresjon av MIR-30c, som fungerer både ER-avhengige og uavhengige ER-oppførsel. Men den nøyaktige underliggende molekylære mekanismen som E
2 regulerer uttrykket av MIR-30c krever videre detaljstudier.
Diskusjoner
Dereguleringen av miRNAs i kreft kan fremme angiogenese, vekst fordel, vev invasjon og metastasering. Men vår forståelse av avvikende uttrykk og potensielle roller mirnas i kreft fortsatt begrenset. MiR-30c, et medlem av den mir-30-familien, har vist seg å bli nedregulert i EC i mikromatriseanalyse [16] og i brystkreft [23] sammenlignet med normalt vev, men oppregulert i ovarialkreft, sammenlignet med benign eller border ovarietumorer [18] og i mesothelioma celler [29]. MiR-30c kan også tjene som en potensiell biomarkør på grunn av sin deregulering i forskjellige subtyper og ondartede stadier av tumorer inkludert brystkreft [21], eggstokk-kreft [18] og mesothelioma [28], [29]. Videre er økt uttrykk av MIR-30c korrelerer med gunstig prognose og klinisk effekt av behandling med tamoksifen ved brystkreft [22] samt lengre progresjonsfri overlevelse i klarcellet nyrekreft [25], men lavere overlevelse i ondartet mesothelioma [29] og kjemoterapeutisk motstand i lungekreft [24]. Spesielt i forhold til rollen som MIR-30c i kjemoterapeutiske motstand i eggstokkreft, Eitan et al. og Sorrentino et al. har gjort kontrasterende konklusjoner [40], [41]. Den kontroversielle funn vedrørende MIR-30c bekrefte sin viktige rolle i tumorgenesen og progresjon, uavhengig av sin presise tumorigen eller svulst undertrykkende naturen.
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle MIR-30c i EC videre. Vi fant at MIR-30c ble nedregulert i EC-prøvene sammenlignet med normale prøver, som antydet ved QRT-PCR-analyse, i samsvar med den foregående microarray analyse ved Boren et al [16]. Dessverre, vi har ikke nok saker til verdsdereguleringen av MIR-30c uttrykk mellom ulike subtyper og clinicopathological funksjoner. Våre fremtidige studier tar sikte på å belyse dette spørsmålet. Likevel fant vi at Mir-30c uttrykk var høyere i en ER-negativ cellelinje, noe som tyder på at MIR-30c kan korrelere med E
2 og ER, samt med spesifikke undergrupper av EF.
For å utvide vår forrige undersøkelse, vi grundig undersøkt forholdet mellom MIR-30c og MTA-en. Tidligere utførte vi en Luciferase reporter analyse som viste 3′-UTR av MTA-en målrettet av MIR-30c. Videre viste vi at over-ekspresjon av MIR-30c redusert MTA-1-ekspresjon på mRNA og proteinnivåene i både Ishikawa og HEC-1-B-celler [17]. Her har vi ikke bare gjenopprettet, men også redusert uttrykk av MIR-30c og vurdert de resulterende endringer i MTA-en. Vi brukte Ishikawa celler bare i denne studien fordi MIR-30c fungerte den samme i de to cellelinjer i vår forrige undersøkelse. Resultatene av denne studien er i samsvar med de av våre tidligere studie, og vi fant også at Sir-MTA-1 og MIR-30c hemmer arbeidet i en antagonistisk måte. Som vi bekreftet direkte undertrykkelse av MTA-en av Sir-MTA-en, var vi i stand til å utlede en funksjonell sammenheng mellom MIR-30c og MTA-en. Bemerkelsesverdig, vi også identifisert en feedback-loop der undertrykkelse av MTA-en økte nivåer av MIR-30c, en selvforsterkende effekt som også skjedde med MIR-145 og målet genet, OCT4 [42]. MiR-30c ble tidligere rapportert å spille en undertrykkelse rolle i tumorcellevekst, metastase og legemiddelresistens ved å målrette BCL9 [19], TWF1, vimentin [21] og KRAS [20]. I denne studien fikk vi bekreftet at Mir-30c-MTA-en signalveien representerer en funksjonell mekanisme som MIR-30c undertrykker EC. Men Mirs vanligvis arbeider i reguleringen av flere mål, og vi kunne ikke fortelle at det er ingen andre signalveien arbeider etter MIR-30c i EF.
Foreløpig regulering av miRNAs er et tema som har fått økende oppmerksomhet. Onconase [43], lysofosfatidisk syre (LPA) [19], og den EGF og MET-reseptorer [24] er blitt rapportert til å modulere ekspresjon av MIR-30c. Vurderer differensial uttrykk for MIR-30c mellom ER-positive og ER-negativ EC cellelinjer som brukes i vår studie og forholdet mellom EU og E
2, valgte vi å undersøke E
2 som kandidat regulator av MIR-30c uttrykk.
i EC, MIR-206 [44] og Let-7 familie av miRNAs [9] korrelerer med E
2 og eR enten ved å målrette ERα eller ved å være utsatt for modulasjon av E
2. Modulering av mirnas ved E
2-ER er blitt definitivt vist [45]. Yamagata et al [6] indikerte at ERα, ikke ERβ, som hemmet modningen av miRNAs ved å hindre at pri-miRNA-til-pre-miRNA konvertering. Dette samspillet skjer på en posttranskripsjonelt nivå gjennom deres tilknytning drosha og p68 /P72, som kan aktiveres ved E
2. Imidlertid, selv i fravær av E
2, en fysisk assosiasjon mellom ERα og drosha vedvarer, eventuelt står for undertrykkelse av MIR-30c i Ishikawa-celler sammenlignet med HEC-1-B-celler som vi observert i denne studere. Et annet nylig studie antydet at ERα trykkes MIR-140 ekspresjonen på transkripsjonsnivået ved å binde seg til en spesifikk promoter element (-79 /-50) av MIR-140 [10]. Bortsett ERα, ERβ [14] og dicer [13] Det ble også rapportert å være relevant i forhold til E
2 i reguleringen av miRNAs. Ikke desto mindre ble alle disse resultatene utledet fra bryst MCF-7-celler. Derfor foreslår vi at videre mekanistiske studier i EC-celler er ønsket.
Vår studie viste at E
2 negativt regulert MIR-30c og induserte sitt mål genet, MTA-en, i EC-celler, en regulatorisk effekt som også ble vist ved MIR-140 og dets målgen, SOX2, i brystkreftceller [10]. Induksjon av MTA-en med E
2 i EC-celler kan tilskrives en nedgang i MIR-30c eller til direkte stimulering av E
2, som begge krever videre studier.
I kontrast, har en studie vist at MIR-30c er oppregulert ved E
2 i eR-positiv brystkreft MCF-7cells [13], som viser de ulike regulerende mekanismer som E
2 regulerer MIR-30c i ulike kreftceller.
