Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft (CAP) er den nest største årsaken til kreftdød i amerikanske menn. Androgen deprivasjon terapi er opprinnelig effektive i Cap behandling, men Cap gjentar tross kastrat nivåer av sirkulerende androgen. Fortsatt uttrykk for androgen reseptor (AR) og dets ligander har vært knyttet til kastrering-tilbakevendende cap vekst.
Principal Finne
I denne rapporten liganden avhengige dominant-negative ARΔ142-337 (ARΔTR) ble uttrykt i kastrerings-tilbakevendende CWR-R1 celle- og tumormodeller for å belyse rollen AR signalering. Ekspresjon av ARΔTR redusert CWR-R1 tumorvekst i nærvær og fravær av eksogen testosteron (T) og forbedret overlevelse i nærvær av eksogent T. Det var bevis for negativ seleksjon av transgene ARΔTR i T-behandlede mus. Massespektrometri avslørt kastrering-tilbakevendende Cap dihydrotestosteron (DHT) nivåer tilstrekkelig for å aktivere AR og ARΔTR. I fravær av eksogene testosteron, CWR-R1-ARΔTR og kontrollceller utstilt endrede androgen profiler som impliserte epitelceller Cap celler som en kilde til intratumorale AR ligander.
Konklusjon
Studiet gir
in vivo
bevis på at aktivering av AR signalering av intratumorale AR ligander er nødvendig for kastrering-tilbakevendende selskaper vekst og at epitelceller Cap celler produsere tilstrekkelige aktive androgener for Cap tilbakefall i løpet androgen deprivasjon terapi. Målrette intracrine T og DHT syntese bør gi en mekanisme for å hemme AR og vekst av kastrering-tilbakevendende cap
Citation. Titus MA, Zeithaml B, Kantor B, Li X, Haack K, Moore DT, et al. (2012) Dominant-Negativ androgen Receptor Hemming av Intracrine Androgen-avhengig vekst av Kastrering-Tilbakevendende prostatakreft. PLoS ONE 7 (1): e30192. doi: 10,1371 /journal.pone.0030192
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 14 september 2011; Godkjent: 15 desember 2011; Publisert: 17 januar 2012
Copyright: © 2012 Titus et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av PO1-CA77739 og 2RO1 DK058702-10 fra National Cancer Institute og National Cancer Institute Cancer Center tilskudd CA016156 og CA034026 til Roswell Park Cancer Institute og University of North Carolina, henholdsvis US Public Health service Grants HD16910 fra National Institute of Child Health and human Development, National Institutes of Health (NIH), og det amerikanske forsvarsdepartementet Prostate Cancer Research Program W81XWH-10-1-0273. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er den vanligste ikke-hudkreft diagnostisert i amerikanske menn. Til tross for tidligere oppdagelse og bedre behandling, er mer enn 33.000 dødsfall forventet i 2011 [1]. I flere tiår har androgen deprivasjon terapi vært den foretrukne behandling for lokalavansert eller metastatisk cap. Androgen deprivasjon terapi er effektiv i utgangspunktet, men remisjoner er midlertidige. Cap som går igjen svarer dårlig på de fleste behandlinger og nesten alle mennesker bukke under for sykdommen. En molekylær rolle for androgen reseptor (AR) i overgangen til kastrering-tilbakevendende Cap er støttet av den kontinuerlige uttrykk for AR [2] – [4] og androgen-regulerte gener [5]
Mange mekanismer. bidra til AR trans tross kastrat nivåer av sirkulerende testikkel androgener (gjennomgått av Feldman [6]). Imidlertid har andre studier, inkludert vår egen vist at kastrering-tilbakevendende cap opprettholder vev nivåer av dihydrotestosteron (DHT) tilstrekkelig til å aktivere AR [4], [7] – [9]. Vedvarende vev testosteron (T) og DHT i løpet av androgen deprivasjon kan stamme fra adrenal androgener, så som dehydroepiandrosteron (DHEA) og androstendion [7], fra androstanediol gjennom bakdør banen til DHT syntese [10], [11] og /eller
de novo
produksjon fra kolesterol [12]. I kastrering-tilbakevendende cap, induserer AR androgen-avhengige uttrykk for prostataspesifikt antigen og trans protease, serin 2-v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog, TMPRSS2:ERG [13]. En fersk rapport viser at 70% av menn med kastrering-tilbakevendende cap svart på abirateronacetat, en cytokrom P450 17α-hydroksylase /lyase (CYP17A1) androgen-inhibitor. Den antitumor aktivitet av abirateronacetat i kliniske studier tyder på at hemming av cytokrom P450 17α-hydroksylase /lyase (CYP17A1) reduseres ligand-aktiverte AR signalisering i kastrering-tilbakevendende cap [14].
CWR-R1 celler som brukes i studien stammer fra kastrering-tilbakevendende CWR22 xenograft [15], uttrykke AR-H874Y mutant [16] og sprer i en androgen-belastede miljø. AR består av en NH
2-terminale trans domene, en sentral DNA-bindende domene og et karboksyl-terminalt ligand-bindende domene (LBD) [17]. AR er full-lengde i CWR-R1 celler avledet fra CWR22 human prostatakreft xenograft, men er utsatt for proteolytisk degradering under utvinning til en stor ~80 kDa formen [18]. AR transkripsjonen aktivitet formidles ved aktivering funksjoner i NH
2-terminal og LBD. En unik egenskap av AR er at T eller DHT indusere en NH
2 og karboksyl-terminal (N /C) interaksjon [19] mediert av NH
2-terminal FXXLF motiv [20] som bremser ligand dissosiasjon og AR degradering. En rolle av NH
2-terminale domene i genregulering [21] – [24] er også blitt rapportert for ikke-genomisk AR signalering [25]
I den foreliggende undersøkelse, CWR-R1. celler ble konstruert ved bruk av lentivirus til overuttrykker den humane AR med en delesjon av NH
2-terminale aktiverings rester 142-337 som resulterer i et transkripsjonelt inaktiv dominant negativ AR. Den humane AR-delesjonsmutant ARΔ142-337 (ARΔTR) binder ligand med høy affinitet, men er transkripsjonelt inaktiv i fravær eller nærvær av androgen [26]. Mekanismen for dominant negativ aktivitet er heterodimerisering med endogen AR for å forhindre transaktivering av målgener [27]. Resultatene tyder på at intratumoral T og DHT syntese induserer dominant negativ ARΔTR hemning AR avhengig CWR-R1 tumorvekst. Androgen profilen til ΔTR-transduced CWR-R1 svulster i fravær av T støtter hypotesen om at epitelceller Cap celler produserer AR ligander i en musemodell med lav til undetectable adrenal androgen.
Resultater
ARΔTR hemmer AR trans og CWR-R1 celleproliferasjon
effekten av intracrine androgen syntese og ARΔTR hemming av endogen AR og kastrering-tilbakevendende cap vekst ble bestemt i CWR-R1 celler avledet fra kastrering-tilbakevendende CWR22 menneskelig Cap xenograft. CWR-R1-celler transdusert med lentivirus uttrykker ARΔTR eller LacZ under kontroll av CMV-promoteren utviste høy ekspresjon (Fig. 1). Effekten av ARΔTR inhibering av AR transkripsjonen aktivitet ble bestemt ved bruk av MMTV-Luc transfektert inn i lentivirus-transduserte CWR-R1-celler i fravær og nærvær av 0,1 nM DHT fordi prostata-spesifikt antigen-luciferase reporter-genet er bare svakt aktivert ved endogen AR [10], [21], [28]. Tilsetning av 0,1 nM DHT LacZ-transduserte CWR-R1-celler økte luciferase-aktivitet ved 3 ganger (fig. 2). Under samme vilkår, luciferase aktivitet i ARΔTR-omsatte CWR-R1 celler var lav, med eller uten 0,1 nM DHT, et androgen konsentrasjon som maksimalt stimulerer androgen-regulerte gener i CWR-R1 celler [29]. Resultatene viser en dominant negativ virkning av ARΔTR på endogen AR transaktivering av MMTV-luc i fravær og nærvær av DHT.
Western blot-analyse av CWR-R1 proteinlysatene (20 ug) demonstrerte at endogent AR (M
r 110 kDa, baner 1-2) er påvist i både ARΔTR og LacZ omformet CWR-R1 celler ved hjelp av AR geitepolyklonalt antistoff. LacZ (M
r 60,5 kDa, kjørefelt 1) er uttrykk kun observert i LacZ-omsatte CWR-R1 celler ved hjelp av LacZ kanin polyklonale antistoff og ARΔTR (M
r 84 kDa, kjørefelt 2) uttrykk er oppdaget ved hjelp av AR geit polyklonale antistoff i ARΔTR-omsatte CWR-R1 celler. Endogen β-actin ble påvist ved anvendelse av β-actin AC-15 monoklonalt antistoff fra mus (M
r 43 kDa, felt 1 og 2) og tjente som lastekontroll for både ARΔTR og LacZ-transduserte CWR-R1-celler.
CWR-R1-celler ble transient transfektert med MMTV-luciferase reporter og analysert med hensyn på luciferase-aktivitet i nærvær og fravær av DHT. I nærvær av 0,1 nM DHT, CWR-R1 celler som uttrykker transgenet LacZ viste en økning i MMTV-luciferase reporter-aktivitet sammenlignet med kontrollceller uten DHT. Ekspresjon av ARΔTR redusert MMTV-luciferase reporter-aktivitet i fravær eller nærvær av 0,1 nM DHT i forhold til LacZ-transduserte kontrollceller. Kolonner representerer gjennomsnitts luciferase aktivitet i relative lysenheter fra 3 uavhengige eksperimenter; barer ± standardavvik.
Hemming av endogen AR trans av ARΔTR i fravær av tilsatt DHT hevet muligheten for at endogene AR ligander indusert ARΔTR dimerization [30] og heterodimerisering mellom ARΔTR og full-lengde endogen AR [31]. Væskekromatografi tandem massespektrometri-analyse viste 3,38 ± 0,26 fmol T /million celler (n = 4) og 1,84 ± 0,16 fmol DHT /million celler (n = 4) (fig. 3). Siden AR dimerisering og DNA-bindings er androgen-avhengig [30], og resultatene antydet at ARΔTR inhiberende aktivitet kan tjene som et surrogat indikator for intracellulære aktive androgener.
DHT ble målt i CWR-R1-celler dyrket uten media kosttilskudd eller eksogene T ved hjelp av væskekromatografi tandem massespektrometri. Representant kromatogram av DHT (venstre panel, DHT topp på 7,26 min) ved å bruke 10 millioner CWR-R1 celler (n = 4). Gjennomsnittlig konsentrasjon av DHT var 1,84 ± 0,16 fmol /million CWR-R1 celler. Kontroll kalibrator kromatogram av DHT standard viser topp på 7,29 min (høyre panel).
Effekten av ARΔTR på androgen-avhengige Nkx3.1 genekspresjon [32] ble vurdert ytterligere å karakterisere hemmende aktivitet ARΔTR på AR signalering. Tilsetning av DHT redusert Nkx3.1 proteinnivåene i ARΔTR-transduserte CWR-R1-celler (fig. 4), men økte Nkx3.1 protein i LacZ-transduserte CWR-R1 kontrollceller. Tilsetning av DHT øket CWR-R1-LacZ celleproliferasjon, men det var ingen økning i ARΔTR-transduserte CWR-R1 celleproliferasjon. I fravær av tilsatte DHT, både LacZ- og ARΔTR-omsatte CWR-R1 celler viste minimal spredning (Fig. 5).
immunoblotanalyse av CWR-R1 celleproteinlysatene (20 mikrogram) bestemmes Nkx3.1 proteinekspresjon ved bruk av geit polyklonalt antistoff i nærvær eller fravær av 1,0 nM DHT. Nkx3.1 (M
r 35.5 kDa) protein ble øket i LacZ-transduserte CWR-R1-celler med tilsetning av DHT (kolonnene 1 og 2). ARΔTR-transduced CWR-R1 cellene utviste redusert Nkx3.1 protein uttrykk i nærvær av DHT (kolonnene 3 og 4). Endogen β-aktin (M
r 43 kDa) ble brukt som lastekontroll (baner 1-4).
Celleproliferering ble fastsatt ved hjelp XTT
R-analyse og overvåking av absorbans ved 490 /690 nm i triplikat fra dag 1 til dag 8 (gjennomsnitt ± standardavvik). CWR-R1 celler som uttrykker ARΔTR (solid diamant og svart linje) eller LacZ (fast firkantet og grå linje) transgenet i fravær på 0,1 nM DHT viste lignende vekstkurver (øvre panel). I nærvær av 0,1 nM DHT, ARΔTR-omformet CWR-R1 cellevekst ble redusert i forhold til LacZ-omsatte kontroll CWR-R1 celler (nedre panel).
ARΔTR hemmer CWR-R1 tumorvekst
LacZ eller ARΔTR-transduced celler ble injisert i hårløse mus for å generere CWR-R1 svulster å vurdere effekten av ARΔTR på tumorvekst og endogen AR signalering. Tumor vekstrater ble endret av ARΔTR uttrykk. En streng blandet modellering statistisk analyse som vurderes individuelt tumor volum baner viste signifikante forskjeller mellom de 4 gruppene (Fig. 6). Veksttakten av LacZ kontroller skilte med eksogen T (p = 0,04) (fig. 6A og 6B), som indikerte ulike kontroller var nødvendig for de to ARΔTR eksperimentelle grupper. ARΔTR reduserte tumorvekstrate sammenlignet med kontroller, en effekt som var lik uten (p = 0,01), eller med eksogene T (p = 0,0004) (fig. 6C og 6D). Resultatene var lignende når tumorvekst ble vurdert ved hjelp av to ekstra parametere. LacZ og LacZ + T kontroller varierte på bakgrunn av skråningen (p = 0,01) og dobling tid (p = 0,02), som bekreftet behovet for ulike kontroller for hver ARΔTR forsøksgruppe. T kosttilskudd for å optimalisere ARΔTR funksjon redusert tumorvekst sammenlignet med kontroller av skråningen (p = 0,004) og dobling tid (p = 0,0007). Uten T kosttilskudd, tumorvekst skråning (p = 0,07) og dobling tid (p = 0,37) var lik. Inspeksjon av de individuelle tumor baner og selve tumorvolumer antydet at effekten av ARΔTR var en kombinasjon av bremse hastigheten av vekst og forsinke utviklingen av tumorveksten, og at denne effekten forekom oftere når eksogene T er anordnet for å forsterke effekten av ARΔTR (fig. 6E).
Svulster ble målt ved hjelp av digitale calipers og volum beregnet fra dag 14 til dag 160 etter CWR-R1 celle inokulasjon. Tumorvolumer, LacZ (A, n = 22), LacZ + T (B, n 21 =), ARΔTR (C, n = 21) eller ARΔTR + T (D, n = 21), er vist fra dag 21 når veksten begynte ved dag 96 over hvilken bare en mus i hver gruppe forble. Blandet modellering statistisk analyse viste en statistisk signifikant forskjell mellom de 4 gruppene. ARΔTR-transduserte CWR-R1 tumorvekstrater ble redusert i forhold til LacZ styrer i fravær (p = 0,01, panel A vs. C) eller nærvær (p = 0,0004, panel C vs. D) fra T. (E) Forutsagt midlere CWR-R1 tumorvolumer (cm
3) ble plottet mot tiden for første tumor avling for LacZ + T (åpne firkanter), LacZ (åpne diamanter), ARΔTR + T (skraverte sirkler) og ARΔTR (åpne sirkler) grupper . ARΔTR-uttrykke CWR-R1 svulster (sirkler) viser redusert vekstrater i forhold til LacZ-omsatte CWR-R1 kontrollceller.
ARΔTR-induserte endringer i tumorvekst også påvirket tidspunktet for aktiv dødshjelp bestemmes av tumorstørrelse som overstiger 1,5 cm
3 (fig 7, Kaplan-Meier plott,. Tabell 1, log rank analyse, p = 0,009). 95% konfidensintervall for gjennomsnittet tid til aktiv dødshjelp i dager og området for hver gruppe var LacZ (71, 68-84 dager), LacZ + T (63, 57-68 dager), ARΔTR (75, 68-89 dager) og ARΔTR + T (89, 68-105 dager). ARΔTR økte tiden for å være vert for median eutanasi med 36% i nærvær av eksogene T, men hadde liten effekt uten eksogent T. Median tid til avlivning økt med 5% i fravær av eksogent T, en forskjell som ikke var statistisk signifikant.
dag for aktiv dødshjelp var basert på 1,5 cm
3 tumorstørrelse for mus i LacZ + T (stiplet linje, n = 21), LacZ (stiplet linje, n = 22), ARΔTR (heltrukket linje, n = 21) eller ARΔTR + T (stiplet linje, n = 21) grupper. Median overlevelse tid skilte seg i grupper som fikk eksogene T (stiplet vs. stiplet linje, p = 0,008), men ikke i grupper uten T (heltrukken linje vs. stiplet linje, p = 0,34).
Negativ utvalg av ARΔTR i CWR-R1 svulster
den ligner tid til aktiv dødshjelp basert på tumorstørrelse mellom CWR-R1-ARΔTR og LacZ mus i fravær av androgen antydet at ARΔTR celler velg mot ARΔTR uttrykk . For å teste dette, ble det ARΔTR og LacZ vektorkopiantall og protein uttrykk bestemt i CWR-R1 svulster. ARΔTR eller LacZ vektor kopiantall og protein uttrykk ble bestemt i transduced CWR-R1 celler før vaksinasjon og på tidspunktet for svulst innhøsting. ARΔTR eller LacZ vektor kopiantall per celle målt i CWR-R1-transduserte celler før inokulering basert på PCR-amplifikasjon av Woodchuck hepatitt virus post-transkripsjonell regulator element var 5,46 og 4,53, respektivt. Mean (± standardavvik) vektor eksemplar nummer per celle for ARΔTR og LacZ-omsatte CWR-R1 svulster på tidspunktet for høsting var 0,49 ± 0,58 for ARΔTR + T og 2,58 ± 1,68 for ARΔTR (p = 0,001), og 3,10 ± 1,77 for LacZ + T og 3,48 ± 1,45 for LacZ (p = 0,4) (fig. 8).
Vector kopiantall per celle ble bestemt ved hjelp av kvantitativ PCR av Woodchuck hepatitt virus post-transkripsjonell regulator element. Den gjennomsnittlige enhetsvektorkopitall pr celle er 0,49 ± 0,58 for ARΔTR + T, 2,58 ± 1,68 for ARΔTR, 3,10 ± 1,77 for LacZ + T og 3,48 ± 1,45 for LacZ tumorer. En statistisk signifikant reduksjon i vektorkopiantallet per celle ble observert for ARΔTR + T vs ARΔTR svulster (p = 0,001), men ikke LacZ + T vs. LacZ (p = 0,4) svulster.
For å karakter ytterligere effekten av ARΔTR på vektor kopitall, forhold mellom vektor kopiantall per celle i CWR-R1-celler ble beregnet på tidspunktet for tumor innhøsting og på det tidspunkt før CWR-R1 celle inokulering for ARΔTR og LacZ tumorer i nærvær og fraværet av T. Statistisk analyse av median vektor kopitall pr tumorcelleforhold for ARΔTR og LacZ uttrykkende vektorer viste at ARΔTR ekspresjonsvektoren kassett ble valgt for (p = 0,006, fig. 9A). Et lignende resultat ble oppnådd statistisk i median vektoren kopiantallet pr tumorcelle-forholdet for ARΔTR og LacZ uttrykke vektorer i nærvær av T (p 0,0001, figur 9B.). Samlet sett ARΔTR-omformet CWR-R1 celler i nærvær eller fravær av eksogent T valgt mot ARΔTR vektor i forhold til LacZ vektor kontroller.
Forholdet til (A) ARΔTR og LacZ, og (B) ARΔTR + T og LacZ + T ble beregnet ved hjelp av vektorkopitallet målt ved tidspunktet for tumor produksjonen i forhold til vektoren kopitallet målt før inokulering. Individuell svulst vektor eksemplar nummer per celle andel fra hver årsklasse er representert ved hjelp av åpne sirkler. Median-vektoren kopitall-forholdet (fast sirkel) ble bestemt i ARΔTR (0,43), LacZ (0,64), ARΔTR + T (0,05), og LacZ + T (0,6) tumorer. Den ARΔTR transgenet ble valgt mot i fravær (p = 0,006) og nærvær (p 0,0001) av eksogene T i forhold til LacZ styrer
endret median ARΔTR og LacZ vektor eksemplar nummer per tumorcelle. forholdstall foreslåtte redusert ARΔTR protein uttrykk i forhold til LacZ kontroller. Høstet CWR-R1 svulster med tilstrekkelige mengder vev (79 svulster) for analyse av endogent AR og uttrykte ARΔTR eller LacZ protein ble analysert på immunoblotter. Uttrykk av endogen AR og ARΔTR protein ble demonstrert i pTK989-ARΔTR omformet CWR-R1 celler før subkutan inokulering. ARΔTR-transdusert CWR-R1 tumorer i nærvær av T (fig. 10A), uttrykt endogene AR i alle 22 CWR-R1-ARΔTR + T-tumorer, selv om AR-protein var lav til upåviselig i 3 prøver (prøver 21-23). I motsetning til dette, ARΔTR protein var neglisjerbar eller fraværende i alle CWR-R1-ARΔTR tumorer i nærvær av T-tilskudd.
Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av protein lysatet isolert fra CWR-R1 tumorer som er samlet på tidspunktet for tumor innhøsting. CWR-R1 svulst uttrykk for endogen AR (M
r 110 kDa), og omformet ARΔTR (ARΔ142-337, M
r 84 kDa) og LacZ (M
r 60,5 kDa) protein ble evaluert. (A) immunoblot av AR og ARΔTR i nærvær av T (tumor tall 2-23) eller (b) fravær av T (tumor tall 24-29, 31-35, 38, 39, 43 og 44). (C) immunoblotter av LacZ (M
r 60,5 kDa) protein med T (tumor tall 47-68) eller uten T (tumor tall 69-91) og i tomme vektorkontroll (tumor tall 92-95). LacZ ble uttrykt i alle unntatt én av 42 CWR-R1 svulster. LacZ-protein uttrykt i pTK1027 transdusert CWR-R1-celler før subkutan inokulering i mus ble benyttet for kontroll. HEK-293T celler ble brukt som negativ kontroll og laststyring for LacZ immunoblotter var glukose 6-fosfat dehydrogenase (GADPH, M
r 36 kDa).
I fravær av supplerende T, AR protein vedvart i 10 av 15 CWR-R1-ARΔTR tumorer (kreft tall 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 39, 43 og 44), og endogene AR ble ikke påvist i 5 svulster som også gjorde ikke uttrykke ARΔTR (eksempler 24-27 og 33) (fig. 10B). CWR-R1-ARΔTR svulster 32 og 35 uten T supplement uttrykt AR men ikke ARΔTR. ARΔTR ble ko-uttrykt i 8 CWR-R1 tumorer (tumor tallene 28, 29, 31, 34, 38, 39, 43 og 44).
I motsetning til dette ble LacZ-protein uttrykt i alle tumorer, bortsett fra tumor 72 i fravær og nærvær av T (fig. 10C). Tomme vektor kontroll CWR-R1 svulster med T (prøver 92 og 93) og uten T (prøvene 94 og 95) og 293T celler uttrykte ikke LacZ eller ARΔTR protein. Den konsekvente uttrykk for LacZ protein samsvarer med vektorkopiantall beregnes i LacZ-omsatte svulster.
Resultatene tyder på negativ seleksjon av ARΔTR er ikke begrenset til CWR-R1-ARΔTR svulster formert i mus med supplerende T. I ARΔTR -transduced svulster uten supplerende T, ARΔTR utvalget var mindre muligens på grunn av lavt serum T og /eller endret intracrine T biosyntese.
Intracrine syntese av aktive androgener i kastrering-tilbakevendende cap
fraværet av CYP17A1 i mus binyrer [33] gir en modell for å teste om kastrering-tilbakevendende Cap produserer intracrine androgener. Generering av de CWR-R1-ARΔTR svulster gitt en mulighet til å undersøke en effekt av AR signalering på intracrine aktiv androgen biosyntese. Den tilsvarende CWR-R1-ARΔTR tumorvekst, tumor-doblingstider og bakker med og uten T, og målinger av DHT i CWR-R1-celler antydet at CWR-R1 tumorer produsert aktive androgener i fravær av sirkulerende T.
For å identifisere mulige forskjeller i androgen profiler mellom CWR-R1-ARΔTR og LacZ svulster, T, ble DHT, androstendion og androsterone målt ved hjelp av væskekromatografi tandem massespektrometri. Vevsnivåer av 0,32 nM DHT (p = 0,59) og 0,05 nM androsteron (p = 0,23), målt ved tidspunktet for tumor høsting var lik i ARΔTR og LacZ-transduserte tumorer (tabell 2) og tilstrekkelig til å aktivere endogene AR og ARΔTR (se
in vitro
resultater, fig. 2). Videre 3,25 nM T i LacZ tumorer var lik T nivåer i kastrering-tilbakevendende netting [4], [9] som var tilstrekkelig til å aktivere endogen AR-H874Y [29]. Men i CWR-R1-ARΔTR svulster, T nivåene var ~4 ganger mindre enn LacZ svulster, som foreslo endring i T biosyntese av dominerende negative AR. Redusert T biosyntesen i ARΔTR-omsatte CWR-R1 svulster korrelerte med opphopning av ~ 1 nM androstendion, en androgen forløper til T. I motsetning CWR-R1-lacZ svulster inneholdt 1,05 nM androstendion. Kvantifisering av 5a-reduserte og umettet androgen forløpere i ARΔTR og LacZ-omsatte CWR-R1 svulster foreslått intracrine androgen biosyntesen bidratt til AR-avhengige kastrering-tilbakevendende cap vekst.
Diskusjoner
studier i denne rapporten var basert på premisset om at en dominerende negativ form for AR med en sletting av NH
2-terminal transdomene krever androgen for dimerization [30] og hemming av transkripsjonen aktivitet av full-lengde AR [27] . Vi har vist at stabil ekspresjon av dominant negativ ARΔTR hemmer endogen AR-H874Y transkripsjonen aktivitet og bremser eller forsinker CWR-R1 tumorvekst i fravær og nærvær av supplerende T. Dominant negative ARΔTR aktivitet ble også indikert ved reduksjon i Nkx3.1 protein og luciferase reporter aktivitet i nærvær av DHT.
Resultatene fra studien har avdekket ytterligere to viktige funn. For det første var i det vesentlige 100% negativ seleksjon mot den dominerende negative form av AR i løpet av kastrasjon-tilbakevendende CWR-R1 tumorvekst i nærvær av supplerende T. Dette i kontrast nesten 100% retensjon av LacZ-genet kontroll. Begge dominant negativ ARΔTR og LacZ ble integrert i genomet ved hjelp av lentivirus ekspresjon og celleseleksjon før celle inokulering og tumor vekst. For det andre, omtrent 50% utelukkelse av dominant negativ AR skjedde i CWR-R1-ARΔTR tumorer formert i fravær av supplerende T. Disse resultatene, sammen med massespektrometri målinger av T og DHT i dyrkede CWR-R1-celler, gir bevis for intracrine syntese av aktive androgener som trengs for AR signalering i Cap. Selektiv tap av en dominant negativ AR demonstrerer den genetiske allsidigheten til kastrering-tilbakevendende cap celler for å maksimere AR signalering.
Intracrine syntese av androgen i kastrering-tilbakevendende cap
Hemming av luciferase aktivitet i CWR- R1 celler ved dominant negativ ARΔTR i fravær av eksogent t foreslått intracellulær syntese av T. Dette ble støttet ved massespektrometri målinger av T og DHT i CWR-R1-celler. Våre funn er i samsvar med tidligere bevis på at androgen-sultet LNCaP celler syntetisere androgener fra
14C-acetat merket kolesterol [34]. Cap celler endre cholesterol metabolisme og behandling for å støtte androgen biosyntese [35]. Intracrine biosyntesen av androstendion, DHEA og T ble også demonstrert i CWR-R1 og PC-3 celler, og innblandet CYP17A1 aktivitet i AR positive og negative Cap celler [36]. I kliniske prøver, kolesterol og androgen biosyntetiske enzymer ble oppregulert i kastrering-tilbakevendende cap [12], [37], [38].
I de CWR-R1-lacZ svulster, intratumorale T og DHT nivåer var tilstrekkelig til å aktivere AR-H874Y og fremme tumorvekst. Intratumorale DHT nivåer i ARΔTR og LacZ-omsatte svulster var like. Men i ARΔTR-omsatte CWR-R1 xenografttumorer, T nivåene var lavere og Androstenedione nivåene var høyere enn CWR-R1-lacZ svulster. Lavere T nivåer i CWR-R1-ARΔTR tumor antydet at dominant negativ ARΔTR valgt mot celler som uttrykker aldo-keto-reduktase 1C3, et enzym som reduserer androstendion til T i kastrering-tilbakevendende cap, eller øket oksydasjon av T til androstendion av NAD
+ avhengig 17β-hydroxysteroid dehydrogenase-10-aktivitet [39]. Redusert konvertering av androstendion til T ville skifte den intracellulære ligand profilen mot aktivering av mutant AR-H874Y fra villtype LBD AR i ARΔTR. Intracrine metabolismen av kolesterol til aktive androgener kan forklare den opprinnelige følsomheten kastrering-tilbakevendende cap til behandling med abirateronacetat [14].
AR-H874Y endogen å CWR-R1 cellene beholder høy affinitet T og DHT bindende lik villtype-AR. Imidlertid stabiliserer H874Y mutasjonen LBD kjernestrukturen, slik at T er like effektiv som DHT i å fremme transkripsjonen aktivitet [29]. Strukturen stabiliserende effekter av H874Y er tilstrekkelig til å overvinne de skadelige virkninger av tap av funksjonsmutasjoner som forårsaker androgen ufølsomhet [40]. Det tilsvarer styrken på T og DHT med AR-H874Y antyder at intracrine syntese av T ville fremme LacZ-omformet CWR-R1 tumorvekst. Intracellulær omdannelse av androstendion til T kan ha en betydelig virkning på transkripsjonen AR-H874Y i forhold til villtype-AR [29]. Økt uttrykk for P160 steroidreseptorer coactivators i kastrering-tilbakevendende cap [41], [42] bidro til hypersensitization.
T:DHT forholdstall i LacZ- og ARΔTR-omsatte CWR-R1 svulster var lik de i kastrering-tilbakevendende cap [4], [9], [43]. Tidligere studier med kliniske prøver, viste minsket 5α-reduktase-2 isozym mRNA [44] og protein [45] ekspresjon i kastrering-tilbakevendende lokk som var delvis på grunn av tap av utskilt stromal celle faktor signalering [44], [46]. CWR-R1 svulster også kan ha redusert 5α-reduktase-2 aktivitet. De tilsvarende DHT-nivåer i LacZ og ARΔTR tumorer indikerer at DHT-biosyntese er avhengig av androstendion i stedet for T, ettersom androstendion er et bedre substrat for 5α-reduktase-1 enn T [47]. Skiftet mot konvertering av androstendion til androstandion [45] av 5α-reduktase-en og videre metabolisme til DHT av membranbundne NADPH avhengig 17β-hydroksysteroiddehydrogenase-15 [48] kan forklare hvorfor menn med kastrering-tilbakevendende cap og høye baseline Androstenedione nivåer levd lenger ved behandling med ketokonazol [49]. DHT nivåer forblir lik, selv om de T:androstenedione forholdstall i LacZ og ARΔTR svulster ble invers. De lave og lignende DHT nivåer (-10
-11) målt i LacZ og ARΔTR-omformet CWR-R1 svulster kan være den optimale intratumoral konsentrasjon for CWR-R1 celleproliferasjon [42] og AR-H874Y koordinert DNA replikasjon lisensiering [ ,,,0],50].
Negativ utvalg for å forbedre AR aktivitet
den veksthemmende effekten av ARΔTR ble komplisert av det faktum at ARΔTR transgenet ble negativt valgt mot under CWR-R1 tumorvekst mest effektivt i tilstedeværelsen av supplerende T. Expression av ARΔTR transgenet ble tapt i alle de 22 ARΔTR + T svulster etter den tid for innhøsting, mens ARΔTR transgenet ble beholdt i -50% av svulster i fravær av supplerende T. bety tumorvolum var større enn ARΔTR + T-tumorer, som kan være forbundet med en delvis overgang fra T til androstendion biosyntese av disse tumorene. Selv om tidspunktet for negativ seleksjon mot ARΔTR transgenet ikke ble grundig testet, foreløpige studier antydet tap av transgenet skjedde cirka 10 dager etter tumorcelle inokulasjon på dag 23.
Negativ utvalg av ARΔTR transgenet ble støttet av redusert genom vektor kopiantall i både ARΔTR og LacZ-transduserte CWR-R1 svulster i fravær eller nærvær av eksogent T. Tap av transgen ekspresjon er vist å forekomme 10 til 15 dager etter lentivirale transdusert embryonale karsinom-celler [51]. Forsinkelsen i ARΔTR + T tumorvekst støttet seleksjon mot transgenet etter 10 dager i CWR-R1 modellen. Det kan argumenteres for at tap av transgenet resulterte fra vektor flukt fra vekslande og /eller utryddelse hendelser. På den annen side ble tilfeldig gen eller kromosom sletting og transgenet lyddemping [51] støttes ikke, så det var nesten fullstendig oppbevaring av kontrollen LacZ transgenet i CWR-R1 svulster.
Nyere studier har vist at CWR -R1-celler, så vel som de paren CWR22 netting xenotransplantater, inneholder replikasjonskompetente retrovirus som er identiske med den xenotropisk murine leukemia relatert virus (XMRV) funnet i humane Cap-celler [52], [53]. XMRV utvikles ved rekombinasjon mellom to endogene retrovirus i nakne mus som bærer CWR22 xenotransplantater [52], [53].
